Steekwondletselmodel van het volwassen optische tectum met behulp van zebravissen en medaka voor de vergelijkende analyse van regeneratieve capaciteit
Summary
Een mechanisch hersenletselmodel bij de volwassen zebravis wordt beschreven om de moleculaire mechanismen te onderzoeken die hun hoge regeneratieve capaciteit reguleren. De methode legt uit om een steekwondletsel te creëren in het optische tectum van meerdere soorten kleine vissen om de regeneratieve reacties te evalueren met behulp van fluorescerende immunostaining.
Abstract
Terwijl zebravissen een superieur vermogen hebben om hun centrale zenuwstelsel (CZS) te regenereren, heeft medaka een lager CZS-regeneratief vermogen. Een hersenletselmodel werd ontwikkeld in het volwassen optische tectum van zebravissen en medaka en vergelijkende histologische en moleculaire analyses werden uitgevoerd om de moleculaire mechanismen op te helderen die de hoge regeneratieve capaciteit van dit weefsel bij deze vissoorten reguleren. Hier wordt een steekwondletselmodel gepresenteerd voor het volwassen optische tectum met behulp van een naald en histologische analyses voor proliferatie en differentiatie van de neurale stamcellen (NSC’s). Een naald werd handmatig ingebracht in het centrale gebied van het optische tectum, en vervolgens werden de vissen intracardiaal doordrenkt en hun hersenen werden ontleed. Deze weefsels werden vervolgens gecryosectie en geëvalueerd met behulp van immunostaining tegen de juiste NSC-proliferatie- en differentiatiemarkers. Dit tectumletselmodel biedt robuuste en reproduceerbare resultaten in zowel zebravissen als medaka, waardoor NSC-responsen na letsel kunnen worden vergeleken. Deze methode is beschikbaar voor kleine teleosts, waaronder zebravissen, medaka en Afrikaanse killivissen, en stelt ons in staat om hun regeneratieve capaciteit te vergelijken en unieke moleculaire mechanismen te onderzoeken.
Introduction
Zebravissen (Danio rerio) hebben een verhoogd vermogen om hun centrale zenuwstelsel (CZS) te regenereren in vergelijking met andere zoogdieren 1,2,3. Onlangs, om de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan deze verhoogde regeneratieve capaciteit beter te begrijpen, zijn vergelijkende analyses van weefselregeneratie met behulp van next-generation sequencing-technologie uitgevoerd 4,5,6. De hersenstructuren bij zebravissen en tetrapoden zijn heel verschillend 7,8,9. Dit betekent dat verschillende hersenletselmodellen met behulp van kleine vissen met vergelijkbare hersenstructuren en biologische kenmerken zijn ontwikkeld om het onderzoek naar de onderliggende moleculaire mechanismen die bijdragen aan deze verhoogde regeneratieve capaciteit te vergemakkelijken.
Bovendien is medaka (Oryzias latipes) een populair proefdier met een lage capaciteit voor hart- en neuronale regeneratie10,11,12,13 in vergelijking met zebravissen. Zebravissen en medaka hebben vergelijkbare hersenstructuren en niches voor volwassen neurale stamcellen (NSC’s)14,15,16,17. Bij zebravissen en medaka omvat het optische tectum twee soorten NSC’s, neuro-epitheliale-achtige stamcellen en radiale gliacellen (RGC’s)15,18. Een steekwondletsel voor het optische tectum van volwassen zebravissen werd eerder ontwikkeld en dit model werd gebruikt om de moleculaire mechanismen te onderzoeken die de hersenregeneratie bij deze dieren reguleren 19,20,21,22,23. Dit jongvolwassen zebravis steekwond letsel model geïnduceerde regeneratieve neurogenese van RGCs 19,24,25. Dit steekwondletsel in het optische tectum is een robuuste en reproduceerbare methode 13,19,20,21,22,23,24,25. Toen hetzelfde letselmodel werd toegepast op volwassen medaka, werd de lage neurogene capaciteit van RGC’s in medaka optisch tectum onthuld via de vergelijkende analyse van RGC-proliferatie en differentiatie na letsel13.
Steekwondletselmodellen in het optische tectum zijn ook ontwikkeld in mummichog-modellen26, maar details van het tectumletsel zijn niet goed gedocumenteerd in vergelijking met telencefalisch letsel27. Het steekwondletsel in het optische tectum met behulp van zebravissen en medaka maakt het mogelijk om de differentiële cellulaire responsen en genexpressie tussen soorten met differentieel regeneratief vermogen te onderzoeken. Dit protocol beschrijft hoe een steekwondletsel in het optische tectum moet worden uitgevoerd met behulp van een injectienaald. Deze methode kan worden toegepast op kleine vissen zoals zebravissen en medaka. De processen voor monstervoorbereiding voor histologische analyse en cellulaire proliferatie- en differentiatieanalyse met behulp van fluorescerende immunohistochemie en cryosecties worden hier uitgelegd.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier wordt een reeks methoden beschreven die kunnen worden gebruikt om steekwondletsels in het optische tectum te induceren met behulp van een naald om de evaluatie van RGC-proliferatie en differentiatie na hersenletsel te vergemakkelijken. Naaldgemedieerde steekwonden zijn een eenvoudige, efficiënt geïmplementeerde methode die op veel experimentele monsters kan worden toegepast met behulp van een standaardset gereedschappen. Steekwondletselmodellen voor verschillende regio’s van het zebravisbrein zijn ontwikkeld <sup …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door JSPS KAKENHI Grant Number 18K14824 en 21K15195 en een interne subsidie van AIST, Japan.
Materials
| 10 mL syringe | TERUMO | SS-10ESZ | |
| 1M Tris-HCl (pH 9.0) | NIPPON GENE | 314-90381 | |
| 30 G needle | Dentronics | HS-2739A | |
| 4% Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution | Wako | 163-20145 | |
| Aluminum block | 115 x 80 x 37 mm (W x D x H) is enough size to freeze 6 cryomolds | ||
| Anti-BLBP | Millipore | ABN14 | 1:500 |
| Anti-BrdU | Abcam | ab1893 | 1:500 |
| Anti-HuC | Invitrogen | A21271 | 1:100 |
| Anti-PCNA | Santa Cruz Biotechnology | sc-56 | 1:200 |
| Brmodeoxyuridine | Wako | 023-15563 | |
| Confocal microscope C1 plus | Nikon | ||
| Cryomold | Sakura Finetek Japan | 4565 | 10 x 10 x 5 mm (W x D x H) |
| Cryostat | Leica | CM1960 | |
| Danio rerio WT strains RW | |||
| Extension tube | TERUMO | SF-ET3520 | |
| Fluoromount (TM) Aqueous Mounting Medium, for use with fluorescent dye-stained tissues | SIGMA-ALDRICH | F4680-25ML | |
| Forceps | DUMONT | 11252-20 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | Invitrogen | A32723 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11035 | |
| Hoechst 33342 solution | Dojindo | 23491-52-3 | |
| Hydrochloric Acid | Wako | 080-01066 | |
| Incubation Chamber for 10 slides Dark Orange | COSMO BIO CO., LTD. | 10DO | |
| MAS coat sliding glass | Matsunami glass | MAS-01 | |
| Micro cover glass | Matsunami glass | C024451 | |
| Microscopy | Nikon | SMZ745T | |
| Normal horse serum blocking solution | VECTOR LABRATORIES | S-2000-20 | |
| O.C.T Compound | Sakura Finetek Japan | 83-1824 | |
| Oryzias latipes WT strains Cab | |||
| PAP Pen Super-Liquid Blocker | DAIDO SANGYO | PAP-S | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH 7.4 | TaKaRa | T9181 | |
| Styrofoam tray | 100 x 100 x 10 mm (W x D x H) styrofoam sheet is available as tray | ||
| Sucrose | Wako | 196-00015 | 30 % (w/v) Sucrose in PBS |
| Tricaine (MS-222) | nacarai tesque | 14805-24 | |
| Trisodium Citrate Dihydrate | Wako | 191-01785 | |
| Triton X-100 | Wako | 04605-250 |
References
- Becker, T., Wullimann, M. F., Becker, C. G., Bernhardt, R. R., Schachner, M. Axonal regrowth after spinal cord transection in adult zebrafish. Journal of Comparative Neurology. 377 (4), 577-595 (1997).
- Raymond, P. A., Barthel, L. K., Bernardos, R. L., Perkowski, J. J. Molecular characterization of retinal stem cells and their niches in adult zebrafish. BMC Developmental Biology. 6, 36 (2006).
- März, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strähle, U. Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon. Developmental Dynamics. 240 (9), 2221-2231 (2011).
- Kang, J., et al. Modulation of tissue repair by regeneration enhancer elements. Nature. 532 (7598), 201-206 (2016).
- Simões, F. C., et al. Macrophages directly contribute collagen to scar formation during zebrafish heart regeneration and mouse heart repair. Nature Communications. 11 (1), 600 (2020).
- Hoang, T., et al. Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration. Science. 370 (6519), (2020).
- Alunni, A., Bally-Cuif, L. A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates. Development. 143 (5), 741-753 (2016).
- Diotel, N., Lübke, L., Strähle, U., Rastegar, S. Common and distinct features of adult neurogenesis and regeneration in the telencephalon of zebrafish and mammals. Frontiers in Neuroscience. 14, 568930 (2020).
- Labusch, M., Mancini, L., Morizet, D., Bally-Cuif, L. Conserved and divergent features of adult neurogenesis in zebrafish. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 525 (2020).
- Ito, K., et al. Differential reparative phenotypes between zebrafish and medaka after cardiac injury. Developmental Dynamics. 243 (9), 1106-1115 (2014).
- Lai, S. L., et al. Reciprocal analyses in zebrafish and medaka reveal that harnessing the immune response promotes cardiac regeneration. eLife. 6, 25605 (2017).
- Lust, K., Wittbrodt, J. Activating the regenerative potential of Müller glia cells in a regeneration-deficient retina. eLife. 7, 32319 (2018).
- Shimizu, Y., Kawasaki, T. Differential regenerative capacity of the optic tectum of adult medaka and zebrafish. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 686755 (2021).
- Adolf, B., et al. Conserved and acquired features of adult neurogenesis in the zebrafish telencephalon. Developmental Biology. 295 (1), 278-293 (2006).
- Grandel, H., Kaslin, J., Ganz, J., Wenzel, I., Brand, M. Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration and cell fate. Developmental Biology. 295 (1), 263-277 (2006).
- Alunni, A., et al. Evidence for neural stem cells in the medaka optic tectum proliferation zones. Developmental Neurobiology. 70 (10), 693-713 (2010).
- Kuroyanagi, Y., et al. Proliferation zones in adult medaka (Oryzias latipes) brain. Brain Research. 1323, 33-40 (2010).
- Ito, Y., Tanaka, H., Okamoto, H., Ohshima, T. Characterization of neural stem cells and their progeny in the adult zebrafish optic tectum. Developmental Biology. 342 (1), 26-38 (2010).
- Shimizu, Y., Ueda, Y., Ohshima, T. Wnt signaling regulates proliferation and differentiation of radial glia in regenerative processes after stab injury in the optic tectum of adult zebrafish. Glia. 66 (7), 1382-1394 (2018).
- Ueda, Y., Shimizu, Y., Shimizu, N., Ishitani, T., Ohshima, T. Involvement of sonic hedgehog and notch signaling in regenerative neurogenesis in adult zebrafish optic tectum after stab injury. Journal of Comparative Neurology. 526 (15), 2360-2372 (2018).
- Kiyooka, M., Shimizu, Y., Ohshima, T. Histone deacetylase inhibition promotes regenerative neurogenesis after stab wound injury in the adult zebrafish optic tectum. Biochemical and Biophysical Research Communications. 529 (2), 366-371 (2020).
- Shimizu, Y., Kawasaki, T. Histone acetyltransferase EP300 regulates the proliferation and differentiation of neural stem cells during adult neurogenesis and regenerative neurogenesis in the zebrafish optic tectum. Neuroscience Letters. 756, 135978 (2021).
- Shimizu, Y., Kiyooka, M., Ohshima, T. Transcriptome analyses reveal IL6/Stat3 signaling involvement in radial glia proliferation after stab wound injury in the adult zebrafish optic tectum. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 668408 (2021).
- Lindsey, B. W., et al. Midbrain tectal stem cells display diverse regenerative capacities in zebrafish. Scientific Reports. 9 (1), 4420 (2019).
- Yu, S., He, J. Stochastic cell-cycle entry and cell-state-dependent fate outputs of injury-reactivated tectal radial glia in zebrafish. eLife. 8, 48660 (2019).
- Bisese, E. C., et al. The acute transcriptome response of the midbrain/diencephalon to injury in the adult mummichog (Fundulus heteroclitus). Molecular Brain. 12 (1), 119 (2019).
- Schmidt, R., Beil, T., Strähle, U., Rastegar, S. Stab wound injury of the zebrafish adult telencephalon: a method to investigate vertebrate brain neurogenesis and regeneration. Journal of Visualized Experiments. (4), e51753 (2014).
- Westerfield, M. . The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio) 5th ed. , (2007).
- Kaslin, J., Kroehne, V., Ganz, J., Hans, S., Brand, M. Distinct roles of neuroepithelial-like and radial glia-like progenitor cells in cerebellar regeneration. Development. 144 (8), 1462-1471 (2017).
- Curado, S., et al. Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies. Developmental Dynamics. 236 (4), 1025-1035 (2007).
- Shimizu, Y., Ito, Y., Tanaka, H., Ohshima, T. Radial glial cell-specific ablation in the adult zebrafish brain. Genesis. 53 (7), 431-439 (2015).
- Godoy, R., et al. Dopaminergic neurons regenerate following chemogenetic ablation in the olfactory bulb of adult zebrafish (Danio rerio). Scientific Reports. 10 (1), 12825 (2020).
- Sawahata, M., Izumi, Y., Akaike, A., Kume, T. In vivo brain ischemia-reperfusion model induced by hypoxia-reoxygenation using zebrafish larvae. Brain Research Bulletin. 173, 45-52 (2021).
