Modelo de Lesão por Arma Branca do Adulto Óptico Utilizando Zebrafish e Medaka para Análise Comparativa da Capacidade Regenerativa
Summary
Um modelo de lesão cerebral mecânica em peixes-zebra adultos é descrito para investigar os mecanismos moleculares que regulam sua alta capacidade regenerativa. O método explica para criar uma lesão por facada no tecto óptico de várias espécies de pequenos peixes para avaliar as respostas regenerativas usando imunomarcação fluorescente.
Abstract
Enquanto o peixe-zebra tem uma capacidade superior de regenerar seu sistema nervoso central (SNC), o medaka tem uma menor capacidade regenerativa do SNC. Um modelo de lesão cerebral foi desenvolvido no tecto óptico adulto de zebrafish e medaka e análises histológicas e moleculares comparativas foram realizadas para elucidar os mecanismos moleculares que regulam a alta capacidade regenerativa deste tecido entre essas espécies de peixes. Aqui é apresentado um modelo de lesão por arma branca para o tecto óptico adulto usando agulha e análises histológicas para proliferação e diferenciação das células-tronco neurais (NSCs). Uma agulha foi inserida manualmente na região central do tecto óptico e, em seguida, os peixes foram perfundidos intracárdicos e seus cérebros dissecados. Esses tecidos foram então criossecados e avaliados por imunomarcação contra os marcadores apropriados de proliferação e diferenciação do NSC. Este modelo de lesão tectum fornece resultados robustos e reprodutíveis tanto em zebrafish quanto em medaka, permitindo comparar as respostas do NSC após a lesão. Este método está disponível para pequenos teleósteos, incluindo zebrafish, medaka e killifish africano, e nos permite comparar sua capacidade regenerativa e investigar mecanismos moleculares únicos.
Introduction
O peixe-zebra (Danio rerio) tem maior capacidade de regeneração do sistema nervoso central (SNC) quando comparado a outros mamíferos 1,2,3. Recentemente, para melhor compreender os mecanismos moleculares subjacentes a esse aumento da capacidade regenerativa, análises comparativas da regeneração tecidual utilizando tecnologia de sequenciamento de última geração têm sidorealizadas4,5,6. As estruturas cerebrais do peixe-zebra e dos tetrápodes são bastante diferentes 7,8,9. Isso significa que vários modelos de lesão cerebral usando peixes pequenos com estruturas cerebrais e características biológicas semelhantes foram desenvolvidos para facilitar a investigação dos mecanismos moleculares subjacentes que contribuem para esse aumento da capacidade regenerativa.
Além disso, o medaka (Oryzias latipes) é um animal de laboratório popular com baixa capacidade de regeneração cardíaca e neuronal10,11,12,13 em comparação com o peixe-zebra. Zebrafish e medaka têm estruturas cerebrais e nichos semelhantes para células-tronco neurais adultas (NSCs)14,15,16,17. Em zebrafish e medaka, o tecto óptico inclui dois tipos de NSCs, células-tronco neuroepiteliais e células gliais radiais (RGCs)15,18. Uma lesão por arma branca no tecto óptico de zebrafish adultos foi previamente desenvolvida, e este modelo foi usado para investigar os mecanismos moleculares que regulam a regeneração cerebral nesses animais 19,20,21,22,23. Este modelo de lesão por arma branca induziu neurogênese regenerativa a partir de CGRs 19,24,25. Esta lesão por arma branca no tecto óptico é um método robusto e reprodutível13,19,20,21,22,23,24,25. Quando o mesmo modelo de lesão foi aplicado ao medaka adulto, a baixa capacidade neurogênica dos CGRs no tecto óptico de medaka foi revelada através da análise comparativa da proliferação e diferenciação do CGR após alesão13.
Modelos de lesão por arma branca no tecto óptico também foram desenvolvidos em modelos de mummichog26, mas detalhes da lesão tectômica não foram bem documentados quando comparados com lesão telencálica27. A lesão por arma branca no tecto óptico utilizando zebrafish e medaka permite a investigação das respostas celulares diferenciais e expressão gênica entre espécies com capacidade regenerativa diferencial. Este protocolo descreve como realizar uma lesão por arma branca no tecto óptico usando uma agulha de injeção. Este método pode ser aplicado a pequenos peixes como zebrafish e medaka. Os processos de preparação de amostras para análise histológica e análise de proliferação e diferenciação celular usando imunohistoquímica fluorescente e criossecções são explicados aqui.
Protocol
Representative Results
Discussion
Descreve-se aqui um conjunto de métodos que podem ser utilizados para induzir lesões por arma branca no tecto óptico, utilizando uma agulha para facilitar a avaliação da proliferação e diferenciação do CGR após lesão cerebral. A facada mediada por agulha é um método simples e eficientemente implementado que pode ser aplicado a muitas amostras experimentais usando um conjunto padrão de ferramentas. Modelos de lesão por arma branca para várias regiões do cérebro do peixe-zebra foram desenvolvidos<sup clas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo JSPS KAKENHI Grant Number 18K14824 e 21K15195 e uma bolsa interna da AIST, Japão.
Materials
| 10 mL syringe | TERUMO | SS-10ESZ | |
| 1M Tris-HCl (pH 9.0) | NIPPON GENE | 314-90381 | |
| 30 G needle | Dentronics | HS-2739A | |
| 4% Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution | Wako | 163-20145 | |
| Aluminum block | 115 x 80 x 37 mm (W x D x H) is enough size to freeze 6 cryomolds | ||
| Anti-BLBP | Millipore | ABN14 | 1:500 |
| Anti-BrdU | Abcam | ab1893 | 1:500 |
| Anti-HuC | Invitrogen | A21271 | 1:100 |
| Anti-PCNA | Santa Cruz Biotechnology | sc-56 | 1:200 |
| Brmodeoxyuridine | Wako | 023-15563 | |
| Confocal microscope C1 plus | Nikon | ||
| Cryomold | Sakura Finetek Japan | 4565 | 10 x 10 x 5 mm (W x D x H) |
| Cryostat | Leica | CM1960 | |
| Danio rerio WT strains RW | |||
| Extension tube | TERUMO | SF-ET3520 | |
| Fluoromount (TM) Aqueous Mounting Medium, for use with fluorescent dye-stained tissues | SIGMA-ALDRICH | F4680-25ML | |
| Forceps | DUMONT | 11252-20 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | Invitrogen | A32723 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11035 | |
| Hoechst 33342 solution | Dojindo | 23491-52-3 | |
| Hydrochloric Acid | Wako | 080-01066 | |
| Incubation Chamber for 10 slides Dark Orange | COSMO BIO CO., LTD. | 10DO | |
| MAS coat sliding glass | Matsunami glass | MAS-01 | |
| Micro cover glass | Matsunami glass | C024451 | |
| Microscopy | Nikon | SMZ745T | |
| Normal horse serum blocking solution | VECTOR LABRATORIES | S-2000-20 | |
| O.C.T Compound | Sakura Finetek Japan | 83-1824 | |
| Oryzias latipes WT strains Cab | |||
| PAP Pen Super-Liquid Blocker | DAIDO SANGYO | PAP-S | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH 7.4 | TaKaRa | T9181 | |
| Styrofoam tray | 100 x 100 x 10 mm (W x D x H) styrofoam sheet is available as tray | ||
| Sucrose | Wako | 196-00015 | 30 % (w/v) Sucrose in PBS |
| Tricaine (MS-222) | nacarai tesque | 14805-24 | |
| Trisodium Citrate Dihydrate | Wako | 191-01785 | |
| Triton X-100 | Wako | 04605-250 |
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