Выделение, размножение и идентификация видов бактерий, обладающих углеводородными метаболизирующими свойствами, из водной среды обитания
Summary
Мы представляем процесс выделения, размножения и характеристики бактерий, разлагающих углеводороды, из водной среды обитания. Протокол предусматривает выделение бактерий, идентификацию методом 16S рРНК и тестирование их способности к разложению углеводородов. Эта статья поможет исследователям в характеристике микробного биоразнообразия в образцах окружающей среды и, в частности, в скрининге микробов с потенциалом биоремедиации.
Abstract
Углеводородные загрязнители не поддаются разложению, а их накопление в окружающей среде токсично для всех форм жизни. Бактерии кодируют многочисленные каталитические ферменты и естественным образом способны метаболизировать углеводороды. Ученые используют биоразнообразие водных экосистем для изоляции бактерий с потенциалом биоразложения и биоремедиации. Такие изоляты из окружающей среды обеспечивают богатый набор метаболических путей и ферментов, которые в дальнейшем могут быть использованы для масштабирования процесса разложения в промышленных масштабах. В этой статье мы опишем общий процесс выделения, размножения и идентификации видов бактерий из водной среды обитания и проверим их способность использовать углеводороды в качестве единственного источника углерода in vitro с помощью простых методов. Настоящий протокол описывает выделение различных видов бактерий и их последующую идентификацию с помощью анализа 16S рРНК. В протоколе также представлены шаги по характеристике потенциала бактериальных изолятов по разложению углеводородов. Этот протокол будет полезен исследователям, пытающимся изолировать виды бактерий из среды обитания для их биотехнологических применений.
Introduction
Углеводороды (УВ) широко используются как в качестве топлива, так и в химической промышленности. Ароматические углеводороды, такие как бензол, толуол и ксилол, широко используются в качестве растворителей1. Алкены, такие как этилен и пропилен, служат прекурсорами в синтезе полимеров полиэтилена и полипропилена соответственно. При полимеризации другого углеводорода, стирола, образуется полистирол. Антропогенная деятельность вносит углеводороды в окружающую среду при их добыче и транспортировке. Углеводородное загрязнение почвы и воды вызывает серьезные опасения для окружающей среды и здоровья человека. Микробы играют важную роль в поддержании экосистемы, регулируя биогеохимические циклы и используя широкий спектр субстратов, которые также включают загрязняющие вещества и ксенобиотики, превращая их в углерод и источник энергии. Этот процесс детоксикации загрязнителей окружающей среды микроорганизмами известен как биоремедиация 3,4,5,6,7.
Микроорганизмы, способные разлагать углеводороды, обнаружены в водных и почвенных средахобитания 8,9,10. Было идентифицировано множество бактерий, способных разлагать алканы и ароматические HC, такие как Pseudomonas, Acinetobacter, Rhodococcus, Marinobacter и Oleibacter11. Разработка технологически продвинутых подходов, не зависящих от культуры, помогла обнаружить новые микробные сообщества, разрушающие HC12. Геномный материал, непосредственно выделенный из исходных образцов, амплифицируется и секвенируется с помощью высокопроизводительных методов, таких как секвенирование нового поколения (NGS), с последующим анализом, исключающим необходимость культивирования микроорганизмов. Методы NGS, такие как метагеномный анализ, являются дорогостоящими и страдают недостатками, связанными с процессом амплификации13. Методы культивирования, такие как селективное обогащение культуры14, нацеленные на изоляцию микробов, разлагающих углеводороды, по-прежнему полезны, поскольку они позволяют исследователям исследовать и манипулировать метаболическими путями в бактериальных изолятах.
Выделение геномной ДНК и последующее секвенирование геномного материала позволяет получить ценную информацию о любом организме. Полногеномное секвенирование помогает идентифицировать гены, кодирующие устойчивость к антибиотикам, потенциальные мишени для лекарств, факторы вирулентности, транспортеры, ферменты, метаболизирующие ксенобиотики, и т. д.15,16,17. Было доказано, что секвенирование гена, кодирующего 16SrРНК, является надежным методом идентификации филогении бактерий. Сохранение последовательности и функции гена на протяжении многих лет делает его надежным инструментом для идентификации неизвестных бактерий и сравнения изолята с ближайшими видами. Кроме того, длина этого гена оптимальна для биоинформатического анализа18. Все эти особенности, наряду с простотой амплификации генов с помощью универсальных праймеров и совершенствованием технологии секвенирования генов, делают его золотым стандартом для идентификации микробов.
В данной статье мы опишем процедуру извлечения культивируемых микроорганизмов с потенциалом разложения HC из образцов окружающей среды. Метод, описанный ниже, описывает сбор и идентификацию HC-разлагающих бактерий и разделен на пять разделов: (1) сбор бактерий из проб воды, (2) выделение чистых культур, (3) изучение способности бактериальных изолятов к деградации HC, (4) выделение геномной ДНК и (5) идентификация на основе секвенирования гена 16S рРНК и анализа BLAST. Эта процедура может быть адаптирована для выделения бактерий для различных биотехнологических применений.
Protocol
Representative Results
Discussion
Хорошо известно, что только около 1% бактерий на Земле могут быть легко культивированыв лаборатории. Даже среди культивируемых бактерий многие остаются неохарактеризованными. Совершенствование молекулярных методов придало новое измерение анализу и оценке бактериальных …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим доктора Картика Кришнана и сотрудников лаборатории RP за их полезные комментарии и предложения. DS поддерживается стипендией SNU-Doctoral fellowship и стипендией Earthwatch Institute India. RP lab поддерживается грантом CSIR-EMR и стартовыми фондами от Университета Шив Надар.
Materials
| Agarose | Sigma-Aldrich | A4718 | Gel electrophoresis |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Sigma-Aldrich | A9434 | Growth medium component |
| Ammonium sulphate | Sigma-Aldrich | A4418 | Growth medium component |
| Bacto-Agar | Millipore | 1016141000 | Solid media preparation |
| Calcium chloride (CaCl2) | MERCK | C4901-500G | Growth medium component |
| Catechol | Sigma-Aldrich | 135011 | Hydrocarbon degradation assay |
| Cetyltrimethylammonium bromide, CTAB | Sigma-Aldrich | H6269 | Genomic DNA Isolation |
| Chloroform | HIMEDIA | MB109 | Genomic DNA isolation |
| Disodium phosphate (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S5136 | Growth medium component |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | gDNA buffer component |
| Ferrous sulphate, heptahydrate (FeSO4.7H20) | Sigma-Aldrich | 215422 | Growth medium component |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | Growth medium component |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Growth medium component; Glycerol stocks |
| Isopropanol | HIMEDIA | MB063 | Genomic DNA isolation |
| LB Agar | Difco | 244520 | Growth medium |
| Luria-Bertani (LB) | Difco | 244620 | Growth medium |
| Magnesium sulphate (MgSO4) | MERCK | M2643 | Growth medium component |
| Manganese (II) sulfate monohydrate (MnSO4.H20) | Sigma-Aldrich | 221287 | Growth medium component |
| Nutrient Broth (NB) | Merck (Millipore) | 03856-500G | Growth medium |
| Peptone | Merck | 91249-500G | Growth medium component |
| Phenol | Sigma-Aldrich | P1037 | Genomic DNA isolation |
| Potassium phosphate, dibasic (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | P3786 | Growth medium component |
| Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791 | Growth medium component |
| Proteinase K | ThermoFisher Scientific | AM2546 | Genomic DNA isolation |
| QIAquick Gel Extraction kit | QIAGEN | 160016235 | DNA purification |
| QIAquick PCR Purification kit | QIAGEN | 163038783 | DNA purification |
| R2A Agar | Millipore | 1004160500 | Growth medium |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | BIO-RAD | 4006221 | Absorbance measurement |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | Genomic DNA isolation |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | Growth medium component |
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 | Genomic DNA isolation |
| Styrene | Sigma-Aldrich | S4972 | Styrene biodegradation |
| Taq DNA Polymerase | NEB | M0273X | 16s rRNA PCR |
| Tris-EDTA (TE) | Sigma-Aldrich | 93283 | Resuspension of genomic DNA |
| Tryptic Soy Broth (TSB) | Merck | 22092-500G | Growth medium |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625-1KG | Growth medium component |
| Zinc sulfate heptahydrate (ZnSO4.7H20) | Sigma-Aldrich | 221376 | Growth medium component |
References
- Sirotkin, A. V. Reproductive effects of oil-related environmental pollutants. Encyclopedia of Environmental Health. , 493-498 (2019).
- Li, C., Busquets, R., Campos, L. C. Assessment of microplastics in freshwater systems: A review. Science of The Total Environment. 707, 135578 (2020).
- Siddiqa, A., Faisal, M. Microbial degradation of organic pollutants using indigenous bacterial strains. Handbook of Bioremediation. , 625-637 (2021).
- Hossain, F., et al. Bioremediation potential of hydrocarbon degrading bacteria: isolation, characterization, and assessment. Saudi Journal of Biological Sciences. , (2021).
- Wongbunmak, A., Khiawjan, S., Suphantharika, M., Pongtharangkul, T. BTEX biodegradation by Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum W1 and its proposed BTEX biodegradation pathways. Scientific Reports. 10 (1), 17408 (2020).
- Bodor, A., et al. Challenges of unculturable bacteria: environmental perspectives. Reviews in Environmental Science and Bio/Technology. 19 (1), 1-22 (2020).
- Phale, P. S., Sharma, A., Gautam, K. Microbial degradation of xenobiotics like aromatic pollutants from the terrestrial environments. Pharmaceuticals and Personal Care Products: Waste Management and Treatment Technology. , 259-278 (2019).
- Brooijmans, R. J. W., Pastink, M. I., Siezen, R. J. Hydrocarbon-degrading bacteria: the oil-spill clean-up crew. Microbial Biotechnology. 2 (6), 587-594 (2009).
- Sorkhoh, N. A., Ghannoum, M. A., Ibrahim, A. S., Stretton, R. J., Radwan, S. S. Crude oil and hydrocarbon-degrading strains of Rhodococcus rhodochrous isolated from soil and marine environments in Kuwait. Environmental Pollution. 65 (1), 1-17 (1990).
- Chaillan, F., et al. Identification and biodegradation potential of tropical aerobic hydrocarbon-degrading microorganisms. Research in Microbiology. 155 (7), 587-595 (2004).
- Bôto, M. L., et al. Harnessing the potential of native microbial communities for bioremediation of oil spills in the Iberian Peninsula NW coast. Frontiers in Microbiology. 12, 879 (2021).
- Wang, Y., et al. A culture-independent approach to unravel uncultured bacteria and functional genes in a complex microbial community. PloS One. 7 (10), 47530 (2012).
- Jovel, J., et al. Characterization of the gut microbiome using 16S or shotgun metagenomics. Frontiers in Microbiology. 7, 459 (2016).
- Spini, G., et al. Molecular and microbiological insights on the enrichment procedures for the isolation of petroleum degrading bacteria and fungi. Frontiers in Microbiology. , 2543 (2018).
- Pightling, A. W., et al. Interpreting whole-genome sequence analyses of foodborne bacteria for regulatory applications and outbreak investigations. Frontiers in Microbiology. , 1482 (2018).
- Salipante, S. J., et al. Application of whole-genome sequencing for bacterial strain typing in molecular epidemiology. Journal of Clinical Microbiology. 53 (4), 1072-1079 (2015).
- Lovley, D. R. Cleaning up with genomics: applying molecular biology to bioremediation. Nature Reviews Microbiology. 1 (1), 35-44 (2003).
- Janda, J. M., Abbott, S. L. 16S rRNA gene sequencing for bacterial identification in the diagnostic laboratory: pluses, perils, and pitfalls. Journal of Clinical Microbiology. 45 (9), 2761-2764 (2007).
- Poindexter, J. S. Biological properties and classification of the Caulobacter group. Bacteriological Reviews. 28 (3), 231-295 (1964).
- Reasoner, D. J., Geldreich, E. A new medium for the enumeration and subculture of bacteria from potable water. Applied and Environmental Microbiology. 49 (1), 1-7 (1985).
- Pardee, A. B. The genetic control and cytoplasmic expression of “Inducibility” in the synthesis of β-galactosidase by E. coli. Journal of Molecular Biology. 1 (2), 165-178 (1959).
- Ely, B. Genetics of Caulobacter crescentus. Methods in Enzymology. 204, 372-384 (1991).
- R, C. Gram staining. Current Protocols in Microbiology. , (2005).
- Green, M. R., Hughes, H., Sambrook, J., MacCallum, P. Molecular cloning: a laboratory manual. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , 1890 (2012).
- Chauhan, D., Agrawal, G., Deshmukh, S., Roy, S. S., Priyadarshini, R. Biofilm formation by Exiguobacterium sp. DR11 and DR14 alter polystyrene surface properties and initiate biodegradation. RSC Advances. 8 (66), 37590-37599 (2018).
- Takeo, M., Nishimura, M., Shirai, M., Takahashi, H., Negoro, S. Purification and characterization of catechol 2,3-Dioxygenase from the aniline degradation pathway of Acinetobacter sp. YAA and its mutant enzyme, which resists substrate inhibition. Bioscience, Biotechnology, Biochemistry. 71, 70079-70080 (2007).
- Nguyen, O. T., Ha, D. D. Degradation of chlorotoluenes and chlorobenzenes by the dual-species biofilm of Comamonas testosteroni strain KT5 and Bacillus subtilis strain DKT. Annals of Microbiology. 69 (3), 267-277 (2019).
- Hupert-Kocurek, K., Guzik, U., Wojcieszyńska, D. Characterization of catechol 2, 3-dioxygenase from Planococcus sp. strain S5 induced by high phenol concentration. Acta Biochimica Polonica. 59 (3), (2012).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Peterson, G. L., et al. A simplification of the protein assay method of Lowry et al. which is more generally applicable. Analytical Biochemistry. 83 (2), 346-356 (1977).
- Chen, W. P., Kuo, T. T. A simple and rapid method for the preparation of gram-negative bacterial genomic DNA. Nucleic Acids Research. 21 (9), 2260 (1993).
- William, S., Feil, H., Copeland, A. Bacterial genomic DNA isolation using CTAB. Sigma. 50 (6876), (2012).
- Frank, J. A., et al. Critical evaluation of two primers commonly used for amplification of bacterial 16S rRNA genes. Applied and Environmental Microbiology. 74 (8), 2461-2470 (2008).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Johnson, M., et al. NCBI BLAST: a better web interface. Nucleic Acids Research. 36, 5-9 (2008).
- Harayama, S., Rekik, M. Bacterial aromatic ring-cleavage enzymes are classified into two different gene families. Journal of Biological Chemistry. 264 (26), 15328-15333 (1989).
- Li, X., et al. Efficiency of chemical versus mechanical disruption methods of DNA extraction for the identification of oral Gram-positive and Gram-negative bacteria. The Journal of International Medical Research. 48 (5), 300060520925594 (2020).
- Coico, R. Gram staining. Current Protocols in Microbiology. , (2005).
- Clarridge, J. E. III Impact of 16S rRNA gene sequence analysis for identification of bacteria on clinical microbiology and infectious diseases. Clinical Microbiology Reviews. 17 (4), 840 (2004).
- Dereeper, A., et al. Phylogeny. fr: robust phylogenetic analysis for the non-specialist. Nucleic Acids Research. 36, 465-469 (2008).
- Wadowsky, R. M., Wolford, R., McNamara, A. M., Yee, R. B. Effect of temperature, pH, and oxygen level on the multiplication of naturally occurring Legionella pneumophila in potable water. Applied and Environmental Microbiology. 49 (5), 1197-1205 (1985).
- du Toit, W. J., Pretorius, I. S., Lonvaud-Funel, A. The effect of sulphur dioxide and oxygen on the viability and culturability of a strain of Acetobacter pasteurianus and a strain of Brettanomyces bruxellensis isolated from wine. Journal of Applied Microbiology. 98 (4), 862-871 (2005).
- Johnson, J. S., et al. Evaluation of 16S rRNA gene sequencing for species and strain-level microbiome analysis. Nature Communications. 10 (1), 1-11 (2019).
- Kim, E., et al. Design of PCR assays to specifically detect and identify 37 Lactobacillus species in a single 96 well plate. BMC Microbiology. 20 (1), 1-14 (2020).
- Poretsky, R., Rodriguez-R, L. M., Luo, C., Tsementzi, D., Konstantinidis, K. T. Strengths and limitations of 16S rRNA gene amplicon sequencing in revealing temporal microbial community dynamics. PLoS ONE. 9 (4), (2014).
- Johnson, B. H., Hecht, M. H. Recombinant proteins can be isolated from E. coli cells by repeated cycles of freezing and thawing. Bio/Technology. 12 (12), 1357-1360 (1994).
- Rodríguez-Carmona, E., Cano-Garrido, O., Seras-Franzoso, J., Villaverde, A., García-Fruitós, E. Isolation of cell-free bacterial inclusion bodies. Microbial Cell Factories. 9 (1), 71 (2010).
- Hoiczyk, E., Hansel, A. Cyanobacterial cell walls: News from an unusual prokaryotic envelope. Journal of Bacteriology. 182 (5), 1191 (2000).
- Erstad, S. M., Sakuragi, Y. Easy and efficient permeabilization of cyanobacteria for in vivo enzyme assays using B-PER. Bio-Protocol. 8 (1), (2018).
