Isolamento, propagazione e identificazione di specie batteriche con proprietà metabolizzanti di idrocarburi da habitat acquatici

Gli idrocarburi (HC) sono ampiamente utilizzati sia come combustibili che in applicazioni chimiche. Gli idrocarburi aromatici come benzene, toluene e xilene sono ampiamente utilizzati come solventi¹. Alcheni come etilene e propilene fungono da precursori nella sintesi di polimeri di polietilene e polipropilene, rispettivamente. Polimerizzazione di un altro idrocarburo, lo stirene forma polistirene. Le attività antropiche introducono idrocarburi nell’ambiente durante la loro produzione e trasporto. La contaminazione da idrocarburi del suolo e dell’acqua è fonte di gravi preoccupazioni per l’ambiente e la salute umana. I microbi svolgono un ruolo importante nel mantenimento dell’ecosistema regolando i cicli biogeochimici e utilizzando una vasta gamma di substrati, che includono anche inquinanti e xenobiotici, convertendoli in carbonio e fonte di energia. Questo processo di disintossicazione dei contaminanti ambientali da parte di microrganismi è noto come biorisanamento 3,4,5,6,7.

I microrganismi con la capacità di degradare gli idrocarburi si trovano negli habitat acquatici e del suolo ^8,9,10. Sono stati identificati molti batteri con il potenziale di degradare alcani e HC aromatici, come Pseudomonas, Acinetobacter, Rhodococcus, Marinobacter e Oleibacter¹¹. Lo sviluppo di approcci tecnologicamente avanzati indipendenti dalla coltura ha contribuito alla scoperta di nuove comunità microbiche che degradano l’HC¹². Il materiale genomico isolato direttamente dai campioni sorgente viene amplificato e sequenziato con metodi ad alta produttività come il sequenziamento di nuova generazione (NGS), seguito dall’analisi eliminando la necessità di coltivare microrganismi. I metodi NGS, come l’analisi del metagenoma, sono costosi e presentano inconvenienti legati al processo di amplificazione¹³. Le tecniche di coltivazione come la coltura dell’arricchimento selettivo¹⁴ che mirano all’isolamento dei microbi che degradano gli idrocarburi sono ancora utili in quanto consentono ai ricercatori di sondare e manipolare le vie metaboliche negli isolati batterici.

L’isolamento del DNA genomico e il successivo sequenziamento del materiale genomico rivelano informazioni preziose su qualsiasi organismo. Il sequenziamento dell’intero genoma aiuta nell’identificazione di geni che codificano per la resistenza agli antibiotici, potenziali bersagli farmacologici, fattori di virulenza, trasportatori, enzimi che metabolizzano gli xenobiotici, ecc^15,16,17. Il sequenziamento del gene codificante 16SrRNA ha dimostrato di essere una tecnica robusta per identificare la filogenesi batterica. La conservazione della sequenza e della funzione genica nel corso degli anni lo rende uno strumento affidabile per identificare batteri sconosciuti e confrontare un isolato con le specie più vicine. Inoltre, la lunghezza di questo gene è ottimale per l’analisi bioinformatica¹⁸. Tutte queste caratteristiche, insieme alla facilità di amplificazione genica utilizzando primer universali e al miglioramento della tecnologia di sequenziamento genico, lo rendono un gold standard per l’identificazione dei microbi.

Qui, descriviamo una procedura per recuperare microrganismi coltivabili con potenziale di degradazione dell’HC da campioni ambientali. Il metodo descritto di seguito delinea la raccolta e l’identificazione dei batteri che degradano l’HC ed è diviso in cinque sezioni: (1) raccolta di batteri da campioni d’acqua, (2) isolamento di colture pure, (3) esplorazione della capacità di degradazione dell’HC di isolati batterici (4) isolamento del DNA genomico e (5) identificazione basata sul sequenziamento del gene rRNA 16S e analisi BLAST. Questa procedura può essere adattata per isolare batteri per molte diverse applicazioni biotecnologiche.