Isolatie, vermeerdering en identificatie van bacteriële soorten met koolwaterstof metaboliserende eigenschappen uit aquatische habitats
Summary
We presenteren het proces van het isoleren, verspreiden en karakteriseren van koolwaterstofafbrekende bacteriën uit aquatische habitats. Het protocol schetst bacteriële isolatie, identificatie door de 16S-rRNA-methode en het testen van hun koolwaterstofafbrekend potentieel. Dit artikel zou onderzoekers helpen bij het karakteriseren van microbiële biodiversiteit in milieumonsters, en specifiek screenen op microben met bioremediatiepotentieel.
Abstract
Koolwaterstofverontreinigende stoffen zijn recalcitrant voor afbraak en hun accumulatie in het milieu is giftig voor alle levensvormen. Bacteriën coderen voor tal van katalytische enzymen en zijn van nature in staat om koolwaterstoffen te metaboliseren. Wetenschappers benutten biodiversiteit in aquatische ecosystemen om bacteriën te isoleren met biologisch afbreekbaar en bioremediatiepotentieel. Dergelijke isolaten uit de omgeving bieden een rijke reeks metabole routes en enzymen, die verder kunnen worden gebruikt om het afbraakproces op industriële schaal op te schalen. In dit artikel schetsen we het algemene proces van isolatie, verspreiding en identificatie van bacteriesoorten uit aquatische habitats en screenen we hun vermogen om koolwaterstoffen te gebruiken als de enige koolstofbron in vitro met behulp van eenvoudige technieken. Het huidige protocol beschrijft de isolatie van verschillende bacteriesoorten en hun daaropvolgende identificatie met behulp van de 16S-rRNA-analyse. Het protocol presenteert ook stappen voor het karakteriseren van het koolwaterstofafbrekend vermogen van bacteriële isolaten. Dit protocol zal nuttig zijn voor onderzoekers die proberen bacteriesoorten te isoleren uit milieuhabitats voor hun biotechnologische toepassingen.
Introduction
Koolwaterstoffen (HC) worden op grote schaal gebruikt, zowel als brandstof als in chemische toepassingen. Aromatische koolwaterstoffen zoals benzeen, tolueen en xyleen worden veel gebruikt als oplosmiddelen1. Alkenen zoals ethyleen en propyleen dienen als voorlopers bij de synthese van respectievelijk polyethyleen- en polypropyleenpolymeren. Polymerisatie van een andere koolwaterstof, styreen vormt polystyreen. Antropogene activiteiten introduceren koolwaterstoffen in het milieu tijdens hun productie en transport. Koolwaterstofverontreiniging van bodem en water heeft ernstige zorgen voor het milieu en de menselijke gezondheid. Microben spelen een belangrijke rol bij het in stand houden van het ecosysteem door de biogeochemische cycli te reguleren en een breed scala aan substraten te gebruiken, waaronder verontreinigende stoffen en xenobiotica, en deze om te zetten in koolstof en energiebron. Dit proces van ontgifting van milieuverontreinigende stoffen door micro-organismen staat bekend als bioremediatie 3,4,5,6,7.
Micro-organismen met het vermogen om koolwaterstoffen af te breken worden aangetroffen in aquatische en bodemhabitats 8,9,10. Veel bacteriën met het potentieel om alkanen en aromatische HC’s af te breken zijn geïdentificeerd, zoals Pseudomonas, Acinetobacter, Rhodococcus, Marinobacter en Oleibacter11. De ontwikkeling van technologisch geavanceerde cultuuronafhankelijke benaderingen heeft geholpen bij het ontdekken van nieuwe HC-degraderende microbiële gemeenschappen12. Genomisch materiaal dat direct uit bronmonsters wordt geïsoleerd, wordt versterkt en gesequenced door methoden met een hoge doorvoer, zoals Next Generation Sequencing (NGS), gevolgd door analyse, waardoor het niet nodig is om micro-organismen te kweken. NGS-methoden, zoals metagenoomanalyse, zijn duur en hebben nadelen die verband houden met het amplificatieproces13. Teelttechnieken zoals selectieve verrijkingscultuur14 die gericht zijn op isolatie van koolwaterstofafbrekende microben zijn nog steeds nuttig omdat ze onderzoekers in staat stellen metabole routes in bacteriële isolaten te onderzoeken en te manipuleren.
Genomische DNA-isolatie en daaropvolgende sequencing van het genomische materiaal onthult waardevolle informatie over elk organisme. Whole-genome sequencing helpt bij de identificatie van genen die coderen voor antibioticaresistentie, potentiële medicijndoelen, virulentiefactoren, transporters, xenobiotisch-metaboliserende enzymen, enz.15,16,17. Sequencing van het 16SrRNA-coderende gen is bewezen een robuuste techniek te zijn om bacteriële fylogenie te identificeren. Behoud van de gensequentie en -functie door de jaren heen maakt het een betrouwbaar hulpmiddel voor het identificeren van onbekende bacteriën en het vergelijken van een isolaat met de dichtstbijzijnde soort. Bovendien is de lengte van dit gen optimaal voor bioinformatica-analyse18. Al deze functies, samen met het gemak van genamplificatie met behulp van universele primers en verbetering van gensequencingtechnologie, maken het een gouden standaard voor de identificatie van microben.
Hier beschrijven we een procedure om cultiveerbare micro-organismen met HC-afbrekend potentieel terug te winnen uit milieumonsters. De hieronder beschreven methode schetst de verzameling en identificatie van HC-afbrekende bacteriën en is verdeeld in vijf secties: (1) verzameling van bacteriën uit watermonsters, (2) isolatie van zuivere culturen, (3) onderzoek naar HC-afbrekend vermogen van bacteriële isolaten (4) genomische DNA-isolatie en (5) identificatie op basis van 16S rRNA-gensequencing en BLAST-analyse. Deze procedure kan worden aangepast om bacteriën te isoleren voor veel verschillende biotechnologische toepassingen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het is algemeen bekend dat slechts ongeveer 1% van de bacteriën op aarde gemakkelijk in het laboratorium kan worden gekweekt6. Zelfs onder de kweekbare bacteriën blijven velen onkarakteriseerd. Verbeteringen in moleculaire methoden hebben een nieuwe dimensie gegeven aan de analyse en evaluatie van bacteriële gemeenschappen. Dergelijke technieken hebben echter wel beperkingen, maar ze maken de cultuuranalyses niet overbodig. Zuivere kweektechnieken om individuele bacteriesoorten te isoleren blij…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We bedanken Dr. Karthik Krishnan en leden van het RP-lab voor hun nuttige opmerkingen en suggesties. DS wordt ondersteund door SNU-Doctoral fellowship en Earthwatch Institute India Fellowship. RP lab wordt ondersteund door een CSIR-EMR-beurs en start-upfondsen van Shiv Nadar University.
Materials
| Agarose | Sigma-Aldrich | A4718 | Gel electrophoresis |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Sigma-Aldrich | A9434 | Growth medium component |
| Ammonium sulphate | Sigma-Aldrich | A4418 | Growth medium component |
| Bacto-Agar | Millipore | 1016141000 | Solid media preparation |
| Calcium chloride (CaCl2) | MERCK | C4901-500G | Growth medium component |
| Catechol | Sigma-Aldrich | 135011 | Hydrocarbon degradation assay |
| Cetyltrimethylammonium bromide, CTAB | Sigma-Aldrich | H6269 | Genomic DNA Isolation |
| Chloroform | HIMEDIA | MB109 | Genomic DNA isolation |
| Disodium phosphate (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S5136 | Growth medium component |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | gDNA buffer component |
| Ferrous sulphate, heptahydrate (FeSO4.7H20) | Sigma-Aldrich | 215422 | Growth medium component |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | Growth medium component |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Growth medium component; Glycerol stocks |
| Isopropanol | HIMEDIA | MB063 | Genomic DNA isolation |
| LB Agar | Difco | 244520 | Growth medium |
| Luria-Bertani (LB) | Difco | 244620 | Growth medium |
| Magnesium sulphate (MgSO4) | MERCK | M2643 | Growth medium component |
| Manganese (II) sulfate monohydrate (MnSO4.H20) | Sigma-Aldrich | 221287 | Growth medium component |
| Nutrient Broth (NB) | Merck (Millipore) | 03856-500G | Growth medium |
| Peptone | Merck | 91249-500G | Growth medium component |
| Phenol | Sigma-Aldrich | P1037 | Genomic DNA isolation |
| Potassium phosphate, dibasic (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | P3786 | Growth medium component |
| Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791 | Growth medium component |
| Proteinase K | ThermoFisher Scientific | AM2546 | Genomic DNA isolation |
| QIAquick Gel Extraction kit | QIAGEN | 160016235 | DNA purification |
| QIAquick PCR Purification kit | QIAGEN | 163038783 | DNA purification |
| R2A Agar | Millipore | 1004160500 | Growth medium |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | BIO-RAD | 4006221 | Absorbance measurement |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | Genomic DNA isolation |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | Growth medium component |
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 | Genomic DNA isolation |
| Styrene | Sigma-Aldrich | S4972 | Styrene biodegradation |
| Taq DNA Polymerase | NEB | M0273X | 16s rRNA PCR |
| Tris-EDTA (TE) | Sigma-Aldrich | 93283 | Resuspension of genomic DNA |
| Tryptic Soy Broth (TSB) | Merck | 22092-500G | Growth medium |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625-1KG | Growth medium component |
| Zinc sulfate heptahydrate (ZnSO4.7H20) | Sigma-Aldrich | 221376 | Growth medium component |
References
- Sirotkin, A. V. Reproductive effects of oil-related environmental pollutants. Encyclopedia of Environmental Health. , 493-498 (2019).
- Li, C., Busquets, R., Campos, L. C. Assessment of microplastics in freshwater systems: A review. Science of The Total Environment. 707, 135578 (2020).
- Siddiqa, A., Faisal, M. Microbial degradation of organic pollutants using indigenous bacterial strains. Handbook of Bioremediation. , 625-637 (2021).
- Hossain, F., et al. Bioremediation potential of hydrocarbon degrading bacteria: isolation, characterization, and assessment. Saudi Journal of Biological Sciences. , (2021).
- Wongbunmak, A., Khiawjan, S., Suphantharika, M., Pongtharangkul, T. BTEX biodegradation by Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum W1 and its proposed BTEX biodegradation pathways. Scientific Reports. 10 (1), 17408 (2020).
- Bodor, A., et al. Challenges of unculturable bacteria: environmental perspectives. Reviews in Environmental Science and Bio/Technology. 19 (1), 1-22 (2020).
- Phale, P. S., Sharma, A., Gautam, K. Microbial degradation of xenobiotics like aromatic pollutants from the terrestrial environments. Pharmaceuticals and Personal Care Products: Waste Management and Treatment Technology. , 259-278 (2019).
- Brooijmans, R. J. W., Pastink, M. I., Siezen, R. J. Hydrocarbon-degrading bacteria: the oil-spill clean-up crew. Microbial Biotechnology. 2 (6), 587-594 (2009).
- Sorkhoh, N. A., Ghannoum, M. A., Ibrahim, A. S., Stretton, R. J., Radwan, S. S. Crude oil and hydrocarbon-degrading strains of Rhodococcus rhodochrous isolated from soil and marine environments in Kuwait. Environmental Pollution. 65 (1), 1-17 (1990).
- Chaillan, F., et al. Identification and biodegradation potential of tropical aerobic hydrocarbon-degrading microorganisms. Research in Microbiology. 155 (7), 587-595 (2004).
- Bôto, M. L., et al. Harnessing the potential of native microbial communities for bioremediation of oil spills in the Iberian Peninsula NW coast. Frontiers in Microbiology. 12, 879 (2021).
- Wang, Y., et al. A culture-independent approach to unravel uncultured bacteria and functional genes in a complex microbial community. PloS One. 7 (10), 47530 (2012).
- Jovel, J., et al. Characterization of the gut microbiome using 16S or shotgun metagenomics. Frontiers in Microbiology. 7, 459 (2016).
- Spini, G., et al. Molecular and microbiological insights on the enrichment procedures for the isolation of petroleum degrading bacteria and fungi. Frontiers in Microbiology. , 2543 (2018).
- Pightling, A. W., et al. Interpreting whole-genome sequence analyses of foodborne bacteria for regulatory applications and outbreak investigations. Frontiers in Microbiology. , 1482 (2018).
- Salipante, S. J., et al. Application of whole-genome sequencing for bacterial strain typing in molecular epidemiology. Journal of Clinical Microbiology. 53 (4), 1072-1079 (2015).
- Lovley, D. R. Cleaning up with genomics: applying molecular biology to bioremediation. Nature Reviews Microbiology. 1 (1), 35-44 (2003).
- Janda, J. M., Abbott, S. L. 16S rRNA gene sequencing for bacterial identification in the diagnostic laboratory: pluses, perils, and pitfalls. Journal of Clinical Microbiology. 45 (9), 2761-2764 (2007).
- Poindexter, J. S. Biological properties and classification of the Caulobacter group. Bacteriological Reviews. 28 (3), 231-295 (1964).
- Reasoner, D. J., Geldreich, E. A new medium for the enumeration and subculture of bacteria from potable water. Applied and Environmental Microbiology. 49 (1), 1-7 (1985).
- Pardee, A. B. The genetic control and cytoplasmic expression of “Inducibility” in the synthesis of β-galactosidase by E. coli. Journal of Molecular Biology. 1 (2), 165-178 (1959).
- Ely, B. Genetics of Caulobacter crescentus. Methods in Enzymology. 204, 372-384 (1991).
- R, C. Gram staining. Current Protocols in Microbiology. , (2005).
- Green, M. R., Hughes, H., Sambrook, J., MacCallum, P. Molecular cloning: a laboratory manual. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , 1890 (2012).
- Chauhan, D., Agrawal, G., Deshmukh, S., Roy, S. S., Priyadarshini, R. Biofilm formation by Exiguobacterium sp. DR11 and DR14 alter polystyrene surface properties and initiate biodegradation. RSC Advances. 8 (66), 37590-37599 (2018).
- Takeo, M., Nishimura, M., Shirai, M., Takahashi, H., Negoro, S. Purification and characterization of catechol 2,3-Dioxygenase from the aniline degradation pathway of Acinetobacter sp. YAA and its mutant enzyme, which resists substrate inhibition. Bioscience, Biotechnology, Biochemistry. 71, 70079-70080 (2007).
- Nguyen, O. T., Ha, D. D. Degradation of chlorotoluenes and chlorobenzenes by the dual-species biofilm of Comamonas testosteroni strain KT5 and Bacillus subtilis strain DKT. Annals of Microbiology. 69 (3), 267-277 (2019).
- Hupert-Kocurek, K., Guzik, U., Wojcieszyńska, D. Characterization of catechol 2, 3-dioxygenase from Planococcus sp. strain S5 induced by high phenol concentration. Acta Biochimica Polonica. 59 (3), (2012).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Peterson, G. L., et al. A simplification of the protein assay method of Lowry et al. which is more generally applicable. Analytical Biochemistry. 83 (2), 346-356 (1977).
- Chen, W. P., Kuo, T. T. A simple and rapid method for the preparation of gram-negative bacterial genomic DNA. Nucleic Acids Research. 21 (9), 2260 (1993).
- William, S., Feil, H., Copeland, A. Bacterial genomic DNA isolation using CTAB. Sigma. 50 (6876), (2012).
- Frank, J. A., et al. Critical evaluation of two primers commonly used for amplification of bacterial 16S rRNA genes. Applied and Environmental Microbiology. 74 (8), 2461-2470 (2008).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Johnson, M., et al. NCBI BLAST: a better web interface. Nucleic Acids Research. 36, 5-9 (2008).
- Harayama, S., Rekik, M. Bacterial aromatic ring-cleavage enzymes are classified into two different gene families. Journal of Biological Chemistry. 264 (26), 15328-15333 (1989).
- Li, X., et al. Efficiency of chemical versus mechanical disruption methods of DNA extraction for the identification of oral Gram-positive and Gram-negative bacteria. The Journal of International Medical Research. 48 (5), 300060520925594 (2020).
- Coico, R. Gram staining. Current Protocols in Microbiology. , (2005).
- Clarridge, J. E. III Impact of 16S rRNA gene sequence analysis for identification of bacteria on clinical microbiology and infectious diseases. Clinical Microbiology Reviews. 17 (4), 840 (2004).
- Dereeper, A., et al. Phylogeny. fr: robust phylogenetic analysis for the non-specialist. Nucleic Acids Research. 36, 465-469 (2008).
- Wadowsky, R. M., Wolford, R., McNamara, A. M., Yee, R. B. Effect of temperature, pH, and oxygen level on the multiplication of naturally occurring Legionella pneumophila in potable water. Applied and Environmental Microbiology. 49 (5), 1197-1205 (1985).
- du Toit, W. J., Pretorius, I. S., Lonvaud-Funel, A. The effect of sulphur dioxide and oxygen on the viability and culturability of a strain of Acetobacter pasteurianus and a strain of Brettanomyces bruxellensis isolated from wine. Journal of Applied Microbiology. 98 (4), 862-871 (2005).
- Johnson, J. S., et al. Evaluation of 16S rRNA gene sequencing for species and strain-level microbiome analysis. Nature Communications. 10 (1), 1-11 (2019).
- Kim, E., et al. Design of PCR assays to specifically detect and identify 37 Lactobacillus species in a single 96 well plate. BMC Microbiology. 20 (1), 1-14 (2020).
- Poretsky, R., Rodriguez-R, L. M., Luo, C., Tsementzi, D., Konstantinidis, K. T. Strengths and limitations of 16S rRNA gene amplicon sequencing in revealing temporal microbial community dynamics. PLoS ONE. 9 (4), (2014).
- Johnson, B. H., Hecht, M. H. Recombinant proteins can be isolated from E. coli cells by repeated cycles of freezing and thawing. Bio/Technology. 12 (12), 1357-1360 (1994).
- Rodríguez-Carmona, E., Cano-Garrido, O., Seras-Franzoso, J., Villaverde, A., García-Fruitós, E. Isolation of cell-free bacterial inclusion bodies. Microbial Cell Factories. 9 (1), 71 (2010).
- Hoiczyk, E., Hansel, A. Cyanobacterial cell walls: News from an unusual prokaryotic envelope. Journal of Bacteriology. 182 (5), 1191 (2000).
- Erstad, S. M., Sakuragi, Y. Easy and efficient permeabilization of cyanobacteria for in vivo enzyme assays using B-PER. Bio-Protocol. 8 (1), (2018).
