בידוד, ריבוי וזיהוי של מיני חיידקים בעלי תכונות מטבוליזם פחמימני מבתי גידול מימיים
Summary
אנו מציגים את תהליך הבידוד, ההתרבות והאפיון של חיידקים מפרקים פחמימנים מבתי גידול מימיים. הפרוטוקול מתאר בידוד חיידקים, זיהוי בשיטת 16S rRNA, ובדיקת פוטנציאל פירוק הפחמימנים שלהם. מאמר זה יסייע לחוקרים לאפיין מגוון ביולוגי מיקרוביאלי בדגימות סביבתיות, ובמיוחד לסנן מיקרובים בעלי פוטנציאל לריפוי ביולוגי.
Abstract
מזהמים פחמימנים עמידים להתכלות והצטברותם בסביבה רעילה לכל צורות החיים. חיידקים מקודדים אנזימים קטליטיים רבים והם מסוגלים באופן טבעי לעכל פחמימנים. מדענים רותמים את המגוון הביולוגי במערכות אקולוגיות ימיות כדי לבודד חיידקים בעלי פוטנציאל פירוק ביולוגי וריפוי ביולוגי. מבודדים כאלה מהסביבה מספקים מערך עשיר של מסלולים מטבוליים ואנזימים, אשר ניתן להשתמש בהם עוד יותר כדי להרחיב את תהליך הפירוק בקנה מידה תעשייתי. במאמר זה נתאר את התהליך הכללי של בידוד, ריבוי וזיהוי של מיני חיידקים מבתי גידול מימיים ונסקור את יכולתם לנצל פחמימנים כמקור הפחמן היחיד במבחנה באמצעות טכניקות פשוטות. הפרוטוקול הנוכחי מתאר את בידודם של מיני חיידקים שונים ואת זיהויים לאחר מכן באמצעות ניתוח rRNA 16S. הפרוטוקול מציג גם שלבים לאפיון פוטנציאל פירוק הפחמימנים של מבודדי חיידקים. פרוטוקול זה יהיה שימושי עבור חוקרים המנסים לבודד מיני חיידקים מבתי גידול סביבתיים עבור היישומים הביוטכנולוגיים שלהם.
Introduction
פחמימנים (HC) נמצאים בשימוש נרחב הן כדלקים והן ביישומים כימיים. פחמימנים ארומטיים כגון בנזן, טולואן וקסילן נמצאים בשימוש נרחב כממסים1. אלקנים כגון אתילן ופרופילן משמשים כמבשרי בסינתזה של פוליאתילן ופוליפרופילן, בהתאמה. פילמור של פחמימן אחר, סטירן יוצר פוליסטירן. פעילויות אנתרופוגניות מציגות פחמימנים לסביבה במהלך הייצור וההובלה שלהם. זיהום פחמימני של קרקע ומים יש חששות רציניים לסביבה ובריאות האדם. מיקרובים ממלאים תפקיד מרכזי בשמירה על המערכת האקולוגית על ידי ויסות המחזורים הביו-גיאוכימיים וניצול מגוון רחב של מצעים, הכוללים גם מזהמים וקסנוביוטיקה, וממירים אותם לפחמן ולמקור אנרגיה. תהליך זה של ניקוי רעלים של מזהמים סביבתיים על ידי מיקרואורגניזמים ידוע בשם bioremediation 3,4,5,6,7.
מיקרואורגניזמים בעלי יכולת פירוק פחמימנים נמצאים בבתי גידול מימיים וקרקעיים 8,9,10. זוהו חיידקים רבים עם פוטנציאל לפרק אלקנים וHCs ארומטיים, כגון Pseudomonas, Acinetobacter, Rhodococcus, Marinobacter ו– Oleibacter11. הפיתוח של גישות מתקדמות מבחינה טכנולוגית שאינן תלויות בתרבות סייע לגלות קהילות מיקרוביאליות חדשות המפילות HC12. חומר גנומי המבודד ישירות מדגימות המקור מוגבר ומרוצף על ידי שיטות תפוקה גבוהה כגון ריצוף הדור הבא (NGS) ואחריו ניתוח המבטל את הצורך לטפח מיקרואורגניזמים. שיטות NGS, כגון ניתוח מטא-גנום, הן יקרות וסובלות מחסרונות הקשורים לתהליך ההגברה13. טכניקות גידול כגון תרבית העשרה סלקטיבית14 המכוונות לבידוד של מיקרובים מפרקים פחמימנים עדיין שימושיות מכיוון שהן מאפשרות לחוקרים לחקור ולתפעל מסלולים מטבוליים במבודדים חיידקיים.
בידוד דנ”א גנומי וריצוף החומר הגנומי לאחר מכן חושפים מידע רב ערך על כל אורגניזם. ריצוף גנום שלם מסייע בזיהוי גנים המקודדים עמידות לאנטיביוטיקה, מטרות פוטנציאליות לתרופות, גורמי אלימות, טרנספורטרים, אנזימים קסנוביוטיים-מטבוליזם וכו ‘15,16,17. ריצוף הגן המקודד 16SrRNA הוכח כטכניקה חזקה לזיהוי פילוגניה חיידקית. שימור רצף הגן ותפקודו לאורך השנים הופך אותו לכלי אמין לזיהוי חיידקים לא מוכרים ולהשוואת מבודד למין הקרוב ביותר. בנוסף, אורכו של גן זה הוא אופטימלי לניתוח ביואינפורמטיקה18. כל התכונות הללו, יחד עם קלות הגברה גנטית באמצעות פריימרים אוניברסליים ושיפור בטכנולוגיית ריצוף גנים, הופכות אותו לתקן זהב לזיהוי חיידקים.
במאמר זה אנו מתארים הליך לשחזור מיקרואורגניזמים הניתנים לטיפוח עם פוטנציאל פירוק HC מדגימות סביבתיות. השיטה המתוארת להלן מתארת את האיסוף והזיהוי של חיידקים מפרקים HC ומחולקת לחמישה חלקים: (1) איסוף חיידקים מדגימות מים, (2) בידוד תרביות טהורות, (3) חקירת יכולת פירוק HC של מבודדי חיידקים (4) בידוד DNA גנומי, ו-(5) זיהוי המבוסס על ריצוף גנים 16S rRNA וניתוח BLAST. הליך זה יכול להיות מותאם לבידוד חיידקים עבור יישומים ביוטכנולוגיים רבים ושונים.
Protocol
Representative Results
Discussion
זה מבוסס היטב כי רק כ 1% של חיידקים על כדור הארץ ניתן לטפח בקלות במעבדה6. אפילו בקרב החיידקים הניתנים לטיפוח, רבים נותרים בלתי מאופיינים. שיפורים בשיטות מולקולריות העניקו ממד חדש לניתוח ולהערכה של קהילות חיידקים. עם זאת, לטכניקות כאלה יש מגבלות, אך הן אינן מייתרות את ניתוחי התרב?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לד”ר Karthik Krishnan ולחברי מעבדת RP על הערותיהם והצעותיהם המועילות. DS נתמך על ידי מלגת SNU-Doctoral ומלגת Earthwatch Institute India. מעבדת RP נתמכת על ידי מענק CSIR-EMR וקרנות הזנק מאוניברסיטת שיב נדר.
Materials
| Agarose | Sigma-Aldrich | A4718 | Gel electrophoresis |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Sigma-Aldrich | A9434 | Growth medium component |
| Ammonium sulphate | Sigma-Aldrich | A4418 | Growth medium component |
| Bacto-Agar | Millipore | 1016141000 | Solid media preparation |
| Calcium chloride (CaCl2) | MERCK | C4901-500G | Growth medium component |
| Catechol | Sigma-Aldrich | 135011 | Hydrocarbon degradation assay |
| Cetyltrimethylammonium bromide, CTAB | Sigma-Aldrich | H6269 | Genomic DNA Isolation |
| Chloroform | HIMEDIA | MB109 | Genomic DNA isolation |
| Disodium phosphate (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S5136 | Growth medium component |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | gDNA buffer component |
| Ferrous sulphate, heptahydrate (FeSO4.7H20) | Sigma-Aldrich | 215422 | Growth medium component |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | Growth medium component |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Growth medium component; Glycerol stocks |
| Isopropanol | HIMEDIA | MB063 | Genomic DNA isolation |
| LB Agar | Difco | 244520 | Growth medium |
| Luria-Bertani (LB) | Difco | 244620 | Growth medium |
| Magnesium sulphate (MgSO4) | MERCK | M2643 | Growth medium component |
| Manganese (II) sulfate monohydrate (MnSO4.H20) | Sigma-Aldrich | 221287 | Growth medium component |
| Nutrient Broth (NB) | Merck (Millipore) | 03856-500G | Growth medium |
| Peptone | Merck | 91249-500G | Growth medium component |
| Phenol | Sigma-Aldrich | P1037 | Genomic DNA isolation |
| Potassium phosphate, dibasic (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | P3786 | Growth medium component |
| Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791 | Growth medium component |
| Proteinase K | ThermoFisher Scientific | AM2546 | Genomic DNA isolation |
| QIAquick Gel Extraction kit | QIAGEN | 160016235 | DNA purification |
| QIAquick PCR Purification kit | QIAGEN | 163038783 | DNA purification |
| R2A Agar | Millipore | 1004160500 | Growth medium |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | BIO-RAD | 4006221 | Absorbance measurement |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | Genomic DNA isolation |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | Growth medium component |
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 | Genomic DNA isolation |
| Styrene | Sigma-Aldrich | S4972 | Styrene biodegradation |
| Taq DNA Polymerase | NEB | M0273X | 16s rRNA PCR |
| Tris-EDTA (TE) | Sigma-Aldrich | 93283 | Resuspension of genomic DNA |
| Tryptic Soy Broth (TSB) | Merck | 22092-500G | Growth medium |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625-1KG | Growth medium component |
| Zinc sulfate heptahydrate (ZnSO4.7H20) | Sigma-Aldrich | 221376 | Growth medium component |
References
- Sirotkin, A. V. Reproductive effects of oil-related environmental pollutants. Encyclopedia of Environmental Health. , 493-498 (2019).
- Li, C., Busquets, R., Campos, L. C. Assessment of microplastics in freshwater systems: A review. Science of The Total Environment. 707, 135578 (2020).
- Siddiqa, A., Faisal, M. Microbial degradation of organic pollutants using indigenous bacterial strains. Handbook of Bioremediation. , 625-637 (2021).
- Hossain, F., et al. Bioremediation potential of hydrocarbon degrading bacteria: isolation, characterization, and assessment. Saudi Journal of Biological Sciences. , (2021).
- Wongbunmak, A., Khiawjan, S., Suphantharika, M., Pongtharangkul, T. BTEX biodegradation by Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum W1 and its proposed BTEX biodegradation pathways. Scientific Reports. 10 (1), 17408 (2020).
- Bodor, A., et al. Challenges of unculturable bacteria: environmental perspectives. Reviews in Environmental Science and Bio/Technology. 19 (1), 1-22 (2020).
- Phale, P. S., Sharma, A., Gautam, K. Microbial degradation of xenobiotics like aromatic pollutants from the terrestrial environments. Pharmaceuticals and Personal Care Products: Waste Management and Treatment Technology. , 259-278 (2019).
- Brooijmans, R. J. W., Pastink, M. I., Siezen, R. J. Hydrocarbon-degrading bacteria: the oil-spill clean-up crew. Microbial Biotechnology. 2 (6), 587-594 (2009).
- Sorkhoh, N. A., Ghannoum, M. A., Ibrahim, A. S., Stretton, R. J., Radwan, S. S. Crude oil and hydrocarbon-degrading strains of Rhodococcus rhodochrous isolated from soil and marine environments in Kuwait. Environmental Pollution. 65 (1), 1-17 (1990).
- Chaillan, F., et al. Identification and biodegradation potential of tropical aerobic hydrocarbon-degrading microorganisms. Research in Microbiology. 155 (7), 587-595 (2004).
- Bôto, M. L., et al. Harnessing the potential of native microbial communities for bioremediation of oil spills in the Iberian Peninsula NW coast. Frontiers in Microbiology. 12, 879 (2021).
- Wang, Y., et al. A culture-independent approach to unravel uncultured bacteria and functional genes in a complex microbial community. PloS One. 7 (10), 47530 (2012).
- Jovel, J., et al. Characterization of the gut microbiome using 16S or shotgun metagenomics. Frontiers in Microbiology. 7, 459 (2016).
- Spini, G., et al. Molecular and microbiological insights on the enrichment procedures for the isolation of petroleum degrading bacteria and fungi. Frontiers in Microbiology. , 2543 (2018).
- Pightling, A. W., et al. Interpreting whole-genome sequence analyses of foodborne bacteria for regulatory applications and outbreak investigations. Frontiers in Microbiology. , 1482 (2018).
- Salipante, S. J., et al. Application of whole-genome sequencing for bacterial strain typing in molecular epidemiology. Journal of Clinical Microbiology. 53 (4), 1072-1079 (2015).
- Lovley, D. R. Cleaning up with genomics: applying molecular biology to bioremediation. Nature Reviews Microbiology. 1 (1), 35-44 (2003).
- Janda, J. M., Abbott, S. L. 16S rRNA gene sequencing for bacterial identification in the diagnostic laboratory: pluses, perils, and pitfalls. Journal of Clinical Microbiology. 45 (9), 2761-2764 (2007).
- Poindexter, J. S. Biological properties and classification of the Caulobacter group. Bacteriological Reviews. 28 (3), 231-295 (1964).
- Reasoner, D. J., Geldreich, E. A new medium for the enumeration and subculture of bacteria from potable water. Applied and Environmental Microbiology. 49 (1), 1-7 (1985).
- Pardee, A. B. The genetic control and cytoplasmic expression of “Inducibility” in the synthesis of β-galactosidase by E. coli. Journal of Molecular Biology. 1 (2), 165-178 (1959).
- Ely, B. Genetics of Caulobacter crescentus. Methods in Enzymology. 204, 372-384 (1991).
- R, C. Gram staining. Current Protocols in Microbiology. , (2005).
- Green, M. R., Hughes, H., Sambrook, J., MacCallum, P. Molecular cloning: a laboratory manual. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , 1890 (2012).
- Chauhan, D., Agrawal, G., Deshmukh, S., Roy, S. S., Priyadarshini, R. Biofilm formation by Exiguobacterium sp. DR11 and DR14 alter polystyrene surface properties and initiate biodegradation. RSC Advances. 8 (66), 37590-37599 (2018).
- Takeo, M., Nishimura, M., Shirai, M., Takahashi, H., Negoro, S. Purification and characterization of catechol 2,3-Dioxygenase from the aniline degradation pathway of Acinetobacter sp. YAA and its mutant enzyme, which resists substrate inhibition. Bioscience, Biotechnology, Biochemistry. 71, 70079-70080 (2007).
- Nguyen, O. T., Ha, D. D. Degradation of chlorotoluenes and chlorobenzenes by the dual-species biofilm of Comamonas testosteroni strain KT5 and Bacillus subtilis strain DKT. Annals of Microbiology. 69 (3), 267-277 (2019).
- Hupert-Kocurek, K., Guzik, U., Wojcieszyńska, D. Characterization of catechol 2, 3-dioxygenase from Planococcus sp. strain S5 induced by high phenol concentration. Acta Biochimica Polonica. 59 (3), (2012).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Peterson, G. L., et al. A simplification of the protein assay method of Lowry et al. which is more generally applicable. Analytical Biochemistry. 83 (2), 346-356 (1977).
- Chen, W. P., Kuo, T. T. A simple and rapid method for the preparation of gram-negative bacterial genomic DNA. Nucleic Acids Research. 21 (9), 2260 (1993).
- William, S., Feil, H., Copeland, A. Bacterial genomic DNA isolation using CTAB. Sigma. 50 (6876), (2012).
- Frank, J. A., et al. Critical evaluation of two primers commonly used for amplification of bacterial 16S rRNA genes. Applied and Environmental Microbiology. 74 (8), 2461-2470 (2008).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Johnson, M., et al. NCBI BLAST: a better web interface. Nucleic Acids Research. 36, 5-9 (2008).
- Harayama, S., Rekik, M. Bacterial aromatic ring-cleavage enzymes are classified into two different gene families. Journal of Biological Chemistry. 264 (26), 15328-15333 (1989).
- Li, X., et al. Efficiency of chemical versus mechanical disruption methods of DNA extraction for the identification of oral Gram-positive and Gram-negative bacteria. The Journal of International Medical Research. 48 (5), 300060520925594 (2020).
- Coico, R. Gram staining. Current Protocols in Microbiology. , (2005).
- Clarridge, J. E. III Impact of 16S rRNA gene sequence analysis for identification of bacteria on clinical microbiology and infectious diseases. Clinical Microbiology Reviews. 17 (4), 840 (2004).
- Dereeper, A., et al. Phylogeny. fr: robust phylogenetic analysis for the non-specialist. Nucleic Acids Research. 36, 465-469 (2008).
- Wadowsky, R. M., Wolford, R., McNamara, A. M., Yee, R. B. Effect of temperature, pH, and oxygen level on the multiplication of naturally occurring Legionella pneumophila in potable water. Applied and Environmental Microbiology. 49 (5), 1197-1205 (1985).
- du Toit, W. J., Pretorius, I. S., Lonvaud-Funel, A. The effect of sulphur dioxide and oxygen on the viability and culturability of a strain of Acetobacter pasteurianus and a strain of Brettanomyces bruxellensis isolated from wine. Journal of Applied Microbiology. 98 (4), 862-871 (2005).
- Johnson, J. S., et al. Evaluation of 16S rRNA gene sequencing for species and strain-level microbiome analysis. Nature Communications. 10 (1), 1-11 (2019).
- Kim, E., et al. Design of PCR assays to specifically detect and identify 37 Lactobacillus species in a single 96 well plate. BMC Microbiology. 20 (1), 1-14 (2020).
- Poretsky, R., Rodriguez-R, L. M., Luo, C., Tsementzi, D., Konstantinidis, K. T. Strengths and limitations of 16S rRNA gene amplicon sequencing in revealing temporal microbial community dynamics. PLoS ONE. 9 (4), (2014).
- Johnson, B. H., Hecht, M. H. Recombinant proteins can be isolated from E. coli cells by repeated cycles of freezing and thawing. Bio/Technology. 12 (12), 1357-1360 (1994).
- Rodríguez-Carmona, E., Cano-Garrido, O., Seras-Franzoso, J., Villaverde, A., García-Fruitós, E. Isolation of cell-free bacterial inclusion bodies. Microbial Cell Factories. 9 (1), 71 (2010).
- Hoiczyk, E., Hansel, A. Cyanobacterial cell walls: News from an unusual prokaryotic envelope. Journal of Bacteriology. 182 (5), 1191 (2000).
- Erstad, S. M., Sakuragi, Y. Easy and efficient permeabilization of cyanobacteria for in vivo enzyme assays using B-PER. Bio-Protocol. 8 (1), (2018).
