Sucul Habitatlardan Hidrokarbon Metabolize Edici Özelliğe Sahip Bakteri Türlerinin İzolasyonu, Çoğaltılması ve Tanımlanması
Summary
Hidrokarbon bozunan bakterileri sucul habitatlardan izole etme, çoğaltma ve karakterize etme sürecini sunuyoruz. Protokol, bakteri izolasyonunu, 16S rRNA yöntemiyle tanımlamayı ve hidrokarbon bozunma potansiyellerinin test edilmesini ana hatlarıyla belirtir. Bu makale, araştırmacıların çevresel örneklerde mikrobiyal biyoçeşitliliği karakterize etmelerine ve özellikle biyoremediasyon potansiyeli olan mikropları taramalarına yardımcı olacaktır.
Abstract
Hidrokarbon kirleticiler bozunmaya karşı inatçıdır ve çevrede birikmeleri tüm yaşam formları için toksiktir. Bakteriler çok sayıda katalitik enzimi kodlar ve doğal olarak hidrokarbonları metabolize edebilirler. Bilim adamları, biyolojik bozunma ve biyoremediasyon potansiyeli olan bakterileri izole etmek için su ekosistemlerindeki biyolojik çeşitlilikten yararlanır. Çevreden gelen bu tür izolatlar, bozunma sürecini endüstriyel ölçekte büyütmek için daha fazla kullanılabilecek zengin bir metabolik yol ve enzim seti sağlar. Bu makalede, bakteri türlerinin sucul habitatlardan izolasyonu, çoğaltılması ve tanımlanması ile ilgili genel süreci özetliyoruz ve basit teknikler kullanarak in vitro olarak hidrokarbonları tek karbon kaynağı olarak kullanma yeteneklerini inceliyoruz. Mevcut protokol, çeşitli bakteri türlerinin izolasyonunu ve daha sonra 16S rRNA analizi kullanılarak tanımlanmasını açıklamaktadır. Protokol ayrıca bakteri izolatlarının hidrokarbon bozunma potansiyelini karakterize etmek için adımlar sunar. Bu protokol, biyoteknolojik uygulamaları için bakteri türlerini çevresel habitatlardan izole etmeye çalışan araştırmacılar için faydalı olacaktır.
Introduction
Hidrokarbonlar (HC) hem yakıt olarak hem de kimyasal uygulamalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Benzen, toluen ve ksilen gibi aromatik hidrokarbonlar çözücü olarak yaygın olarak kullanılmaktadır1. Etilen ve propilen gibi alkenler, sırasıyla polietilen ve polipropilen polimerlerin sentezinde öncü olarak görev yapar. Başka bir hidrokarbonun polimerizasyonu olan stiren, polistiren oluşturur. Antropojenik faaliyetler, üretimleri ve nakliyeleri sırasında hidrokarbonları çevreye sokar. Toprağın ve suyun hidrokarbon kirliliği, çevre ve insan sağlığı için ciddi endişelere sahiptir. Mikroplar, biyojeokimyasal döngüleri düzenleyerek ve kirleticiler ve ksenobiyotikler de dahil olmak üzere çok çeşitli substratlar kullanarak, bunları karbon ve enerji kaynağına dönüştürerek ekosistemin korunmasında önemli bir rol oynamaktadır. Çevresel kirleticilerin mikroorganizmalar tarafından detoksifikasyon süreci, biyoremediasyon 3,4,5,6,7 olarak bilinir.
Hidrokarbonları parçalama kabiliyetine sahip mikroorganizmalar su ve toprak habitatlarında bulunur8,9,10. Pseudomonas, Acinetobacter, Rhodococcus, Marinobacter ve Oleibacter11 gibi alkanları ve aromatik HC’leri parçalama potansiyeline sahip birçok bakteri tanımlanmıştır. Teknolojik olarak gelişmiş kültürden bağımsız yaklaşımların geliştirilmesi, yeni HC parçalayıcı mikrobiyal toplulukların keşfedilmesine yardımcı olmuştur12. Kaynak örneklerden doğrudan izole edilen genomik materyal, Yeni Nesil Dizileme (NGS) gibi yüksek verimli yöntemlerle amplifiye edilir ve dizilenir, ardından analiz yapılır, bu da mikroorganizmaların yetiştirilmesi ihtiyacını ortadan kaldırır. Metagenom analizi gibi NGS yöntemleri pahalıdır ve amplifikasyon süreciyle ilgili dezavantajlardan muzdariptir13. Hidrokarbon parçalayıcı mikropların izolasyonunu hedefleyen seçici zenginleştirme kültürü14 gibi yetiştirme teknikleri, araştırmacıların bakteri izolatlarındaki metabolik yolları araştırmasına ve manipüle etmesine izin verdiği için hala yararlıdır.
Genomik DNA izolasyonu ve ardından genomik materyalin dizilimi, herhangi bir organizma hakkında değerli bilgiler ortaya çıkarır. Tüm genom dizilimi, antibiyotik direncini, potansiyel ilaç hedeflerini, virülans faktörlerini, taşıyıcıları, ksenobiyotik-metabolize edici enzimleri vb. kodlayan genlerin tanımlanmasına yardımcı olur15,16,17. 16SrRNA kodlayan genin diziliminin, bakteriyel filogeni tanımlamak için sağlam bir teknik olduğu kanıtlanmıştır. Gen dizisinin ve işlevinin yıllar boyunca korunması, onu bilinmeyen bakterileri tanımlamak ve bir izolatı en yakın türlerle karşılaştırmak için güvenilir bir araç haline getirir. Ek olarak, bu genin uzunluğu biyoinformatik analiz için optimumdur18. Tüm bu özellikler, evrensel primerler kullanılarak gen amplifikasyonunun kolaylığı ve gen dizileme teknolojisindeki gelişme ile birlikte, onu mikropların tanımlanması için altın bir standart haline getirmektedir.
Burada, çevresel örneklerden HC parçalama potansiyeline sahip ekilebilir mikroorganizmaları geri kazanmak için bir prosedür açıklıyoruz. Aşağıda açıklanan yöntem, HC parçalayıcı bakterilerin toplanmasını ve tanımlanmasını ana hatlarıyla belirtir ve beş bölüme ayrılmıştır: (1) su örneklerinden bakteri toplanması, (2) saf kültürlerin izolasyonu, (3) bakteri izolatlarının HC parçalama kapasitesinin araştırılması, (4) genomik DNA izolasyonu ve (5) 16S rRNA gen dizilimi ve BLAST analizine dayalı tanımlama. Bu prosedür, birçok farklı biyoteknolojik uygulama için bakterileri izole etmek üzere uyarlanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dünyadaki bakterilerin sadece yaklaşık% 1’inin laboratuvarda kolayca yetiştirilebileceği iyi bilinmektedir6. Ekilebilir bakteriler arasında bile, çoğu karakterize edilmeden kalır. Moleküler yöntemlerdeki gelişmeler, bakteri topluluklarının analiz ve değerlendirmesine yeni bir boyut kazandırmıştır. Bununla birlikte, bu tür tekniklerin sınırlamaları vardır, ancak kültür analizlerini gereksiz kılmaz. Bireysel bakteri türlerini izole etmek için saf kültür teknikleri, fiz…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Karthik Krishnan’a ve RP laboratuvarı üyelerine yararlı yorumları ve önerileri için teşekkür ederiz. DS, SNU-Doktora bursu ve Earthwatch Enstitüsü Hindistan Bursu tarafından desteklenmektedir. RP laboratuvarı, Shiv Nadar Üniversitesi’nden bir CSIR-EMR hibesi ve başlangıç fonları ile desteklenmektedir.
Materials
| Agarose | Sigma-Aldrich | A4718 | Gel electrophoresis |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Sigma-Aldrich | A9434 | Growth medium component |
| Ammonium sulphate | Sigma-Aldrich | A4418 | Growth medium component |
| Bacto-Agar | Millipore | 1016141000 | Solid media preparation |
| Calcium chloride (CaCl2) | MERCK | C4901-500G | Growth medium component |
| Catechol | Sigma-Aldrich | 135011 | Hydrocarbon degradation assay |
| Cetyltrimethylammonium bromide, CTAB | Sigma-Aldrich | H6269 | Genomic DNA Isolation |
| Chloroform | HIMEDIA | MB109 | Genomic DNA isolation |
| Disodium phosphate (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S5136 | Growth medium component |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | gDNA buffer component |
| Ferrous sulphate, heptahydrate (FeSO4.7H20) | Sigma-Aldrich | 215422 | Growth medium component |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | Growth medium component |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Growth medium component; Glycerol stocks |
| Isopropanol | HIMEDIA | MB063 | Genomic DNA isolation |
| LB Agar | Difco | 244520 | Growth medium |
| Luria-Bertani (LB) | Difco | 244620 | Growth medium |
| Magnesium sulphate (MgSO4) | MERCK | M2643 | Growth medium component |
| Manganese (II) sulfate monohydrate (MnSO4.H20) | Sigma-Aldrich | 221287 | Growth medium component |
| Nutrient Broth (NB) | Merck (Millipore) | 03856-500G | Growth medium |
| Peptone | Merck | 91249-500G | Growth medium component |
| Phenol | Sigma-Aldrich | P1037 | Genomic DNA isolation |
| Potassium phosphate, dibasic (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | P3786 | Growth medium component |
| Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791 | Growth medium component |
| Proteinase K | ThermoFisher Scientific | AM2546 | Genomic DNA isolation |
| QIAquick Gel Extraction kit | QIAGEN | 160016235 | DNA purification |
| QIAquick PCR Purification kit | QIAGEN | 163038783 | DNA purification |
| R2A Agar | Millipore | 1004160500 | Growth medium |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | BIO-RAD | 4006221 | Absorbance measurement |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | Genomic DNA isolation |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | Growth medium component |
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 | Genomic DNA isolation |
| Styrene | Sigma-Aldrich | S4972 | Styrene biodegradation |
| Taq DNA Polymerase | NEB | M0273X | 16s rRNA PCR |
| Tris-EDTA (TE) | Sigma-Aldrich | 93283 | Resuspension of genomic DNA |
| Tryptic Soy Broth (TSB) | Merck | 22092-500G | Growth medium |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625-1KG | Growth medium component |
| Zinc sulfate heptahydrate (ZnSO4.7H20) | Sigma-Aldrich | 221376 | Growth medium component |
References
- Sirotkin, A. V. Reproductive effects of oil-related environmental pollutants. Encyclopedia of Environmental Health. , 493-498 (2019).
- Li, C., Busquets, R., Campos, L. C. Assessment of microplastics in freshwater systems: A review. Science of The Total Environment. 707, 135578 (2020).
- Siddiqa, A., Faisal, M. Microbial degradation of organic pollutants using indigenous bacterial strains. Handbook of Bioremediation. , 625-637 (2021).
- Hossain, F., et al. Bioremediation potential of hydrocarbon degrading bacteria: isolation, characterization, and assessment. Saudi Journal of Biological Sciences. , (2021).
- Wongbunmak, A., Khiawjan, S., Suphantharika, M., Pongtharangkul, T. BTEX biodegradation by Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum W1 and its proposed BTEX biodegradation pathways. Scientific Reports. 10 (1), 17408 (2020).
- Bodor, A., et al. Challenges of unculturable bacteria: environmental perspectives. Reviews in Environmental Science and Bio/Technology. 19 (1), 1-22 (2020).
- Phale, P. S., Sharma, A., Gautam, K. Microbial degradation of xenobiotics like aromatic pollutants from the terrestrial environments. Pharmaceuticals and Personal Care Products: Waste Management and Treatment Technology. , 259-278 (2019).
- Brooijmans, R. J. W., Pastink, M. I., Siezen, R. J. Hydrocarbon-degrading bacteria: the oil-spill clean-up crew. Microbial Biotechnology. 2 (6), 587-594 (2009).
- Sorkhoh, N. A., Ghannoum, M. A., Ibrahim, A. S., Stretton, R. J., Radwan, S. S. Crude oil and hydrocarbon-degrading strains of Rhodococcus rhodochrous isolated from soil and marine environments in Kuwait. Environmental Pollution. 65 (1), 1-17 (1990).
- Chaillan, F., et al. Identification and biodegradation potential of tropical aerobic hydrocarbon-degrading microorganisms. Research in Microbiology. 155 (7), 587-595 (2004).
- Bôto, M. L., et al. Harnessing the potential of native microbial communities for bioremediation of oil spills in the Iberian Peninsula NW coast. Frontiers in Microbiology. 12, 879 (2021).
- Wang, Y., et al. A culture-independent approach to unravel uncultured bacteria and functional genes in a complex microbial community. PloS One. 7 (10), 47530 (2012).
- Jovel, J., et al. Characterization of the gut microbiome using 16S or shotgun metagenomics. Frontiers in Microbiology. 7, 459 (2016).
- Spini, G., et al. Molecular and microbiological insights on the enrichment procedures for the isolation of petroleum degrading bacteria and fungi. Frontiers in Microbiology. , 2543 (2018).
- Pightling, A. W., et al. Interpreting whole-genome sequence analyses of foodborne bacteria for regulatory applications and outbreak investigations. Frontiers in Microbiology. , 1482 (2018).
- Salipante, S. J., et al. Application of whole-genome sequencing for bacterial strain typing in molecular epidemiology. Journal of Clinical Microbiology. 53 (4), 1072-1079 (2015).
- Lovley, D. R. Cleaning up with genomics: applying molecular biology to bioremediation. Nature Reviews Microbiology. 1 (1), 35-44 (2003).
- Janda, J. M., Abbott, S. L. 16S rRNA gene sequencing for bacterial identification in the diagnostic laboratory: pluses, perils, and pitfalls. Journal of Clinical Microbiology. 45 (9), 2761-2764 (2007).
- Poindexter, J. S. Biological properties and classification of the Caulobacter group. Bacteriological Reviews. 28 (3), 231-295 (1964).
- Reasoner, D. J., Geldreich, E. A new medium for the enumeration and subculture of bacteria from potable water. Applied and Environmental Microbiology. 49 (1), 1-7 (1985).
- Pardee, A. B. The genetic control and cytoplasmic expression of “Inducibility” in the synthesis of β-galactosidase by E. coli. Journal of Molecular Biology. 1 (2), 165-178 (1959).
- Ely, B. Genetics of Caulobacter crescentus. Methods in Enzymology. 204, 372-384 (1991).
- R, C. Gram staining. Current Protocols in Microbiology. , (2005).
- Green, M. R., Hughes, H., Sambrook, J., MacCallum, P. Molecular cloning: a laboratory manual. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , 1890 (2012).
- Chauhan, D., Agrawal, G., Deshmukh, S., Roy, S. S., Priyadarshini, R. Biofilm formation by Exiguobacterium sp. DR11 and DR14 alter polystyrene surface properties and initiate biodegradation. RSC Advances. 8 (66), 37590-37599 (2018).
- Takeo, M., Nishimura, M., Shirai, M., Takahashi, H., Negoro, S. Purification and characterization of catechol 2,3-Dioxygenase from the aniline degradation pathway of Acinetobacter sp. YAA and its mutant enzyme, which resists substrate inhibition. Bioscience, Biotechnology, Biochemistry. 71, 70079-70080 (2007).
- Nguyen, O. T., Ha, D. D. Degradation of chlorotoluenes and chlorobenzenes by the dual-species biofilm of Comamonas testosteroni strain KT5 and Bacillus subtilis strain DKT. Annals of Microbiology. 69 (3), 267-277 (2019).
- Hupert-Kocurek, K., Guzik, U., Wojcieszyńska, D. Characterization of catechol 2, 3-dioxygenase from Planococcus sp. strain S5 induced by high phenol concentration. Acta Biochimica Polonica. 59 (3), (2012).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Peterson, G. L., et al. A simplification of the protein assay method of Lowry et al. which is more generally applicable. Analytical Biochemistry. 83 (2), 346-356 (1977).
- Chen, W. P., Kuo, T. T. A simple and rapid method for the preparation of gram-negative bacterial genomic DNA. Nucleic Acids Research. 21 (9), 2260 (1993).
- William, S., Feil, H., Copeland, A. Bacterial genomic DNA isolation using CTAB. Sigma. 50 (6876), (2012).
- Frank, J. A., et al. Critical evaluation of two primers commonly used for amplification of bacterial 16S rRNA genes. Applied and Environmental Microbiology. 74 (8), 2461-2470 (2008).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Johnson, M., et al. NCBI BLAST: a better web interface. Nucleic Acids Research. 36, 5-9 (2008).
- Harayama, S., Rekik, M. Bacterial aromatic ring-cleavage enzymes are classified into two different gene families. Journal of Biological Chemistry. 264 (26), 15328-15333 (1989).
- Li, X., et al. Efficiency of chemical versus mechanical disruption methods of DNA extraction for the identification of oral Gram-positive and Gram-negative bacteria. The Journal of International Medical Research. 48 (5), 300060520925594 (2020).
- Coico, R. Gram staining. Current Protocols in Microbiology. , (2005).
- Clarridge, J. E. III Impact of 16S rRNA gene sequence analysis for identification of bacteria on clinical microbiology and infectious diseases. Clinical Microbiology Reviews. 17 (4), 840 (2004).
- Dereeper, A., et al. Phylogeny. fr: robust phylogenetic analysis for the non-specialist. Nucleic Acids Research. 36, 465-469 (2008).
- Wadowsky, R. M., Wolford, R., McNamara, A. M., Yee, R. B. Effect of temperature, pH, and oxygen level on the multiplication of naturally occurring Legionella pneumophila in potable water. Applied and Environmental Microbiology. 49 (5), 1197-1205 (1985).
- du Toit, W. J., Pretorius, I. S., Lonvaud-Funel, A. The effect of sulphur dioxide and oxygen on the viability and culturability of a strain of Acetobacter pasteurianus and a strain of Brettanomyces bruxellensis isolated from wine. Journal of Applied Microbiology. 98 (4), 862-871 (2005).
- Johnson, J. S., et al. Evaluation of 16S rRNA gene sequencing for species and strain-level microbiome analysis. Nature Communications. 10 (1), 1-11 (2019).
- Kim, E., et al. Design of PCR assays to specifically detect and identify 37 Lactobacillus species in a single 96 well plate. BMC Microbiology. 20 (1), 1-14 (2020).
- Poretsky, R., Rodriguez-R, L. M., Luo, C., Tsementzi, D., Konstantinidis, K. T. Strengths and limitations of 16S rRNA gene amplicon sequencing in revealing temporal microbial community dynamics. PLoS ONE. 9 (4), (2014).
- Johnson, B. H., Hecht, M. H. Recombinant proteins can be isolated from E. coli cells by repeated cycles of freezing and thawing. Bio/Technology. 12 (12), 1357-1360 (1994).
- Rodríguez-Carmona, E., Cano-Garrido, O., Seras-Franzoso, J., Villaverde, A., García-Fruitós, E. Isolation of cell-free bacterial inclusion bodies. Microbial Cell Factories. 9 (1), 71 (2010).
- Hoiczyk, E., Hansel, A. Cyanobacterial cell walls: News from an unusual prokaryotic envelope. Journal of Bacteriology. 182 (5), 1191 (2000).
- Erstad, S. M., Sakuragi, Y. Easy and efficient permeabilization of cyanobacteria for in vivo enzyme assays using B-PER. Bio-Protocol. 8 (1), (2018).
