Isolement, propagation et identification d’espèces bactériennes ayant des propriétés métabolisant les hydrocarbures dans les habitats aquatiques
Summary
Nous présentons le processus d’isolement, de propagation et de caractérisation des bactéries dégradant les hydrocarbures des habitats aquatiques. Le protocole décrit l’isolement bactérien, l’identification par la méthode de l’ARNr 16S et le test de leur potentiel de dégradation des hydrocarbures. Cet article aiderait les chercheurs à caractériser la biodiversité microbienne dans les échantillons environnementaux, et plus particulièrement à dépister les microbes ayant un potentiel de biorestauration.
Abstract
Les polluants hydrocarbonés sont récalcitrants à la dégradation et leur accumulation dans l’environnement est toxique pour toutes les formes de vie. Les bactéries codent pour de nombreuses enzymes catalytiques et sont naturellement capables de métaboliser les hydrocarbures. Les scientifiques exploitent la biodiversité dans les écosystèmes aquatiques pour isoler les bactéries ayant un potentiel de biodégradation et de biorestauration. Ces isolats de l’environnement fournissent un riche ensemble de voies métaboliques et d’enzymes, qui peuvent être utilisées pour intensifier le processus de dégradation à l’échelle industrielle. Dans cet article, nous décrivons le processus général d’isolement, de propagation et d’identification des espèces bactériennes des habitats aquatiques et examinons leur capacité à utiliser les hydrocarbures comme seule source de carbone in vitro en utilisant des techniques simples. Le présent protocole décrit l’isolement de diverses espèces bactériennes et leur identification ultérieure à l’aide de l’analyse de l’ARNr 16S. Le protocole présente également des étapes pour caractériser le potentiel de dégradation des hydrocarbures des isolats bactériens. Ce protocole sera utile aux chercheurs qui tentent d’isoler des espèces bactériennes des habitats environnementaux pour leurs applications biotechnologiques.
Introduction
Les hydrocarbures (HC) sont largement utilisés à la fois comme combustibles et dans des applications chimiques. Les hydrocarbures aromatiques tels que le benzène, le toluène et le xylène sont largement utilisés comme solvants1. Les alcènes tels que l’éthylène et le propylène servent de précurseurs dans la synthèse des polymères de polyéthylène et de polypropylène, respectivement. Polymérisation d’un autre hydrocarbure, le styrène forme du polystyrène. Les activités anthropiques introduisent des hydrocarbures dans l’environnement au cours de leur production et de leur transport. La contamination des sols et de l’eau par les hydrocarbures est très préoccupante pour l’environnement et la santé humaine. Les microbes jouent un rôle majeur dans le maintien de l’écosystème en régulant les cycles biogéochimiques et en utilisant un large éventail de substrats, qui comprennent également des polluants et des xénobiotiques, les convertissant en carbone et en source d’énergie. Ce processus de détoxification des contaminants environnementaux par les micro-organismes est connu sous le nom de biorestauration 3,4,5,6,7.
On trouve des microorganismes capables de dégrader les hydrocarbures dans les habitats aquatiques et pédologiques 8,9,10. De nombreuses bactéries ayant le potentiel de dégrader les alcanes et les HC aromatiques ont été identifiées, telles que Pseudomonas, Acinetobacter, Rhodococcus, Marinobacter et Oleibacter11. Le développement d’approches technologiquement avancées indépendantes de la culture a permis de découvrir de nouvelles communautés microbiennes dégradant HC12. Le matériel génomique directement isolé des échantillons sources est amplifié et séquencé par des méthodes à haut débit telles que le séquençage de nouvelle génération (NGS) suivi d’une analyse éliminant le besoin de cultiver des micro-organismes. Les méthodes NGS, telles que l’analyse du métagénome, sont coûteuses et souffrent d’inconvénients liés au processus d’amplification13. Les techniques de culture telles que la culture d’enrichissement sélectif14 qui ciblent l’isolement des microbes dégradant les hydrocarbures sont toujours utiles car elles permettent aux chercheurs de sonder et de manipuler les voies métaboliques dans les isolats bactériens.
L’isolement de l’ADN génomique et le séquençage ultérieur du matériel génomique révèlent des informations précieuses sur tout organisme. Le séquençage du génome entier aide à identifier les gènes qui codent pour la résistance aux antibiotiques, les cibles médicamenteuses potentielles, les facteurs de virulence, les transporteurs, les enzymes métabolisant les xénobiotiques, etc.15,16,17. Le séquençage du gène codant pour l’ARN16Sr s’est avéré être une technique robuste pour identifier la phylogénie bactérienne. La conservation de la séquence et de la fonction des gènes au fil des ans en fait un outil fiable pour identifier les bactéries inconnues et comparer un isolat avec les espèces les plus proches. De plus, la longueur de ce gène est optimale pour l’analyse bioinformatique18. Toutes ces caractéristiques, ainsi que la facilité d’amplification des gènes à l’aide d’amorces universelles et l’amélioration de la technologie de séquençage des gènes, en font une référence en matière d’identification des microbes.
Ici, nous décrivons une procédure pour récupérer des micro-organismes cultivables ayant un potentiel de dégradation des HC à partir d’échantillons environnementaux. La méthode décrite ci-dessous décrit la collecte et l’identification des bactéries dégradant les HC et est divisée en cinq sections : (1) collecte de bactéries à partir d’échantillons d’eau, (2) isolement de cultures pures, (3) exploration de la capacité de dégradation des HC des isolats bactériens (4) isolement de l’ADN génomique et (5) identification basée sur le séquençage du gène de l’ARNr 16S et l’analyse BLAST. Cette procédure peut être adaptée pour isoler des bactéries pour de nombreuses applications biotechnologiques différentes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il est bien établi que seulement environ 1% des bactéries sur Terre peuvent être facilement cultivées en laboratoire6. Même parmi les bactéries cultivables, beaucoup restent non caractérisées. L’amélioration des méthodes moléculaires a donné une nouvelle dimension à l’analyse et à l’évaluation des communautés bactériennes. Cependant, ces techniques ont des limites, mais elles ne rendent pas les analyses de culture redondantes. Les techniques de culture pure pour isoler des e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le Dr Karthik Krishnan et les membres du laboratoire de RP pour leurs commentaires et suggestions utiles. DS est soutenu par la bourse SNU-Doctoral et la bourse Earthwatch Institute India. Le laboratoire RP est soutenu par une subvention CSIR-EMR et des fonds de démarrage de l’Université Shiv Nadar.
Materials
| Agarose | Sigma-Aldrich | A4718 | Gel electrophoresis |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Sigma-Aldrich | A9434 | Growth medium component |
| Ammonium sulphate | Sigma-Aldrich | A4418 | Growth medium component |
| Bacto-Agar | Millipore | 1016141000 | Solid media preparation |
| Calcium chloride (CaCl2) | MERCK | C4901-500G | Growth medium component |
| Catechol | Sigma-Aldrich | 135011 | Hydrocarbon degradation assay |
| Cetyltrimethylammonium bromide, CTAB | Sigma-Aldrich | H6269 | Genomic DNA Isolation |
| Chloroform | HIMEDIA | MB109 | Genomic DNA isolation |
| Disodium phosphate (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S5136 | Growth medium component |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | gDNA buffer component |
| Ferrous sulphate, heptahydrate (FeSO4.7H20) | Sigma-Aldrich | 215422 | Growth medium component |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | Growth medium component |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Growth medium component; Glycerol stocks |
| Isopropanol | HIMEDIA | MB063 | Genomic DNA isolation |
| LB Agar | Difco | 244520 | Growth medium |
| Luria-Bertani (LB) | Difco | 244620 | Growth medium |
| Magnesium sulphate (MgSO4) | MERCK | M2643 | Growth medium component |
| Manganese (II) sulfate monohydrate (MnSO4.H20) | Sigma-Aldrich | 221287 | Growth medium component |
| Nutrient Broth (NB) | Merck (Millipore) | 03856-500G | Growth medium |
| Peptone | Merck | 91249-500G | Growth medium component |
| Phenol | Sigma-Aldrich | P1037 | Genomic DNA isolation |
| Potassium phosphate, dibasic (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | P3786 | Growth medium component |
| Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791 | Growth medium component |
| Proteinase K | ThermoFisher Scientific | AM2546 | Genomic DNA isolation |
| QIAquick Gel Extraction kit | QIAGEN | 160016235 | DNA purification |
| QIAquick PCR Purification kit | QIAGEN | 163038783 | DNA purification |
| R2A Agar | Millipore | 1004160500 | Growth medium |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | BIO-RAD | 4006221 | Absorbance measurement |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | Genomic DNA isolation |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | Growth medium component |
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 | Genomic DNA isolation |
| Styrene | Sigma-Aldrich | S4972 | Styrene biodegradation |
| Taq DNA Polymerase | NEB | M0273X | 16s rRNA PCR |
| Tris-EDTA (TE) | Sigma-Aldrich | 93283 | Resuspension of genomic DNA |
| Tryptic Soy Broth (TSB) | Merck | 22092-500G | Growth medium |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625-1KG | Growth medium component |
| Zinc sulfate heptahydrate (ZnSO4.7H20) | Sigma-Aldrich | 221376 | Growth medium component |
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