Isolierung, Vermehrung und Identifizierung von Bakterienarten mit kohlenwasserstoffmetabolisierenden Eigenschaften aus aquatischen Lebensräumen

Kohlenwasserstoffe (HC) werden sowohl als Kraftstoffe als auch in chemischen Anwendungen in großem Umfang eingesetzt. Aromatische Kohlenwasserstoffe wie Benzol, Toluol und Xylol werden häufig als Lösungsmittel verwendet¹. Alkene wie Ethylen und Propylen dienen als Vorläufer bei der Synthese von Polyethylen- bzw. Polypropylenpolymeren. Durch die Polymerisation eines anderen Kohlenwasserstoffs, Styrol, entsteht Polystyrol. Anthropogene Aktivitäten bringen Kohlenwasserstoffe während ihrer Produktion und ihres Transports in die Umwelt ein. Die Kontamination von Boden und Wasser durch Kohlenwasserstoffe ist für die Umwelt und die menschliche Gesundheit sehr besorgniserregend. Mikroben spielen eine wichtige Rolle bei der Erhaltung des Ökosystems, indem sie die biogeochemischen Kreisläufe regulieren und eine breite Palette von Substraten, zu denen auch Schadstoffe und Xenobiotika gehören, nutzen und sie in Kohlenstoff und Energiequelle umwandeln. Dieser Prozess der Entgiftung von Umweltschadstoffen durch Mikroorganismen wird als Bioremediation 3,4,5,6,7 bezeichnet.

Mikroorganismen mit der Fähigkeit, Kohlenwasserstoffe abzubauen, kommen in aquatischen und bodenständigen Lebensräumen vor ^8,9,10. Es wurden viele Bakterien identifiziert, die das Potenzial haben, Alkane und aromatische HCs abzubauen, wie z. B. Pseudomonas, Acinetobacter, Rhodococcus, Marinobacter und Oleibacter¹¹. Die Entwicklung technologisch fortschrittlicher kulturunabhängiger Ansätze hat dazu beigetragen, neuartige HC-abbauende mikrobielle Gemeinschaften zu entdecken¹². Genomisches Material, das direkt aus Quellproben isoliert wurde, wird durch Hochdurchsatzmethoden wie Next Generation Sequencing (NGS) amplifiziert und sequenziert, gefolgt von einer Analyse, so dass keine Mikroorganismen kultiviert werden müssen. NGS-Methoden, wie z. B. die Metagenomanalyse, sind teuer und leiden unter Nachteilen im Zusammenhang mit dem Amplifikationsprozess¹³. Kultivierungstechniken wie die selektive Anreicherungskultur¹⁴, die auf die Isolierung von Kohlenwasserstoff-abbauenden Mikroben abzielen, sind nach wie vor nützlich, da sie es Forschern ermöglichen, Stoffwechselwege in Bakterienisolaten zu untersuchen und zu manipulieren.

Die genomische DNA-Isolierung und die anschließende Sequenzierung des genomischen Materials liefert wertvolle Informationen über jeden Organismus. Die Sequenzierung des gesamten Genoms hilft bei der Identifizierung von Genen, die für Antibiotikaresistenzen, potenzielle Wirkstoffziele, Virulenzfaktoren, Transporter, xenobiotische metabolisierende Enzyme usw. kodieren^15,16,17. Die Sequenzierung des 16SrRNA-kodierenden Gens hat sich als robuste Technik zur Identifizierung der bakteriellen Phylogenie erwiesen. Die Konservierung der Gensequenz und -funktion über die Jahre macht es zu einem zuverlässigen Werkzeug, um unbekannte Bakterien zu identifizieren und ein Isolat mit der nächstgelegenen Art zu vergleichen. Darüber hinaus ist die Länge dieses Gens optimal für die bioinformatische Analyse¹⁸. All diese Eigenschaften, zusammen mit der einfachen Genamplifikation mit universellen Primern und der Verbesserung der Gensequenzierungstechnologie, machen es zu einem Goldstandard für die Identifizierung von Mikroben.

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Rückgewinnung kultivierbarer Mikroorganismen mit HC-abbauendem Potenzial aus Umweltproben. Die im Folgenden beschriebene Methode beschreibt die Sammlung und Identifizierung von HC-abbauenden Bakterien und ist in fünf Abschnitte unterteilt: (1) Sammlung von Bakterien aus Wasserproben, (2) Isolierung von Reinkulturen, (3) Untersuchung der HC-abbauenden Fähigkeit von Bakterienisolaten, (4) genomische DNA-Isolierung und (5) Identifizierung auf der Grundlage von 16S rRNA-Gensequenzierung und BLAST-Analyse. Dieses Verfahren kann zur Isolierung von Bakterien für viele verschiedene biotechnologische Anwendungen angepasst werden.