عزل وتكاثر وتحديد الأنواع البكتيرية ذات خصائص استقلاب الهيدروكربون من الموائل المائية
Summary
نقدم عملية عزل وتكاثر وتوصيف البكتيريا المسببة للهيدروكربون من الموائل المائية. يحدد البروتوكول العزل البكتيري ، والتعرف عليه بطريقة 16S rRNA ، واختبار قدرتها على تحلل الهيدروكربونات. ستساعد هذه المقالة الباحثين في توصيف التنوع البيولوجي الميكروبي في العينات البيئية ، وعلى وجه التحديد فحص الميكروبات ذات إمكانات المعالجة البيولوجية.
Abstract
الملوثات الهيدروكربونية متمردة على التدهور وتراكمها في البيئة سام لجميع أشكال الحياة. تشفر البكتيريا العديد من الإنزيمات التحفيزية وهي قادرة بشكل طبيعي على استقلاب الهيدروكربونات. يسخر العلماء التنوع البيولوجي في النظم الإيكولوجية المائية لعزل البكتيريا ذات التحلل البيولوجي وإمكانية المعالجة البيولوجية. توفر هذه العزلات من البيئة مجموعة غنية من المسارات والإنزيمات الأيضية ، والتي يمكن استخدامها بشكل أكبر لتوسيع نطاق عملية التحلل على نطاق صناعي. في هذه المقالة ، نوضح العملية العامة لعزل الأنواع البكتيرية من الموائل المائية وانتشارها وتحديدها وفحص قدرتها على استخدام الهيدروكربونات كمصدر وحيد للكربون في المختبر باستخدام تقنيات بسيطة. يصف هذا البروتوكول عزل الأنواع البكتيرية المختلفة وتحديدها لاحقا باستخدام تحليل 16S rRNA. ويعرض البروتوكول أيضا خطوات لتوصيف العزلات البكتيرية لإمكانية تحلل الهيدروكربونات. سيكون هذا البروتوكول مفيدا للباحثين الذين يحاولون عزل الأنواع البكتيرية عن الموائل البيئية لتطبيقاتها في مجال التكنولوجيا الحيوية.
Introduction
تستخدم الهيدروكربونات (HC) على نطاق واسع كوقود وفي التطبيقات الكيميائية. تستخدم الهيدروكربونات العطرية مثل البنزين والتولوين والزيلين على نطاق واسع كمذيبات1. تعمل الألكينات مثل الإيثيلين والبروبيلين كسلائف في تخليق بوليمرات البولي إيثيلين والبولي بروبيلين ، على التوالي. بلمرة هيدروكربون آخر ، الستايرين يشكل البوليسترين. تدخل الأنشطة البشرية الهيدروكربونات في البيئة أثناء إنتاجها ونقلها. إن تلوث التربة والمياه بالهيدروكربون له مخاوف جدية على البيئة وصحة الإنسان. تلعب الميكروبات دورا رئيسيا في الحفاظ على النظام البيئي من خلال تنظيم الدورات البيوجيوكيميائية واستخدام مجموعة واسعة من الركائز ، والتي تشمل الملوثات و xenobiotics أيضا ، وتحويلها إلى مصدر للكربون والطاقة. تعرف عملية إزالة السموم من الملوثات البيئية بواسطة الكائنات الحية الدقيقة باسم المعالجة الحيوية3،4،5،6،7.
تم العثور على الكائنات الحية الدقيقة مع القدرة على تحلل الهيدروكربونات في الموائل المائية والتربة8،9،10. تم تحديد العديد من البكتيريا التي لديها القدرة على تحلل الألكانات وHCs العطرية ، مثل Pseudomonas و Acinetobacter و Rhodococcus و Marinobacter و Oleibacter11. ساعد تطوير مناهج متقدمة تقنيا مستقلة عن الثقافة في اكتشاف مجتمعات ميكروبية جديدة مهينةHC 12. يتم تضخيم المواد الجينومية المعزولة مباشرة من عينات المصدر وتسلسلها بطرق إنتاجية عالية مثل تسلسل الجيل التالي (NGS) متبوعا بالتحليل مما يلغي الحاجة إلى زراعة الكائنات الحية الدقيقة. طرق NGS ، مثل تحليل metagenome ، باهظة الثمن وتعاني من عيوب تتعلق بعملية التضخيم13. لا تزال تقنيات الزراعة مثل ثقافة التخصيب الانتقائي14 التي تستهدف عزل الميكروبات المهينة للهيدروكربونات مفيدة لأنها تسمح للباحثين بالتحقيق والتلاعب بالمسارات الأيضية في العزلات البكتيرية.
يكشف عزل الحمض النووي الجينومي والتسلسل اللاحق للمادة الجينومية عن معلومات قيمة عن أي كائن حي. يساعد تسلسل الجينوم الكامل في تحديد الجينات التي ترمز لمقاومة المضادات الحيوية ، وأهداف الأدوية المحتملة ، وعوامل الفوعة ، والناقلات ، وإنزيمات استقلاب الزينوبيوتيك ، إلخ15،16،17. ثبت أن تسلسل جين تشفير 16SrRNA هو تقنية قوية لتحديد السلالات البكتيرية. إن الحفاظ على تسلسل الجينات ووظيفتها على مر السنين يجعلها أداة موثوقة لتحديد البكتيريا غير المعروفة ومقارنة العزلة مع أقرب الأنواع. بالإضافة إلى ذلك ، فإن طول هذا الجين هو الأمثل لتحليل المعلوماتية الحيوية18. كل هذه الميزات إلى جانب سهولة تضخيم الجينات باستخدام الاشعال العالمية وتحسين تكنولوجيا تسلسل الجينات تجعلها معيارا ذهبيا لتحديد الميكروبات.
هنا ، نصف إجراء لاستعادة الكائنات الحية الدقيقة القابلة للزراعة مع إمكانية تحلل HC من العينات البيئية. توضح الطريقة الموضحة أدناه جمع وتحديد البكتيريا المهينة ل HC وتنقسم إلى خمسة أقسام: (1) جمع البكتيريا من عينات المياه ، (2) عزل الثقافات النقية ، (3) استكشاف قدرة تحلل HC للعزلات البكتيرية (4) عزل الحمض النووي الجينومي ، و (5) تحديد الهوية بناء على تسلسل جين 16S rRNA وتحليل BBLAST. يمكن تكييف هذا الإجراء لعزل البكتيريا للعديد من تطبيقات التكنولوجيا الحيوية المختلفة.
Protocol
Representative Results
Discussion
من الثابت أن ما يقرب من 1٪ فقط من البكتيريا على الأرض يمكن زراعتها بسهولة في المختبر6. حتى بين البكتيريا القابلة للزراعة ، لا يزال الكثير منها غير مميز. أعطت التحسينات في الأساليب الجزيئية بعدا جديدا لتحليل وتقييم المجتمعات البكتيرية. ومع ذلك ، فإن مثل هذه التقنيات لها قيود ، ل?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الدكتور كارثيك كريشنان وأعضاء مختبر RP على تعليقاتهم واقتراحاتهم المفيدة. يتم دعم DS من قبل زمالة SNU-PhD وزمالة معهد Earthwatch الهند. يتم دعم مختبر RP من خلال منحة CSIR-EMR وأموال بدء التشغيل من جامعة شيف نادار.
Materials
| Agarose | Sigma-Aldrich | A4718 | Gel electrophoresis |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Sigma-Aldrich | A9434 | Growth medium component |
| Ammonium sulphate | Sigma-Aldrich | A4418 | Growth medium component |
| Bacto-Agar | Millipore | 1016141000 | Solid media preparation |
| Calcium chloride (CaCl2) | MERCK | C4901-500G | Growth medium component |
| Catechol | Sigma-Aldrich | 135011 | Hydrocarbon degradation assay |
| Cetyltrimethylammonium bromide, CTAB | Sigma-Aldrich | H6269 | Genomic DNA Isolation |
| Chloroform | HIMEDIA | MB109 | Genomic DNA isolation |
| Disodium phosphate (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S5136 | Growth medium component |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | gDNA buffer component |
| Ferrous sulphate, heptahydrate (FeSO4.7H20) | Sigma-Aldrich | 215422 | Growth medium component |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | Growth medium component |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Growth medium component; Glycerol stocks |
| Isopropanol | HIMEDIA | MB063 | Genomic DNA isolation |
| LB Agar | Difco | 244520 | Growth medium |
| Luria-Bertani (LB) | Difco | 244620 | Growth medium |
| Magnesium sulphate (MgSO4) | MERCK | M2643 | Growth medium component |
| Manganese (II) sulfate monohydrate (MnSO4.H20) | Sigma-Aldrich | 221287 | Growth medium component |
| Nutrient Broth (NB) | Merck (Millipore) | 03856-500G | Growth medium |
| Peptone | Merck | 91249-500G | Growth medium component |
| Phenol | Sigma-Aldrich | P1037 | Genomic DNA isolation |
| Potassium phosphate, dibasic (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | P3786 | Growth medium component |
| Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791 | Growth medium component |
| Proteinase K | ThermoFisher Scientific | AM2546 | Genomic DNA isolation |
| QIAquick Gel Extraction kit | QIAGEN | 160016235 | DNA purification |
| QIAquick PCR Purification kit | QIAGEN | 163038783 | DNA purification |
| R2A Agar | Millipore | 1004160500 | Growth medium |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | BIO-RAD | 4006221 | Absorbance measurement |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | Genomic DNA isolation |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | Growth medium component |
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 | Genomic DNA isolation |
| Styrene | Sigma-Aldrich | S4972 | Styrene biodegradation |
| Taq DNA Polymerase | NEB | M0273X | 16s rRNA PCR |
| Tris-EDTA (TE) | Sigma-Aldrich | 93283 | Resuspension of genomic DNA |
| Tryptic Soy Broth (TSB) | Merck | 22092-500G | Growth medium |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625-1KG | Growth medium component |
| Zinc sulfate heptahydrate (ZnSO4.7H20) | Sigma-Aldrich | 221376 | Growth medium component |
References
- Sirotkin, A. V. Reproductive effects of oil-related environmental pollutants. Encyclopedia of Environmental Health. , 493-498 (2019).
- Li, C., Busquets, R., Campos, L. C. Assessment of microplastics in freshwater systems: A review. Science of The Total Environment. 707, 135578 (2020).
- Siddiqa, A., Faisal, M. Microbial degradation of organic pollutants using indigenous bacterial strains. Handbook of Bioremediation. , 625-637 (2021).
- Hossain, F., et al. Bioremediation potential of hydrocarbon degrading bacteria: isolation, characterization, and assessment. Saudi Journal of Biological Sciences. , (2021).
- Wongbunmak, A., Khiawjan, S., Suphantharika, M., Pongtharangkul, T. BTEX biodegradation by Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum W1 and its proposed BTEX biodegradation pathways. Scientific Reports. 10 (1), 17408 (2020).
- Bodor, A., et al. Challenges of unculturable bacteria: environmental perspectives. Reviews in Environmental Science and Bio/Technology. 19 (1), 1-22 (2020).
- Phale, P. S., Sharma, A., Gautam, K. Microbial degradation of xenobiotics like aromatic pollutants from the terrestrial environments. Pharmaceuticals and Personal Care Products: Waste Management and Treatment Technology. , 259-278 (2019).
- Brooijmans, R. J. W., Pastink, M. I., Siezen, R. J. Hydrocarbon-degrading bacteria: the oil-spill clean-up crew. Microbial Biotechnology. 2 (6), 587-594 (2009).
- Sorkhoh, N. A., Ghannoum, M. A., Ibrahim, A. S., Stretton, R. J., Radwan, S. S. Crude oil and hydrocarbon-degrading strains of Rhodococcus rhodochrous isolated from soil and marine environments in Kuwait. Environmental Pollution. 65 (1), 1-17 (1990).
- Chaillan, F., et al. Identification and biodegradation potential of tropical aerobic hydrocarbon-degrading microorganisms. Research in Microbiology. 155 (7), 587-595 (2004).
- Bôto, M. L., et al. Harnessing the potential of native microbial communities for bioremediation of oil spills in the Iberian Peninsula NW coast. Frontiers in Microbiology. 12, 879 (2021).
- Wang, Y., et al. A culture-independent approach to unravel uncultured bacteria and functional genes in a complex microbial community. PloS One. 7 (10), 47530 (2012).
- Jovel, J., et al. Characterization of the gut microbiome using 16S or shotgun metagenomics. Frontiers in Microbiology. 7, 459 (2016).
- Spini, G., et al. Molecular and microbiological insights on the enrichment procedures for the isolation of petroleum degrading bacteria and fungi. Frontiers in Microbiology. , 2543 (2018).
- Pightling, A. W., et al. Interpreting whole-genome sequence analyses of foodborne bacteria for regulatory applications and outbreak investigations. Frontiers in Microbiology. , 1482 (2018).
- Salipante, S. J., et al. Application of whole-genome sequencing for bacterial strain typing in molecular epidemiology. Journal of Clinical Microbiology. 53 (4), 1072-1079 (2015).
- Lovley, D. R. Cleaning up with genomics: applying molecular biology to bioremediation. Nature Reviews Microbiology. 1 (1), 35-44 (2003).
- Janda, J. M., Abbott, S. L. 16S rRNA gene sequencing for bacterial identification in the diagnostic laboratory: pluses, perils, and pitfalls. Journal of Clinical Microbiology. 45 (9), 2761-2764 (2007).
- Poindexter, J. S. Biological properties and classification of the Caulobacter group. Bacteriological Reviews. 28 (3), 231-295 (1964).
- Reasoner, D. J., Geldreich, E. A new medium for the enumeration and subculture of bacteria from potable water. Applied and Environmental Microbiology. 49 (1), 1-7 (1985).
- Pardee, A. B. The genetic control and cytoplasmic expression of “Inducibility” in the synthesis of β-galactosidase by E. coli. Journal of Molecular Biology. 1 (2), 165-178 (1959).
- Ely, B. Genetics of Caulobacter crescentus. Methods in Enzymology. 204, 372-384 (1991).
- R, C. Gram staining. Current Protocols in Microbiology. , (2005).
- Green, M. R., Hughes, H., Sambrook, J., MacCallum, P. Molecular cloning: a laboratory manual. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , 1890 (2012).
- Chauhan, D., Agrawal, G., Deshmukh, S., Roy, S. S., Priyadarshini, R. Biofilm formation by Exiguobacterium sp. DR11 and DR14 alter polystyrene surface properties and initiate biodegradation. RSC Advances. 8 (66), 37590-37599 (2018).
- Takeo, M., Nishimura, M., Shirai, M., Takahashi, H., Negoro, S. Purification and characterization of catechol 2,3-Dioxygenase from the aniline degradation pathway of Acinetobacter sp. YAA and its mutant enzyme, which resists substrate inhibition. Bioscience, Biotechnology, Biochemistry. 71, 70079-70080 (2007).
- Nguyen, O. T., Ha, D. D. Degradation of chlorotoluenes and chlorobenzenes by the dual-species biofilm of Comamonas testosteroni strain KT5 and Bacillus subtilis strain DKT. Annals of Microbiology. 69 (3), 267-277 (2019).
- Hupert-Kocurek, K., Guzik, U., Wojcieszyńska, D. Characterization of catechol 2, 3-dioxygenase from Planococcus sp. strain S5 induced by high phenol concentration. Acta Biochimica Polonica. 59 (3), (2012).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Peterson, G. L., et al. A simplification of the protein assay method of Lowry et al. which is more generally applicable. Analytical Biochemistry. 83 (2), 346-356 (1977).
- Chen, W. P., Kuo, T. T. A simple and rapid method for the preparation of gram-negative bacterial genomic DNA. Nucleic Acids Research. 21 (9), 2260 (1993).
- William, S., Feil, H., Copeland, A. Bacterial genomic DNA isolation using CTAB. Sigma. 50 (6876), (2012).
- Frank, J. A., et al. Critical evaluation of two primers commonly used for amplification of bacterial 16S rRNA genes. Applied and Environmental Microbiology. 74 (8), 2461-2470 (2008).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Johnson, M., et al. NCBI BLAST: a better web interface. Nucleic Acids Research. 36, 5-9 (2008).
- Harayama, S., Rekik, M. Bacterial aromatic ring-cleavage enzymes are classified into two different gene families. Journal of Biological Chemistry. 264 (26), 15328-15333 (1989).
- Li, X., et al. Efficiency of chemical versus mechanical disruption methods of DNA extraction for the identification of oral Gram-positive and Gram-negative bacteria. The Journal of International Medical Research. 48 (5), 300060520925594 (2020).
- Coico, R. Gram staining. Current Protocols in Microbiology. , (2005).
- Clarridge, J. E. III Impact of 16S rRNA gene sequence analysis for identification of bacteria on clinical microbiology and infectious diseases. Clinical Microbiology Reviews. 17 (4), 840 (2004).
- Dereeper, A., et al. Phylogeny. fr: robust phylogenetic analysis for the non-specialist. Nucleic Acids Research. 36, 465-469 (2008).
- Wadowsky, R. M., Wolford, R., McNamara, A. M., Yee, R. B. Effect of temperature, pH, and oxygen level on the multiplication of naturally occurring Legionella pneumophila in potable water. Applied and Environmental Microbiology. 49 (5), 1197-1205 (1985).
- du Toit, W. J., Pretorius, I. S., Lonvaud-Funel, A. The effect of sulphur dioxide and oxygen on the viability and culturability of a strain of Acetobacter pasteurianus and a strain of Brettanomyces bruxellensis isolated from wine. Journal of Applied Microbiology. 98 (4), 862-871 (2005).
- Johnson, J. S., et al. Evaluation of 16S rRNA gene sequencing for species and strain-level microbiome analysis. Nature Communications. 10 (1), 1-11 (2019).
- Kim, E., et al. Design of PCR assays to specifically detect and identify 37 Lactobacillus species in a single 96 well plate. BMC Microbiology. 20 (1), 1-14 (2020).
- Poretsky, R., Rodriguez-R, L. M., Luo, C., Tsementzi, D., Konstantinidis, K. T. Strengths and limitations of 16S rRNA gene amplicon sequencing in revealing temporal microbial community dynamics. PLoS ONE. 9 (4), (2014).
- Johnson, B. H., Hecht, M. H. Recombinant proteins can be isolated from E. coli cells by repeated cycles of freezing and thawing. Bio/Technology. 12 (12), 1357-1360 (1994).
- Rodríguez-Carmona, E., Cano-Garrido, O., Seras-Franzoso, J., Villaverde, A., García-Fruitós, E. Isolation of cell-free bacterial inclusion bodies. Microbial Cell Factories. 9 (1), 71 (2010).
- Hoiczyk, E., Hansel, A. Cyanobacterial cell walls: News from an unusual prokaryotic envelope. Journal of Bacteriology. 182 (5), 1191 (2000).
- Erstad, S. M., Sakuragi, Y. Easy and efficient permeabilization of cyanobacteria for in vivo enzyme assays using B-PER. Bio-Protocol. 8 (1), (2018).
