Kit de herramientas integradoras para analizar señales celulares: fuerzas, movimiento, morfología y fluorescencia

NOTA: Las muestras examinadas utilizando la plataforma iTACS son células adheridas a un sustrato blando. El protocolo para evaluar señales mecánicas y químicas se divide en dos partes secuenciales: Módulo de Adquisición y Capacitación (AcTrM) y Módulo de Análisis y Visualización (AnViM). 1. Módulo de Adquisición y Capacitación (AcTrM) NOTA: AcTrM automatiza el proceso de adquisición de datos y la autoformación del usuario. Antes de cualquier adquisición de datos, preparar un sustrato blando capaz de proporcionar la información necesaria para cuantificar las fuerzas que las células ejercen sobre él. Preparación de hidrogelNOTA: El objetivo aquí es preparar un módulo de cizallamiento de 1.250 Pa, un espesor aproximado de 100 μm y un hidrogel de poliacrilamida (PAA) de 22 mm de diámetro. Preparar la solución de poliacrilamida siguiendo el método de Yeung et al. y fundir los hidrogeles siguiendo los pasos descritos por Trepat et al.14,15. Una excepción al procedimiento es que las perlas incrustadas inmediatamente debajo de las células tienen 0,5 μm de diámetro y emiten fluorescencia amarilla. Omita el paso de unir cuentas de 2 μm a la cubierta si se espera que el área de visualización tenga una gran región libre de células.NOTA: El protocolo de preparación de hidrogel está ahora bastante establecido en el campo16. A lo largo de la descripción posterior, las cuentas de 0,5 μm se denominan «cuentas superiores», y las cuentas de 2 μm se denominan «cuentas inferiores». Sin embargo, las cuentas inferiores son opcionales cuando la región fotografiada contiene una gran área libre de celdas. El patrón de cuentas superior de tal región libre de células servirá para el propósito del patrón de cuentas inferior. Monte el hidrogel con perlas fluorescentes incrustadas en la etapa del microscopio. Permita 15-20 minutos para que la temperatura de la placa alcance un estado estacionario.NOTA: La superficie superior de la placa está funcionalizada con proteínas de la matriz extracelular, pero las células aún no están sembradas en el hidrogel. Adquisición de imágenes de referencia Parte 1: Creación de una lista de posicionesNOTA: La entrada manual en este paso incluye seguir las indicaciones de AcTrM para elegir ubicaciones con la mejor distribución de cuentas. En este paso no se utilizan archivos creados previamente. Las nuevas carpetas clave producidas en este paso incluyen las carpetas ‘t0imgs’, ‘tnimgs’ y ‘textfiles’, y el archivo producido incluye el archivo de lista de posiciones. Consulte la Figura 2 para obtener la descripción visual de los siguientes pasos que guían la creación de una lista de posiciones mediante AcTrM. El ejemplo demostrado adquiere datos a un aumento de 20x. Inicie μManager 2.0 – Beta. Ejecute AcTrM haciendo clic en el botón AcTrM.bsh en la ventana Recursos de IMBL . En la ventana titulada Definir propiedades de adquisición, seleccione el objetivo apropiado, la tolerancia para la precisión de la recuperación de la posición lateral (es decir, XY), el tamaño del paso de la operación de reenfoque aproximado y refinado (es decir, z) y el valor del coeficiente de correlación de imagen aceptable para la recuperación del enfoque.NOTA: Una tolerancia más fina para la recuperación de la posición lateral ralentizará la recuperación de la posición, pero una tolerancia sustancial necesitará corrección de posición durante el análisis de datos y puede causar dificultades en la recuperación del enfoque. Un tamaño de paso más pequeño ralentizará la operación de reenfoque, pero un tamaño de paso muy alto puede causar un movimiento rápido con oportunidades de perder el enfoque. En la ventana AcTrM – Paso 0 , seleccione Nueva adquisición para crear una lista de posiciones.NOTA: La ventana titulada AcTrM – Paso 1 enumera todos los pasos siguientes clave. Estos pasos implican mover el escenario, ajustar el enfoque y hacer clic en los botones del μManager. Estos pasos guían en la construcción de la lista de posiciones adecuadas para la adquisición de datos. Haga clic en Live in Micromanager para visualizar las muestras de ajustes manuales enumeradas en la ventana AcTrM – Paso 1 . Siga los pasos enumerados en esta ventana. Ahora adquiere la imagen de las cuentas. Seleccione el canal apropiado para las cuentas superiores. Asegúrese de mirar las cuentas inferiores también. Para hacerlo, seleccione los canales para las cuentas inferiores. Se ve una imagen borrosa de cuentas inferiores.NOTA: Los canales se pueden cambiar desde el menú desplegable preestablecido en la ventana principal de μManager. Si se utilizan las cuentas inferiores en el experimento, asegúrese de que estén presentes en la posición seleccionada. Estas cuentas aparecerán borrosas. Al seleccionar la posición adecuada, haga clic en Marcar en la ventana Lista de posiciones del escenario para guardar la posición.NOTA: La mejor posición se define por una distribución densa y uniforme de las cuentas superiores incrustadas inmediatamente debajo de la superficie superior (es decir, cuentas superiores) y al menos dos cuentas unidas al vidrio de la cubierta (es decir, cuentas inferiores) (Figura suplementaria S1). La recuperación del enfoque es más rápida si las cuentas inferiores aparecen como anillos grandes y desenfocados. Sin embargo, si los experimentos se realizan en una posición sin necesidad de enfoque o recuperación de posición lateral, ignore las instrucciones relacionadas con la imagen de las cuentas inferiores. Siga los pasos 6 a 9 descritos en la Figura 2 para incluir posiciones adicionales en la lista.NOTA: Elija algunas posiciones adicionales para que una ronda de eliminación pueda permitir las mejores posiciones elegidas en el plato. Parte 2: Adquisición de imágenes de referenciaNOTA: Este paso no implica ninguna entrada manual. Los archivos clave creados anteriormente utilizados en este paso incluyen ‘textfiles/*.pos’. Los nuevos archivos y carpetas clave producidos en este paso incluyen aquellos dentro de las carpetas ‘t0imgs’ y ‘tnimgs’. Consulte la Figura 3 y la Figura suplementaria S2 para obtener la descripción visual de los siguientes pasos que guían la adquisición de imágenes de referencia mediante AcTrM. La ventana AcTrM – Paso 2 también enumera todos los pasos clave. Siguiendo los pasos enumerados en la ventana AcTrM – Paso 2 , tome las decisiones en la ventana Adquisición multidimensional . Por ejemplo, para realizar un lapso de tiempo prolongado, indique el número de imágenes que se tomarán, seleccione el primer canal como canal de fase y, a continuación, seleccione el siguiente para las cuentas superiores y el siguiente para las cuentas inferiores. Haga clic en Cerrar en la ventana Adquisición multidimensional y luego haga clic en Aceptar en la ventana ActrM – Paso 2 . En la ventana AcTrM – Paso 3 , elija activar la recuperación de posición XYZ basada en imágenes de referencia. La elección es generalmente sí. Sin embargo, si las imágenes se adquieren en una posición sin espacio para el enfoque o la deriva del escenario, la elección en la ventana AcTrM – Paso 3 será No. En la ventana AcTrM – Opciones de recuperación XYZ , establezca el canal para la recuperación XYZ aproximada, si desea realizar la recuperación XYZ refinada, la región y el canal para la recuperación XYZ refinada y la dirección para comenzar el reenfoque (Figura suplementaria S4). Cuando se complete, AcTrM adquirirá imágenes de referencia.NOTA: Las opciones típicas para el canal serán el canal de cuentas inferior. La recuperación XYZ funciona mejor cuando se lleva a cabo con la imagen completa en la implementación actual. Las imágenes de referencia generalmente incluirán una imagen de luz transmitida del hidrogel, una imagen fluorescente de las cuentas superiores y una imagen fluorescente de las cuentas inferiores. El contenido de cada conjunto de imágenes puede variar en función de las elecciones realizadas en la ventana Adquisición multidimensional . Aún así, el software adquirirá el conjunto de imágenes de referencia en cada posición determinada en la Figura 2. Al final de este paso, se crean tres carpetas en el directorio elegido: ‘t0imgs’, ‘tnimgs’ y ‘textfiles’. La carpeta ‘t0imgs’ contiene imágenes de referencia en el formato reconocido por μManager y utilizado en pasos posteriores; La carpeta ‘tnimgs’ contiene imágenes TIFF separadas con nombres de archivo ‘c0_p0_t0.tif’, ‘c1_p0_t0.tif’, etc. Aquí, ‘c’ representa el canal, ‘p’ representa la posición y ‘t’ representa el tiempo. Después de estas letras están el número de canal, el número de posición y el número de marco, respectivamente. La carpeta ‘textfiles’ contiene la lista de posiciones en formato XML y las opciones del usuario para la adquisición de imágenes y la recuperación de posiciones. Siembra y crecimiento celularNOTA: La plataforma iTACS tiene la flexibilidad de acomodar los protocolos de preparación de muestras utilizados en la evaluación in vitro común del comportamiento mecánico de las células adherentes, incluidas las células dispersas, la monocapa totalmente confluente, el ensayo de formación de redes y las monocapas con agujeros o brechas significativas. Cultivo de células endoteliales microvasculares pulmonares de rata para confluir en un matraz17,18. Separe las células usando tripsina. Resuspendir las células en un medio de cultivo que contenga 10% de suero fetal bovino a una concentración de 1 x 106 células/ml. Coloque una gota de 5 μL de las células resuspendidas sobre una superficie de hidrogel parcialmente seca y colóquela en la incubadora de cultivo celular.NOTA: Después de 2 días en el medio de cultivo que contiene 10% de suero fetal bovino, las células en esa gota forman una isla abarrotada de células1. Adquisición automatizada de imágenes para el experimento restanteNOTA: La entrada manual para este paso incluye seguir las indicaciones de AcTrM para reanudar la adquisición de imágenes. Los archivos clave creados previamente utilizados por este paso incluyen ‘textfiles/*.pos’ y archivos de imagen de cuentas inferiores en la carpeta ‘t0imgs’. Los nuevos archivos clave producidos en este paso incluyen archivos de lista de posición actualizados e imágenes ‘tnimgs / * _t * .tif’. Asegúrese de que el sistema de control ambiental del microscopio alcance condiciones estables de cultivo de tejidos. Monte suavemente la placa que contiene las células cultivadas en la etapa del microscopio. Permita 15-20 min para que la temperatura y la humedad se estabilicen.Nota : consulte la figura 4 para obtener la descripción visual de los siguientes pasos que guían la adquisición de imágenes para el experimento restante mediante AcTrM. Inicie μManager 2.0 – Beta. Ejecute AcTrM haciendo clic en el botón AcTrM.bsh en la ventana Recursos de IMBL .Nota : omita las opciones realizadas en la ventana Definir propiedades de adquisición , pero utilice las opciones realizadas en el paso anterior. En la ventana AcTrM – Paso 0 , seleccione Continuar adquisición en pausa. Seleccione la ampliación y el directorio identificados en la ventana Adquisición multidimensional en el paso anterior donde se guardaron las carpetas de datos (‘t0imags’, ‘tnimgs’ y ‘textfiles’).Nota : el título de la ventana guía al usuario para elegir el directorio apropiado. En la ventana Reposicionamiento de la placa , seleccione opciones para reposicionar la placa (tres posiciones no colineales) junto con el canal utilizado para el reposicionamiento.NOTA: Las imágenes guardadas se verán en la cámara. Si las imágenes superpuestas se muestran como una imagen en color rojo, verde y negro, realice un ajuste manual. Haga clic en Aceptar para continuar con la adquisición.NOTA: Este paso supera los ligeros cambios de la irreproducibilidad de la alineación de la placa cuando la placa se vuelve a montar en la etapa del microscopio. Siga las indicaciones de AcTrM para acelerar la alineación en cada una de las tres posiciones mostrando una imagen compuesta de la imagen de referencia que se muestra en rojo (generalmente de las cuentas inferiores) y la imagen observada actualmente a través del objetivo que se muestra en verde. Obtener el verde lo suficientemente cerca del rojo deja menos trabajo para el software. Cuando la superposición es perfecta, la imagen compuesta aparece amarilla y negra. Lo suficientemente cerca es típicamente cuando las mismas cuentas inferiores son visibles tanto en imágenes rojas como verdes, y los correspondientes anillos rojos y verdes desenfocados se tocan entre sí. Una vez completado el reposicionamiento de la placa, AcTrM lleva el escenario a cada posición seleccionada y recupera la posición XYZ haciendo coincidir la imagen de referencia con lo que se ve actualmente a través de la cámara. La primera posición lateral (XY) coincide, y luego el enfoque (Z) se hace coincidir. La recuperación aproximada es seguida por una recuperación refinada de la posición y el enfoque. Las actualizaciones del estado actual del experimento se muestran en la pantalla a través de una ventana de cuatro partes que se muestra en la Figura suplementaria S3. Las imágenes adquiridas se guardan en la carpeta ‘tnimgs’ después de ‘*_t1.tif’, ‘*_t2.tif’, indicando el recuento de tiempo para el conjunto de imágenes. Si la recuperación XYZ identifica una posición actualizada, la nueva lista de posiciones se genera y se guarda en la carpeta ‘textfiles’. 2. Módulo de Análisis y Visualización (AnViM) Configuración del análisis automatizado de datosNOTA: La entrada manual en este paso incluye la identificación de la ubicación de la carpeta ‘tnimgs’. Los archivos clave creados previamente utilizados en este paso incluyen ‘tnimgs/*.tif’. Los nuevos archivos y carpetas clave producidos en este paso incluyen la carpeta ‘análisis’ en la misma carpeta principal que ‘tnimgs’ y carpetas para cada posición ‘analysis/p*’. Dentro de cada ‘análisis/p*’, este paso crea nuevos archivos de imagen ‘*.tif’ dentro de las carpetas ‘phs’ y ‘tny’. Estas imágenes son imágenes recortadas y desviadas de células y cuentas superiores. Los otros archivos creados incluyen ‘analysis/analysisChoices.txt’ que enumera las opciones de análisis, ‘analysis/p*/skipAnalysis.txt’, que enumera los casos en los que se omite el análisis debido a una deriva preexistente significativa, y ‘analysis/p*/part_shift_values_pixel_degree.dat’ que enumera los valores estimados de deriva. AnViM no altera los datos sin procesar en la carpeta ‘tnimgs’. Consulte la Figura 5 para obtener la descripción visual de los siguientes pasos que guían la configuración del análisis automatizado de datos mediante AnViM. Inicie el software de Fiji y seleccione la primera opción en el menú desplegable MSM etiquetado como MSM – preprocesamiento. Utilizando el cuadro de diálogo del explorador de archivos, seleccione la carpeta que contiene la carpeta ‘tnimgs’, que contiene los datos analizados. Defina el canal para las imágenes. Siguiendo las directrices de la Figura Suplementaria S5, identifique los números de canal de la imagen de luz transmitida de las celdas (imagen de contraste de fase de las celdas), imagen de cuentas inferiores e imagen de cuentas superiores. Las siguientes tres casillas de verificación (‘Mover archivos a la carpeta de posición’, ‘Hacer corrección adicional para el movimiento rígido’ y ‘Recortar datos y guardar en la carpeta de posición’) suelen estar marcadas. Finalmente, defina la tolerancia para rechazar datos muy desviados, tamaño de píxel y lados de la imagen donde se cruzan las celdas. Responda al mensaje para mejorar el brillo y el contraste de las imágenes de cuentas inferiores para que las cuentas aparezcan de manera prominente. Ajuste esto usando la barra deslizante en el menú y haga clic en Aceptar. Ahora realice la corrección de posición para deshacerse de los turnos, si los hay. Una vez hecho esto, se crea una carpeta de análisis.NOTA: La mejora del contraste normalmente no es necesaria, pero esta disposición está disponible para experimentos en los que es necesario minimizar la exposición a los láseres. Después de esa elección, AnViM copia los archivos de la carpeta ‘tnimgs’ a la carpeta ‘análisis’. Los archivos correspondientes a cada posición se guardan en las carpetas ‘analysis/p0, analysis/p1’, etc. Dentro de cada una de estas carpetas de posición, AnViM crea carpetas ‘cels’, ‘defs’ y ‘refs’ que contienen la imagen de luz transmitida original, las imágenes de cuentas superiores y las imágenes de cuentas inferiores, respectivamente (Figura suplementaria S6). AnViM luego analiza el movimiento rígido en las imágenes de las cuentas inferiores y crea una carpeta ‘phs’ que contiene una imagen de luz transmitida corregida de las celdas y una carpeta ‘tny’ que contiene imágenes actualizadas de cuentas superiores. Finalmente, las opciones del usuario de los canales, las operaciones, la tolerancia, el tamaño de píxel y el cruce de límites se guardan en el archivo ‘analysisChoices.txt’ (Figura suplementaria S6). Cuantificación de la deformación de hidrogel y monocapaNOTA: Es importante tener en cuenta que la cuantificación del movimiento a partir de una secuencia de imágenes es un campo en rápida evolución19. La tecnología se optimiza constantemente para las características, incluida la velocidad, la precisión, las características específicas dentro de las imágenes en bruto y los patrones de deformación específicos. Por lo tanto, es probable que algunos usuarios puedan utilizar un enfoque de cuantificación de deformación diferente al que se presenta aquí. Parte 1: Cuantificación de la deformación del hidrogelNOTA: Las entradas manuales en este paso incluyen la identificación del directorio de datos y la selección de la resolución de la cuadrícula. Los archivos clave creados previamente utilizados en este paso incluyen ‘p*/tny/*.tif’. Los nuevos archivos clave producidos en esto incluyen ‘p * / desplazamiento / * _disp.dat’ que enumera los vectores de desplazamiento de la superficie superior del hidrogel. Consulte la Figura 6 para obtener la descripción visual de los siguientes pasos para participar, a través de AnViM, en el análisis de velocimetría de imágenes de partículas en las imágenes de cuentas superiores20. Inicie el software de Fiji y, en el menú desplegable de MSM , seleccione MSM – Deformación en gel. Desde aquí, seleccione la opción que sea adecuada para el experimento. Utilizando el cuadro de diálogo del explorador de archivos, seleccione el directorio principal de la carpeta ‘análisis’ que contiene los datos analizados. En la ventana Parámetros para calcular la deformación del gel , seleccione el tamaño de ventana de correlación cruzada, el nivel de ruido y el umbral adecuados (Figura suplementaria S7)20.NOTA: Los resultados se guardan en un directorio de ‘desplazamiento’ recién creado dentro de cada carpeta de posición ‘análisis/p0, análisis/p1’, etc. Aquí es donde se almacenan todos los archivos de salida. Parte 2: Cuantificación de la deformación monocapaNOTA: Las entradas manuales en este paso incluyen la identificación del directorio de datos y la selección de la resolución de la cuadrícula. Los archivos clave creados previamente utilizados en este paso incluyen ‘p*/tny/*.tif’. Los nuevos archivos clave producidos en esto incluyen ‘p * / velocidad / * _vel.dat’ que enumera los vectores de movimiento de las células. Consulte la Figura 7 para obtener la descripción visual de los pasos para activar, a través de AnViM, el análisis de velocimetría de imagen de partículas en las imágenes de cuentas superiores20. El procedimiento es similar al seguido para cuantificar la deformación del hidrogel y selecciona MSM – Cellular Motion en el menú desplegable MSM . Los resultados se guardan en un directorio de ‘velocidad’ recién creado dentro de cada carpeta de posición ‘analysis/p0’, ‘analysis/p1’, etc. Cuantificación de las fuerzas célula-ECM y célula-célulaNOTA: La entrada manual en este paso incluye la identificación del directorio de datos, la indicación de la rigidez del hidrogel y la respuesta a las solicitudes de segmentación de clústeres celulares para detectar células de la región sin células. Los archivos clave creados previamente utilizados en este paso incluyen ‘p*/displacement/*_disp.dat’. Los nuevos archivos clave producidos en este paso incluyen: ‘p*/traction/*_trac.dat’, que enumera las fuerzas ejercidas por las células sobre el hidrogel; «p*/traction/*_domain.dat», que enumera la ubicación de los puntos de la cuadrícula que contienen celdas; y los archivos de entrada ‘p*/traction.in, p*/clusterInput.txt’ y ‘p*/prestress.in’ que registran las opciones del usuario para este paso. Tras la primera evaluación cuantitativa de la ECM celular y de las fuerzas célula-célula, se han desarrollado varias variaciones de la técnica1,15. Las variaciones se centran en casos particulares de sustratos, células, condiciones experimentales o herramientas numéricas7,8,21,22. Consulte la Figura 8 para la descripción visual que se realizará a través de AnViM, la microscopía de tracción por transformada de Fourier y el análisis de microscopía de esfuerzo monocapa en los datos de deformación del hidrogel1,2,15. Inicie el software de Fiji y, en el menú desplegable MSM , seleccione MSM – Cell-ECM y Cell-Cell Forces (tercera opción en el menú desplegable). Utilizando el cuadro de diálogo del explorador de archivos, seleccione el directorio principal de la carpeta ‘análisis’ que contiene las carpetas ‘tnimgs’ y ‘análisis’ que contienen los datos analizados. Haga clic en Seleccionar. En la ventana Parámetros para calcular fuerzas celulares , introduzca el módulo de cizallamiento, el grosor del hidrogel y el nivel de ruido previsto. Seleccione Aceptar. Esto le permite ejecutar la tracción a través de la función MATLAB.NOTA: Después de estas entradas, AnViM calcula las fuerzas de celda-ECM. Después de eso, indique si la monocapa es confluente. Si toda la imagen de la celda está cubierta de células, entonces la respuesta es Sí. En ese caso, las fuerzas célula-célula se calcularán en todo el marco. Por otro lado, si una parte de la imagen no tiene celdas, entonces la respuesta es No. En ese caso, siga las indicaciones de AnViM para facilitar la segmentación de la región de la imagen que contiene las celdas. Si la respuesta es no, dibuje manualmente un polígono alrededor del objeto que no es de celda cuando el software se lo solicite y, a continuación, seleccione un método o métodos apropiados para la segmentación. El software le pedirá el color (blanco o negro) de las celdas. Marque la opción Rellenar puntos automáticamente en el software y haga clic en Aceptar.NOTA: Los pasos para segmentar una monocapa no confluente se tratarán en la primera parte de la sección 2.4. Las fuerzas de Cell-ECM se almacenan en archivos ‘*_trac.dat’ en un directorio recién creado ‘traction’ dentro de cada carpeta de posición, y la entrada al software de cálculo de fuerza cell-ECM se guarda en el archivo ‘traction.in’ (Figura suplementaria S8). Las fuerzas celda-celda se almacenan en archivos ‘*_prestress.dat’ en un directorio recién creado ‘prestress’ dentro de cada carpeta de posición, y la entrada al software de cálculo de fuerza celda-celda se guarda en el archivo ‘prestress.in’ (Figura suplementaria S9). Asignación de valores de puntos de cuadrícula en celdas individualesNOTA: Uno de los enfoques actuales de iTACS es introducir un enfoque directo para interpretar las señales mecánicas medidas en el campo. Este enfoque es beneficioso para examinar las interacciones mecánicas entre las células vecinas de un grupo.18. En general, las propiedades cuantificadas hasta ahora se encuentran en puntos de cuadrícula espaciados regularmente a través del clúster celular. Estos datos identifican la mediana, la media y la desviación estándar de las propiedades seleccionadas dentro del límite morfológico de las células individuales y las asignan como propiedades/ señales físicas celulares. A partir de estos, la desviación estándar se utiliza para indicar la variabilidad, la diferencia entre la media y la mediana se utiliza para indicar la naturaleza de la distribución, y el valor medio se utiliza para indicar el estado general de las celdas para las propiedades seleccionadas.Parte 1: Segmentación de la región de la imagen que contiene celdasNOTA: La entrada manual a este paso incluye la identificación del directorio de datos y la respuesta a las solicitudes de segmentación para detectar celdas de la región sin celdas. Los archivos clave creados previamente utilizados en este paso incluyen ‘p*/phs/*.tif’. Los nuevos archivos clave producidos en este paso incluyen ‘p*/phs/bwImages/*.tif’, que son imágenes binarias que separan las regiones celulares de las regiones sin células, ‘p*/phs/textResults/frameNum_percentHealed.txt’, que enumera el porcentaje de área de imagen cubierta por celdas en cada instancia, y ‘p*/clusterInput.txt’, que registra las elecciones de usuario ingresadas en la interfaz AcTrM. Consulte la figura 9 para obtener la descripción visual de los pasos siguientes para segmentar la región de la imagen que contiene celdas. Esta parte debe completarse antes de calcular las fuerzas célula-célula. En ese caso, no es necesario repetir estos pasos. Además, si estos pasos se llevan a cabo antes de los cálculos de fuerza celda-celda, no se solicitan al principio de los cálculos de fuerza. Inicie el software de Fiji y, en el menú desplegable de MSM , seleccione Segmentación – Clúster celular. Utilizando el cuadro de diálogo del explorador de archivos, seleccione el directorio de posición ‘analysis/p0’, ‘analysis/p1’, etc., que contiene propiedades cuantificadas en puntos de cuadrícula espaciados regularmente. Indique si la monocapa es confluente.NOTA: Los pasos siguientes se invocan solo cuando la monocapa no es confluente. Siga las indicaciones de AnViM para aplicar el novedoso enfoque multifacético para identificar las regiones de imagen que contienen celdas. El proceso involucra cuatro métodos, cada uno de los cuales aborda la segmentación de una manera diferente. Uno o varios de estos métodos utilizados en combinación cubren una amplia variedad de imágenes de las células. Por lo tanto, pruebe diferentes enfoques para encontrar qué combinación funciona mejor para sus datos. Ajuste el ‘Factor de conexión de dominio’ y el ‘Factor de frotis’ para obtener una segmentación óptima.NOTA: El ‘Factor de frotis’ hace que las regiones que contienen células sean más grandes. Indique si las celdas aparecen en blanco o negro en la imagen binaria. En la ventana Instrucciones para limpiar la imagen de límite , elija si desea limpiar la imagen de forma automática o manual.NOTA: Las características no deseadas de las imágenes son puntos negros en los píxeles ocupados por las celdas y manchas blancas en los píxeles desconectados del grupo de celdas que se va a analizar. El análisis solo se puede hacer en las regiones que están conectadas. Por lo tanto, varias regiones desconectadas deben analizarse por separado. Parte 2: Segmentación de las células individuales en las imágenesNOTA: Las entradas manuales a este paso incluyen la identificación del directorio de datos y la respuesta a las solicitudes de segmentación para detectar celdas individuales dentro de la imagen. Los archivos clave creados previamente utilizados en este paso incluyen ‘p*/phs/*.tif’ y ‘p*/phs/bwImages/*.tif’. Los nuevos archivos clave producidos incluyen ‘p*/phs/textResults/*.csv’, que contienen propiedades morfológicas celulares. Consulte la Figura 10 para obtener la descripción visual de los siguientes pasos para segmentar celdas individuales de la monocapa. Inicie el software de Fiji y, en el menú desplegable de MSM , seleccione Segmentación – Celdas individuales. Utilizando el cuadro de diálogo del explorador de archivos, seleccione el directorio de posición ‘analysis/p0’, ‘analysis/p1’, etc., que contiene propiedades cuantificadas en puntos de cuadrícula espaciados regularmente. En la ventana Elegir los parámetros de entrada , indique la relación de aspecto máxima, la prominencia de cuánto se destaca el centro de celdas en comparación con el límite de la celda y dos parámetros de desenfoque para guiar la detección de las celdas (Figura suplementaria S10). En la pila de imágenes para cada posición, dibuje un polígono en la celda normal más pequeña. Esto se utiliza para calcular el área. Cualquier cosa más pequeña que esto no será considerada como una celda por el software. A continuación, dibuje un polígono alrededor de la celda normal más grande e indique si el centro celular o la interfaz celda-celda es más brillante.NOTA: AnViM crea archivos ‘phs/textResults/0001.csv’, ‘phs/textResults/0002.csv’, etc., para cada fotograma que contiene información sobre las celdas dentro de ese marco. En esta etapa, este archivo incluye información morfológica sobre las células, incluyendo área, centroide, perímetro, orientación, circularidad, relación de aspecto, redondez, solidez, distancia de la región sin células. La unidad de longitud en estas propiedades es píxeles y el ángulo está en grados. Finalmente, este archivo se actualiza para contener la intensidad, el movimiento y las fuerzas de los píxeles celulares en los pasos siguientes. Parte 3: Mapeo de las intensidades de píxeles en las celdasNOTA: Las entradas manuales en este paso incluyen la identificación del directorio de datos y la selección de propiedades y parámetros de asignación. Los archivos clave creados previamente utilizados en este paso incluyen ‘p*/phs/*.tif’ (o ‘p*/fluo/*.tif ‘) y ‘p*/phs/bwImages/*.tif’. Los nuevos archivos clave producidos en este paso incluyen ‘p*/phs/textResults/*.csv’, que enumera las propiedades morfológicas celulares. Consulte la Figura 11 para obtener la descripción visual de los siguientes pasos para evaluar las intensidades de píxeles en la región abarcada por celdas individuales y su región vecina y definirlas como propiedades de las celdas. Inicie el software fiji y, en el menú desplegable MSM , seleccione Mapa en celdas – Intensidades. Utilizando el cuadro de diálogo del explorador de archivos, seleccione el directorio de posición ‘analysis/p0’, ‘analysis/p1’, etc., que contiene propiedades cuantificadas en puntos de cuadrícula espaciados regularmente. Seleccione Detectar división celular o Cuantificar fluorescencia celular cuando el software se lo solicite. Defina el tamaño de la región vecina. Marque las casillas Recopilar propiedades de la región vecina y Recopilar propiedades de las celdas. Haga clic en Aceptar. En la ventana Propósito del registro de la intensidad celular, indique qué tipo de imagen se utilizará para el mapeo de intensidad, el tamaño de la región vecina y si se recopilan datos para celdas individuales o ambas celdas y sus regiones vecinas (Figura suplementaria S11).NOTA: El mapeo de las intensidades de píxeles de una imagen de contraste de fase permite la detección de eventos de división celular. El mapeo de intensidades de imagen fluorescente permitirá la detección de fluctuaciones en las moléculas citoplasmáticas marcadas fluorescentemente. La salida de los pasos anteriores es la media, la mediana, la desviación estándar, el mínimo y el máximo de los valores de intensidad de píxeles para celdas individuales. Estos números se introducen como nuevas columnas en los archivos ‘phs/textResults/0001.csv’, ‘phs/textResults/0002.csv’, etc. Parte 4: Mapeo de las fuerzas y el movimiento en las célulasNOTA: Las entradas manuales a este paso incluyen la identificación del directorio de datos y la selección de propiedades y parámetros de asignación. Los archivos clave creados previamente utilizados en este paso incluyen ‘p*/phs/textResults/*.csv’, ‘p*/velocity/*_vel.dat’, ‘p*/displacement/*_disp.dat’, ‘p*/traction/*_trac.dat’, ‘p*/prestress/*_prestress.dat’ y ‘p*/phs/bwImages/*.tif ‘. No se crean nuevos archivos durante este paso. En su lugar, la nueva información (fuerza celular y propiedades de movimiento) se agrega a los archivos ‘p*/phs/textResults/*.csv ‘. Consulte la Figura 12 para la descripción visual de los pasos para evaluar las fuerzas y el movimiento en la región abarcada por las células individuales y su región vecina y definirlos como propiedades de las células. Elija en el menú desplegable MSM Mapa de celdas – Datos de movimiento/fuerza (Figura suplementaria S12). A continuación, siga los pasos enumerados en el paso 2.4.3.NOTA: Se añaden nuevas columnas a los archivos ‘phs/textResults/0001.csv’, ‘phs/textResults/0002.csv’, etc. e incluyen la media, mediana y desviación estándar de la velocidad, la orientación de la velocidad, la tensión citoesquelética media, la anisotropía de tensión, la energía de deformación en el hidrogel, la orientación de la tensión más alta y la magnitud de la tracción célula-ECM (Figura suplementaria S13). Visualización de resultados Parte 1: Seguimiento de las identidades celulares a través del experimentoNOTA: Las entradas manuales a este paso incluyen la identificación del directorio de datos y la selección de propiedades asignadas para visualizar. Los archivos clave creados previamente utilizados en este paso incluyen ‘p*/phs/textResults/*.csv’. Los nuevos archivos clave producidos durante este paso incluyen ‘p*/phs/textResults/cellTimeTrace_*.csv’, que contiene un rastro de tiempo de los datos celulares. Consulte la Figura 13 para obtener la descripción visual de los siguientes pasos para realizar un seguimiento de las propiedades de las celdas individuales durante toda la duración del experimento. Inicie el software de Fiji y, en el menú desplegable de MSM , seleccione Resultados – Seguimiento de datos. Usando el cuadro de diálogo del navegador de archivos, seleccione el directorio de posición ‘analysis/p0’, ‘analysis/p1’, etc., que contiene las propiedades celulares que se van a rastrear. Cuando haya terminado, haga clic en Seleccionar. En la ventana Elegir punto de partida para el seguimiento , elija el marco de inicio para la supervisión y el número de fotogramas de seguimiento simultáneos (Figura suplementaria S14). Siempre comience desde el fotograma número 2, ya que la velocidad no se puede determinar para el fotograma número 1. Cuando haya terminado, haga clic en Aceptar. En la ventana Comprobar las variables para realizar seguimientos , elija las variables escribiendo los nombres de las variables o seleccionando los términos de las casillas de verificación (Figura suplementaria S15). Luego, haga clic en Aceptar.NOTA: El seguimiento genera archivos ‘phs/textResults/cellTimeTrace_*.csv’ con cada columna que contiene un número de celda único y cada fila sucesiva que representa la instancia de tiempo consecutiva. Parte 2: Generación de pistas de tiempo de las propiedades celulares evaluadasNOTA: Las entradas manuales a este paso incluyen la identificación del directorio de datos y la selección de propiedades asignadas para visualizar. Los archivos clave creados previamente utilizados en este paso incluyen ‘p*/phs/textResults/cellTimeTrace_*.csv’. Los nuevos archivos clave producidos durante este paso incluyen ‘p*/phs/trackedDataPlots/*.tif’, que contienen gráficos de seguimiento de tiempo y ‘p*/phs/trackedDataPlots/*.csv’, que contienen datos de gráficos. Consulte la Figura 14 para obtener la descripción visual de los siguientes pasos para generar seguimientos de tiempo de las propiedades celulares evaluadas. Inicie el software de Fiji y, en el menú desplegable de MSM , seleccione Resultados – gráfico. Usando el cuadro de diálogo del navegador de archivos, seleccione el directorio de posición ‘analysis/p0’, ‘analysis/p1’, etc., que contiene las propiedades celulares rastreadas que se van a trazar. Elija si desea limitar el trazado a celdas con pistas ininterrumpidas haciendo clic en el botón Sí o No .Nota : esta opción omite las celdas, que no se pudieron detectar en una o más instancias de tiempo. Elija el número de variables que se trazarán simultáneamente y haga clic en Aceptar.NOTA: Actualmente, AnViM permite mostrar un máximo de tres variables en la misma gráfica. Elija variables individuales para trazar mediante un menú desplegable.NOTA: Estos pasos crean un archivo de formato de archivo de imagen etiquetado (TIFF) y un archivo de datos separado por comas dentro de la carpeta ‘phs/trackedDataPlots/’. El nombre de archivo se compone de nombres de variables separados por un guión bajo y termina con un número de celda. Parte 3: Generación de mapas de calor de las propiedades celulares evaluadasNOTA: Las entradas manuales en este paso incluyen la identificación del directorio de datos y la selección de propiedades asignadas para visualizar. Los archivos clave creados previamente utilizados en este paso incluyen ‘p*/phs/textResults/cellTimeTrace_*.csv’. Los nuevos archivos clave generados en este paso incluyen ‘p*/phs/segmentedImages/cellPropMaps/*.tif’, que son los mapas de calor de las propiedades celulares. Consulte la Figura 15 para obtener la descripción visual de los pasos para generar mapas de calor de las propiedades celulares evaluadas. Elija en el menú desplegable de MSM Resultados – Imagen. Siga los pasos descritos en el paso 2.5.2.NOTA: La salida se almacena como archivos de archivo TIFF en la carpeta ‘phs/segmentedImages/cellPropMaps/’. Los nombres de archivo son el número de instancia de tiempo y el nombre de variable separados por un guión bajo.