ערכת כלים אינטגרטיבית לניתוח אותות תאיים: כוחות, תנועה, מורפולוגיה ופלואורסצנטיות
1Biomedical Sciences, Pat Capps Covey College of Allied Health Professions,University of South Alabama, 2Department of Physiology and Cell Biology, College of Medicine,University of South Alabama, 3Center for Lung Biology, College of Medicine,University of South Alabama, 4William B. Burnsed Jr. Mechanical, Aerospace, and Biomedical Engineering Department, College of Engineering,University of South Alabama, 5Mitchell Cancer Institute, College of Medicine,University of South Alabama, 6Department of Chemical and Biomedical Engineering,West Virginia University, 7Department of Pharmacology, College of Medicine,University of South Alabama, 8Department of Physiology & Pharmacology, College of Osteopathic Medicine,Sam Houston State University
Summary
ערכת הכלים האינטגרטיבית לניתוח אותות סלולריים (iTACS) הופכת את התהליך של מדידה בו זמנית של מגוון רחב של אותות כימיים ומכאניים בתאים דבקים. iTACS נועדה להקל על פיתוח מונחה קהילה ולאפשר לחוקרים להשתמש בכל תכונות הפלטפורמה ללא קשר לרקע החינוכי שלהם.
Abstract
הערכה כמותית של כוחות הסלולר והתנועה התקדמה משמעותית בארבעת העשורים האחרונים. התקדמות זו סיפקה את המסגרת לבחינת תהליכי איתות מכניים תובנה במערכות תרבית תאים. עם זאת, התחום מתמודד כיום עם שלוש בעיות: היעדר תקינה איכותית של הנתונים הנרכשים, טעויות טכניות בניתוח נתונים והדמיה, ואולי הכי חשוב, הטכנולוגיה נותרה ברובה מחוץ להישג ידן של מעבדות ביולוגיות נפוצות של התא. כדי להתגבר על מגבלות אלה, פיתחנו פלטפורמה ניסיונית חדשה – ערכת כלים אינטגרטיבית לניתוח אותות סלולריים (iTACS). iTACS מורכב משני רכיבים: מודול רכישה והדרכה (AcTrM) ומודול ניתוח ופריטים חזותיים (AnViM). AcTrM מבוססת על μManager – תוכנת בקרת מיקרוסקופ מבוססת NIH-ImageJ – ומאפשרת למשתמש אימון עצמי ואוטומציה של פרוטוקולי רכישת תמונה נפוצים. AnViM מבוססת על NIH-ImageJ ומאפשרת אוטומציה ידידותית למשתמש של ניתוח נתונים והדמיה תובנה של תוצאות. ניסויים אלה כוללים פולחן תאים חסידים על הידרוג’לים, דימות סמנים fiducial מוטבע הידרוג’ל, ולבסוף לחלץ מתמונות אלה אפיון מכני מקיף של התאים. נכון לעכשיו, iTACS מאפשר למשתמש לנתח ולעקוב אחר מגוון רחב של מאפיינים, כולל מורפולוגיה, תנועה, כוחות שלד, פלואורסצנטיות של תאים בודדים והאזור השכן שלהם. בעיית התקינה של האיכות טופלה ב- AcTrM עם טכניקת מיקוד מחדש מונחית תמונה. הבעיות הטכניות בניתוח נתונים טופלו ב- AnViM באמצעות הליך פילוח תמונות מרובה נדטים, גישה ידידותית למשתמש לזיהוי תנאי גבול, ודמיון נתונים מבוסס מאפיין סלולרי חדשני. AcTrM נועד להקל על הטרנספורמציה הישירה של מיקרוסקופי פלואורסצנטיות בסיסיים לאסדות מכניקת תאים ניסיוניות, ו- AnViM מצוידת כדי לאפשר למשתמשים למדוד אותות מכניים סלולריים ללא צורך ברקע הנדסי. iTACS תהיה זמינה לקהילת המחקר כחבילת קוד פתוח עם יכולות פיתוח מונחות קהילה.
Introduction
כלי הדמיה אופטיים וניתוח נתונים נפוצים משתמשים בטכנולוגיות חומרה ותוכנה כמעט מיושנות. הפיגור בתרגום ויישום ההתקדמות במכשירים אלקטרוניים, בגישות חישוביות ובניתוח מתמטי של כלי ביולוגיה נפוצים של תאים ניסיוניים הוא מגבלה מרכזית על קצב הצמיחה בידע שלנו בפיזיולוגיה תאית. נכון לעכשיו, חוקרי ביולוגיה של התא מוצאים כלים ביולוגיים מולקולריים בהישג יד, אך כלים המבוססים על עקרונות הנדסיים להיות מחוץ להישג ידם. אחד מכלים מבוססי עקרונות הנדסיים כאלה הוא מיקרוסקופיית מתח Monolayer (MSM)1,2. בעוד MSM הותאם ונחקר במעבדות שונות ברחבי העולם, השימוש בו מוגבל בעיקר למעבדות עם מומחיות הנדסית3,4,5,6,7,8,9.
NIH-ImageJ הוא אחד מכלי הקוד הפתוח הפופולריים ביותר בקרב חוקרי ביולוגיה של התא10. ההתקדמות המונעת על ידי קהילת המשתמשים הייתה מרכזית בפופולריות שלה11,12. ל- ImageJ תכונות המאפשרות למשתמשים לפתח יישומים עם שילוב של שפת תכנות מתקדמת וגישות סקריפטים פשוטות יותר. תכונות אלה מאפשרות למשתמשים בעלי ידע בסיסי בתכנות ליישם, להתאים ולקדם כל תרומה חדשה לתוכנה. בהתבסס על תכונות אלה של NIH-ImageJ, פיתחנו את ערכת הכלים האינטגרטיבית לניתוח אותות סלולריים (iTACS), המאפשרת שילוב בעלות נמוכה של כלי חומרה ותוכנה רצויים כדי להפוך את המדידה של מגוון רחב של אותות כימיים ומכאניים על פני תאים דבקים11,12.
iTACS כולל שני מרכיבים: מודול רכישה והדרכה (AcTrM) ומודול ניתוח ופריטים חזותיים (AnViM). AcTrM בנוי על μManager – יישום רכישת תמונה מבוסס NIH-ImageJ – כדי לאפשר למשתמשים להגדיר מדידות זמן לשגות של תכונות אופטיות מסורתיות ומגוון תכונות פיזיות של תאים דבקים בדגימות מרובות12. AcTrM מאפשר הכשרת משתמשים באמצעות כיוונים תמציתיים הכלולים בממשק הגרפי. בנוסף, יש לו תכונה חדשנית של מיקוד אוטומטי מבוסס תמונה התייחסות שנועד להקל על מדידות בזמן אמת של כוחות פיזיים ולאפשר סטנדרטיזציה איכותית של הנתונים שנרכשו.
AnViM בנויה על תוספים של ImageJ, תוכנות מזורזות וסקריפטים לטיפול בקבצים המאפשרים למשתמשים להעריך כמותית יותר מ-50 מאפיינים, כולל צורה תאית, גודל, כיוון, מהירות וכיוון תנועה, מתיחות המופעלות על המטריצה החוץ-תאית (ECM), ועל תאים שכנים, רגעי התכווצות וגיזה של תאים דבקים בודדים והאזור השכן שלהם. AnViM מאפשר למשתמשים לכמת את המאפיינים הפיזיים הסלולריים מבלי לשלוט ברקע הטכני הבסיסי11. יתר על כן, הוא מאפשר ניתוח נתונים במצב אינטראקטיבי או עיבוד אצווה. הוא יוצר מפות חום החושפות וריאציה מרחבית וגרפים המציגים את השונות הזמנית של המאפיינים של תאים בודדים.
בניסוי טיפוסי, המשתמש תרבית תאים על הידרוג’ל אלסטי עם חלבוני מטריצה חוץ תאיים מתאימים על פני השטח העליונים ושני סוגים של סמנים פלואורסצנטיים משובצים. בעיקרו של דבר, תמונות של סמנים פלואורסצנטיים אלה לפני ואחרי פולחן התאים מספיקים כדי לכמת את הכוחות בתוך ומסביב לתאים בודדים2,13. AnViM ממפה תוצאות אלה לתאים בודדים של אשכול החסידים ומייצרת תמונות וגרפים בעלי תובנות.
Protocol
הערה: דגימות שנבדקו באמצעות פלטפורמת iTACS הן תאים דבוקים למצע רך. הפרוטוקול להערכת אותות מכניים וכימיים מחולק לשני חלקים רציפים: מודול רכישה והדרכה (AcTrM) ומודול ניתוח ודמיון (AnViM). 1. מודול רכישה והדרכה (AcTrM) הערה: AcTrM הופך את תהליך רכישת הנתונים לאוטומטי והכשרה עצמית של המשתמשים. לפני כל רכישת נתונים, הכינו מצע רך המסוגל לספק מידע הדרוש לכימות כוחות שהתאים מפעילים עליו. הכנת הידרוג’להערה: המטרה כאן היא להכין מודולוס 1,250 Pa גיסא, כ 100 מיקרומטר עובי, ו 22 מ”מ קוטר polyacrylamide (PAA) הידרוג’ל. הכן פתרון polyacrylamide על ידי ביצוע השיטה של Yeung ואח ‘ולהטיל את הידרוג’ל בעקבות צעדים המתוארים על ידי Trepat et al.14,15. יוצא מן הכלל אחד להליך הוא שהחרוזים המוטמעים מיד מתחת לתאים הם בקוטר 0.5 מיקרומטר ושופכים פלואורסצנטיות צהובה. דלג על השלב של הצמדת חרוזים של 2 מיקרומטר לשעון הכיסוי אם אזור הצפייה צפוי להיות אזור גדול ללא תאים.הערה: פרוטוקול הכנת הידרוג’ל מבוסס כעת למדי בתחום16. לאורך התיאור הבא, חרוזים 0.5 מיקרומטר מכונים “חרוזים עליונים”, ואת 2 חרוזים מיקרומטר מכונים “חרוזים תחתון”. עם זאת, החרוזים התחתונים הם אופציונליים כאשר האזור בתמונה מכיל אזור גדול ללא תאים. תבנית החרוזים העליונה מאזור כה נטול תאים תשרת את מטרת תבנית החרוזים התחתונה. הר הידרוג’ל עם חרוזים פלואורסצנטיים מוטבעים על במת המיקרוסקופ. אפשר 15-20 דקות לטמפרטורת הצלחת כדי להגיע למצב יציב.הערה: המשטח העליון של הצלחת הוא פונקציונלי עם חלבוני מטריצה חוץ תאית, אבל התאים עדיין לא זרעו על הידרוג’ל. רכישת תמונת הפניה חלק 1: יצירת רשימת מיקומיםהערה: קלט ידני בשלב זה כולל מעקב אחר בקשות AcTrM לבחור מיקומים עם הפצת החרוזים הטובה ביותר. בשלב זה לא נעשה שימוש בקבצים שנוצרו בעבר. תיקיות חדשות מרכזיות המיוצרות בשלב זה כוללות תיקיות ‘t0imgs’, ‘tnimgs’ ו- ‘קבצי טקסט’, והקובץ שהופק כולל את קובץ רשימת המיקומים. ראה איור 2 לקבלת התיאור החזותי של השלבים הבאים המנחים את יצירת רשימת מיקומים באמצעות AcTrM. הדוגמה המודגמת רוכשת נתונים בהגדלה של פי 20. התחל μManager 2.0 – ביתא. הפעל את AcTrM על-ידי לחיצה על לחצן AcTrM.bsh בחלון משאבי IMBL . בחלון שכותרתו הגדרת מאפייני רכישה, בחר את המטרה המתאימה, סובלנות לדיוק של מיקום לרוחב (כלומר, XY) התאוששות, גודל השלב של פעולת המיקוד מחדש הגס והמעודן (כלומר, z) וערך של מקדם מתאם תמונה מקובל לשחזור המוקד.הערה: סובלנות עדינה יותר להתאוששות המיקום לרוחב תאט את התאוששות המיקום, אך סובלנות משמעותית תצטרך תיקון מיקום במהלך ניתוח נתונים ועלול לגרום לקושי בהתאוששות המוקד. גודל צעד קטן יותר יאט את פעולת המיקוד מחדש, אך גודל צעד גבוה מאוד עלול לגרום לתנועה מהירה עם הזדמנויות להחמיץ את המוקד. בחלון AcTrM – שלב 0 , בחר רכישה טרייה כדי ליצור רשימת מיקומים.הערה: החלון שכותרתו AcTrM – שלב 1 מפרט את כל השלבים הבאים. שלבים אלה כוללים הזזת הבמה, התאמת המוקד ולחיצה על לחצנים ב- μManager. שלבים אלה מדריך בבניית רשימת המשרות המתאימות לרכישת נתונים. לחץ על Live במיקרו-מניה כדי לדמיין את הדגימות להתאמות ידניות המפורטות בחלון AcTrM – שלב 1. בצע את השלבים המפורטים בחלון זה. עכשיו לרכוש את התמונה של החרוזים. בחר את הערוץ המתאים עבור החרוזים העליונים. הקפד להסתכל על החרוזים התחתונים גם כן. כדי לעשות זאת, בחר את הערוצים עבור החרוזים התחתונים. תמונה מטושטשת של חרוזים תחתון נראית.הערה: ניתן להחליף ערוצים מהתפריט הנפתח המוגדר מראש בחלון הראשי של μManager. אם נעשה שימוש בחררוזים התחתונים בניסוי, ודא שהם נמצאים במצב שנבחר. החרוזים האלה ייראו מטושטשים. בעת בחירת המיקום המתאים, לחץ על סמן בחלון רשימת מיקומי שלב כדי לשמור את המיקום.הערה: המיקום הטוב ביותר מוגדר על ידי התפלגות צפופה ואחידה של החרוזים העליונים המוטמעים מיד מתחת לפני השטח העליונים (כלומר, חרוזים עליונים) ולפחות שני חרוזים המחוברים לכוס הכיסוי (כלומר, חרוזים תחתונים) (איור משלים S1). התאוששות המוקד מהירה יותר אם החרוזים התחתונים מופיעים כטבעות גדולות ולא ממוקדות. עם זאת, אם ניסויים נעשים במצב אחד ללא צורך במיקוד או בשחזור מיקום לרוחב, התעלם מהוראות הקשורות לתמונת החרוזים התחתונה. בצע את שלבים 6-9 המתוארים באיור 2 כדי לכלול משרות נוספות ברשימה.הערה: בחר כמה עמדות נוספות, כך סיבוב של אלימינציה יכול לאפשר את העמדות הטובות ביותר שנבחרו על הצלחת. חלק 2: רכישת תמונות הפניההערה: שלב זה אינו כרוך בקלט ידני. קבצי מפתח שנוצרו בעבר בשלב זה כוללים ‘קבצי טקסט/*.pos’. קבצים ותיקיות חדשים מרכזיים המיוצרים בשלב זה כוללים את הקבצים בתיקיות ‘t0imgs’ ו- ‘tnimgs’. ראו איור 3 ואיור משלים S2 לקבלת התיאור החזותי של השלבים הבאים המנחים את רכישת תמונות הייחוס באמצעות AcTrM. החלון AcTrM – שלב 2 מפרט גם את כל שלבי המפתח. לאחר השלבים המפורטים בחלון AcTrM – שלב 2 , בצע את הבחירות בחלון הרכישה הרב-ממדית . לדוגמה, כדי לבצע מעידה ארוכה, ציין מספר תמונות שיש להצטלם, בחר את הערוץ הראשון כערוץ פאזה ולאחר מכן בחר את הבא עבור החרוזים העליונים ואת זה שאחריו הוא עבור חרוזים תחתון. לחץ על סגור בחלון רכישה רב ממדית ולאחר מכן לחץ על אישור בחלון ActrM – שלב 2 . בחלון AcTrM – שלב 3 , בחר לעסוק בשחזור מיקום XYZ מבוסס תמונת ייחוס. הבחירה היא בדרך כלל כן. עם זאת, אם תמונות נרכשות במיקום אחד ללא מקום למיקוד או להסחפת במה, הבחירה בחלון AcTrM – שלב 3 תהיה לא. בחלון אפשרויות שחזור AcTrM – XYZ , הגדר את הערוץ לשחזור XYZ גס, אם לבצע שחזור XYZ מעודן, אזור, ערוץ לשחזור XYZ מעודן ואת הכיוון להתחיל להתמקד מחדש (איור משלים S4). לאחר השלמתו, AcTrM תרכוש תמונות ייחוס.הערה: אפשרויות אופייניות עבור הערוץ יהיו ערוץ החרוזים התחתון. שחזור XYZ פועל בצורה הטובה ביותר כאשר מתבצע עם התמונה המלאה ביישום הנוכחי. תמונות ייחוס יכללו בדרך כלל תמונת אור משודרת של ההידרוג’ל, תמונה פלואורסצנטית של חרוזים עליונים ותמונה פלואורסצנטית של החרוזים התחתונים. התוכן של כל ערכת תמונות עשוי להשתנות בהתאם לבחירות שבוצעו בחלון הרכישה הרב-ממדית . עם זאת, התוכנה תרכוש את תמונת הייחוס שנקבעה בכל מיקום שייקבע באיור 2. בסוף שלב זה, שלוש תיקיות נוצרות בספריה שנבחרה: ‘t0imgs’, ‘tnimgs’ ו- ‘textfiles’. התיקיה ‘t0imgs’ מכילה תמונות ייחוס בתבנית שזוהתה על-ידי μManager ומשמשת בשלבים הבאים; התיקיה ‘tnimgs’ מכילה תמונות TIFF נפרדות עם שמות קבצים ‘c0_p0_t0.tif’, ‘c1_p0_t0.tif’ וכו ‘. כאן, ‘c’ מייצג את הערוץ, ‘p’ מייצג את העמדה, ו’t’ מייצג את הזמן. להלן מספר הערוץ, מספר המיקום ומספר המסגרת, בהתאמה. התיקיה ‘קבצי טקסט’ מכילה את רשימת המיקומים בתבנית XML ואת אפשרויות המשתמש עבור רכישת תמונה ושחזור מיקום. זריעת תאים וצמיחההערה: לפלטפורמת iTACS יש את הגמישות להכיל פרוטוקולי הכנת מדגם המשמשים בהערכה במבחנה משותפת של התנהגות מכנית של תאים דבקים, כולל תאים דלילה, monolayer במפגש מלא, בדיקת היווצרות רשת, ו monolayers עם חורים או פערים משמעותיים. תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים של חולדת עכברושים למפגש בבקבוקון17,18. נתק את התאים באמצעות טריפסין. resuspend התאים במדיום תרבית המכיל 10% סרום בקר עובר לריכוז 1 x 106 תאים / מ”ל. מניחים טיפה של 5 μL של התאים המחודשים על משטח הידרוג’ל יבש חלקית ומניחים אותו באינקובטור תרבית התא.הערה: לאחר יומיים במדיום התרבות המכיל 10% סרום בקר עוברי, התאים בטיפת זה יוצרים אי צפוף של תאים1. רכישת תמונה אוטומטית עבור הניסוי הנותרהערה: קלט ידני עבור שלב זה כולל מעקב אחר בקשות AcTrM לחדש את רכישת התמונה. קבצים שנוצרו בעבר על-ידי שלב זה כוללים קבצי ‘textfiles/*.pos’ ותמונת חרוזים תחתונה בתיקיה ‘t0imgs’. קבצים חדשים מפתח המיוצרים בשלב זה כוללים קבצים מעודכנים רשימת מיקום ותמונות ‘tnimgs/*_t*.tif’. ודא שמערכת הבקרה הסביבתית של המיקרוסקופ מגיעה לתנאי תרבית רקמות יציבים. הרכב בעדינות את הלוח המכיל תאים בתרבית על במת המיקרוסקופ. אפשר 15-20 דקות עבור הטמפרטורה והלחות להתייצב.הערה: ראה איור 4 לתיאור החזותי של השלבים הבאים המנחים את רכישת התמונות עבור הניסוי הנותר באמצעות AcTrM. התחל μManager 2.0 – ביתא. הפעל את AcTrM על-ידי לחיצה על לחצן AcTrM.bsh בחלון משאבי IMBL .הערה: התעלם מהבחירות שבוצעו בחלון הגדרת מאפייני רכישה אך השתמש בבחירות שבוצעו בשלב הקודם. בחלון AcTrM – שלב 0 , בחר המשך רכישה מושהית. בחר את ההגדלה והספריה שזוהו בחלון הרכישה הרב-ממדית בשלב הקודם שבו נשמרו תיקיות נתונים (‘t0imags’, ‘tnimgs’ ו- ‘קבצי טקסט’).הערה: כותרת החלון מנחה את המשתמש לבחור את הספריה המתאימה. במיקום מחדש של חלון הצלחת , בחר אפשרויות למיקום מחדש של הלוח (שלושה מיקומים לא-נונקולינאריים) יחד עם הערוץ המשמש למיקום מחדש.הערה: תמונות שמורות ייראו במצלמה. אם תמונות חופפות מוצגות כתמונה בצבע אדום, ירוק ושחור, בצעו התאמה ידנית. לחץ על קבל כדי להמשיך ברכישה.הערה: שלב זה מתגבר על השינויים הקלים מהבלתי ניתן לתכנות של יישור הלוח כאשר הלוח נטען מחדש בשלב המיקרוסקופ. עקוב אחר בקשות AcTrM לזרז את היישור בכל אחד משלושת המיקומים על-ידי הצגת תמונה מורכבת של תמונת הייחוס המוצגת באדום (בדרך כלל של החרוזים התחתונים) והתמונה שנצפתה כעת באמצעות המטרה המוצגת בירוק. מקבל את הירוק מספיק קרוב עלים אדומים פחות עבודה עבור התוכנה. כאשר החפיפה מושלמת, התמונה המורכבת מופיעה צהוב ושחור. קרוב מספיק הוא בדרך כלל כאשר אותם חרוזים תחתוניים נראים בתמונות אדומות וירוקות, והטבעות האדומות והירוקות המתאימות שאינן ממוקדות נוגעות זו בזו. לאחר השלמת מיקום הלוח, AcTrM לוקח את הבמה לכל מיקום שנבחר ומשחזר את מיקום XYZ על ידי התאמת תמונת הייחוס למה שנראה כעת דרך המצלמה. המיקום לרוחב הראשון (XY) מותאם ולאחר מכן המוקד (Z) תואם. התאוששות מחוספסת מלווה התאוששות מעודנת של המיקום והמיקוד. עדכונים על המצב הנוכחי של הניסוי מוצגים על המסך דרך חלון בן ארבעה חלקים המוצג באיור S3 המשלים. התמונות שנרכשו נשמרות בתיקיה ‘tnimgs’ לאחר ‘*_t1.tif’, ‘*_t2.tif’, המציינות את ספירת הזמנים עבור ערכת התמונה. אם שחזור XYZ מזהה מיקום מעודכן, רשימת המיקומים החדשה נוצרת ונשמרת בתיקיה ‘קבצי טקסט’. 2. מודול ניתוח ופריטים חזותיים (AnViM) הגדרת ניתוח נתונים אוטומטיהערה: קלט ידני בשלב זה כולל זיהוי המיקום של התיקיה ‘tnimgs’. המפתח שנוצר בעבר קבצים המשמשים בשלב זה כוללים ‘tnimgs/*.tif’. קבצים ותיקיות חדשים מרכזיים שהופקו בשלב זה כוללים את התיקיה ‘ניתוח’ באותה תיקיית אב כמו ‘tnimgs’ ותיקיות עבור כל מיקום ‘ניתוח/p*’. בתוך כל ‘ניתוח/p*’, שלב זה יוצר קבצי תמונה חדשים של ‘*.tif’ בתיקיות ‘phs’ ו- ‘tny’. תמונות אלה הן תמונות חתוכות ודה-נסחפות של תאים וחרוזים עליונים. הקבצים האחרים שנוצרו כוללים ‘ניתוח/ניתוחChoices.txt’ המפרט אפשרויות ניתוח, ‘ניתוח/p*/skipAnalysis.txt’, המפרט מקרים שבהם מדלגים על הניתוח עקב סחף משמעותי קיים מראש, ו-‘ניתוח/p*/part_shift_values_pixel_degree.dat’ המפרט ערכי סחף משוערים. AnViM אינו משנה את הנתונים הגולמיים בתיקיה ‘tnimgs’. ראה איור 5 לקבלת התיאור החזותי של השלבים הבאים המנחים את ההגדרה של ניתוח נתונים אוטומטי באמצעות AnViM. הפעל את תוכנת פיג’י ובחר באפשרות הראשונה בתפריט הנפתח MSM המסומן כ – MSM – עיבוד מקדים. באמצעות תיבת הדו-שיח של דפדפן הקבצים, בחר את התיקיה המכילה את התיקיה ‘tnimgs’, המכילה את הנתונים שנותחו. הגדר את הערוץ לתמונות. בהתאם להנחיות מאיור S5 משלים, זהה את מספרי הערוצים של תמונת האור המשודרת של התאים (תמונת ניגודיות פאזה של התאים), תמונת החרוזים התחתונים ותמונת החרוזים העליונים. שלוש תיבות הסימון הבאות (‘העבר קבצים לתיקיית המיקום’, ‘בצע תיקון נוסף עבור תנועה נוקשה’ ו’חתוך נתונים ושמור בתיקיית מיקום’) מסומנות בדרך כלל. לבסוף, הגדר עמידות לדחיית נתונים נסחפים בכבדות, גודל פיקסלים וצידי התמונה שבהם התאים חוצים. הגב לבקשה לשיפור הבהירות והחדות של תמונות החרוזים התחתונות כך החרוזים יופיעו באופן בולט. התאם זאת באמצעות סרגל המחוון בתפריט ולחץ על אישור. כעת בצע תיקון מיקום כדי להיפטר מהמשמרות, אם בכלל. לאחר סיום, נוצרת תיקיית ניתוח.הערה: שיפור ניגודיות בדרך כלל אינו נחוץ, אך הוראה זו זמינה לניסויים שבהם יש למזער את החשיפה ללייזרים. לאחר בחירה זו, AnViM מעתיק את הקבצים מהתיקיה ‘tnimgs’ לתיקיה ‘ניתוח’. הקבצים המתאימים לכל מיקום נשמרים בתיקיות ‘ניתוח/p0, ניתוח/p1’ וכו ‘. בתוך כל אחת מתיקיות מיקום אלה, AnViM מייצרת תיקיות ‘סלס’, ‘defs’ ו-‘refs’ המכילות את תמונת האור המקורית ששודרה, תמונות חרוזים עליונים ותמונות חרוזים תחתון, בהתאמה (איור משלים S6). לאחר מכן, AnViM מנתח תנועה נוקשה בתמונות של החרוזים התחתונים ויוצר תיקיית ‘phs’ המכילה תמונת אור משודרת מתוקנת של התאים ותיקיה ‘tny’ המכילה תמונות חרוזים עליונות מעודכנות. לבסוף, בחירות המשתמש של הערוצים, הפעולות, הסובלנות, גודל הפיקסלים וחציית הגבולות נשמרות בקובץ ‘analysisChoices.txt’ (איור משלים S6). כימות עיוות של הידרוג’ל ומונו-שכבתיתהערה: חשוב לציין כי כימות תנועה מרצף של תמונות הוא שדה המתפתח במהירות19. הטכנולוגיה ממוטבת כל הזמן לתכונות, כולל מהירות, דיוק, תכונות ספציפיות בתוך התמונות הגולמיות ודפוסי עיוות ספציפיים. לפיכך, סביר להניח כי משתמשים מסוימים עשויים להשתמש בגישה שונה של כימות עיוות מזו המוצגת כאן. חלק 1: כימות עיוות הידרוג’להערה: קלט ידני בשלב זה כולל זיהוי ספריית נתונים ובחירה של רזולוציית רשת. קבצים שנוצרו בעבר בשלב זה כוללים ‘p*/tny/*.tif’. קבצים חדשים מפתח המיוצרים זה כוללים ‘p*/עקירה/*_disp.dat’ המפרט את דרכי ההעתקה של המשטח העליון של ההידרוג’ל. ראה איור 6 לתיאור החזותי של השלבים הבאים שיש לעסוק בהם, באמצעות AnViM, בניתוח Velocimetry של תמונת החלקיקים בתמונות החרוזים העליונות20. הפעל את תוכנת פיג’י, ומהתפריט הנפתח MSM , בחר MSM – עיוות ג’ל. מכאן, בחר את האפשרות המתאימה לניסוי. באמצעות תיבת הדו-שיח של דפדפן הקבצים, בחר את ספריית האב של התיקיה ‘ניתוח’ המכילה את הנתונים שנותחו. בחלון פרמטרים לחישוב עיוות ג’ל , בחר את גודל חלון המתאם הצולב המתאים, רמת הרעש והסף (איור משלים S7)20.הערה: התוצאות נשמרות בספריה ‘עקירה’ חדשה שנוצרה בתוך כל תיקיית מיקום ‘ניתוח/p0, ניתוח/p1′ וכו’. כאן מאוחסנים כל קבצי הפלט. חלק 2: כימות עיוות חד שכבתיהערה: קלט ידני בשלב זה כולל זיהוי ספריית הנתונים ובחירה של רזולוציית רשת. קבצים שנוצרו בעבר בשלב זה כוללים ‘p*/tny/*.tif’. קבצים חדשים מרכזיים המיוצרים בכך כוללים ‘p*/מהירות/*_vel.dat’ המפרטת וקטורי תנועה של התאים. ראה איור 7 לתיאור החזותי של השלבים שיש לעסוק בהם, באמצעות AnViM, ניתוח Velocimetry של תמונת החלקיקים בתמונות החרוזים העליונות20. ההליך דומה לזה שלאחריו לכימות עיוות הידרוג’ל ובחירת MSM – תנועה סלולרית מהתפריט הנפתח MSM . התוצאות נשמרות בספריה ‘מהירות’ חדשה שנוצרה בתוך כל תיקיית מיקום ‘ניתוח/p0’, ‘ניתוח/p1′ וכו’. כימות של כוחות תא-ECM ותא-תאיםהערה: קלט ידני בשלב זה כולל זיהוי ספריית הנתונים, ציון נוקשות ההידרוג’ל ותגובה להנחיות פילוח אשכולות סלולריים לזיהוי תאים מהאזור ללא תאים. קבצים שנוצרו בעבר בשלב זה כוללים ‘p*/עקירה/*_disp.dat’. קבצים חדשים מרכזיים המיוצרים בשלב זה כוללים: ‘p*/המתיחה/*_trac.dat’, המפרטת כוחות המופעלים על ידי התאים על ההידרוג’ל; ‘p*/מתיחה/*_domain.dat’, המפרט את המיקום של נקודות רשת המכילות תאים; וקבצי קלט ‘p*/המתיחה.in, p*/clusterInput.txt’ ו- ‘p*/prestress.in’ המתעדים בחירות משתמש עבור שלב זה. לאחר ההערכה הכמותית הראשונה של כוחות תא-ECM ותא-תאים, פותחו מספר וריאציות לטכניקה1,15. הווריאציות מתמקדות במקרים מסוימים של מצעים, תאים, תנאי ניסוי או כלים מספריים7,8,21,22. ראו איור 8 לתיאור החזותי שיש לבצע באמצעות AnViM, מיקרוסקופיית המתיחה של התמרת פורייה וניתוח מיקרוסקופיית מתח מונו-שכבתית בנתוני עיוות ההידרוג’ל1,2,15. הפעל את תוכנת פיג’י, ומהתפריט הנפתח MSM , בחר MSM – Cell-ECM וכוחות תא -תאים (אפשרות שלישית בתפריט הנפתח). באמצעות תיבת הדו-שיח של דפדפן הקבצים, בחר את ספריית האב של התיקיה ‘ניתוח’ המכילה את התיקיות ‘tnimgs’ ו- ‘analysis’ המכילות נתונים מנותחים. לחץ על בחר. בחלון הפרמטרים לחישוב כוחות הסלולר , הזן את מודולוס הגיזה, עובי ההידרוג’ל ואת רמת הרעש הצפויה. בחר אישור. זה מאפשר לו לבצע מתיחה באמצעות הפונקציה MATLAB.הערה: בעקבות כניסות אלה, AnViM מחשבת כוחות תא-ECM. לאחר מכן, ציין אם monolayer הוא מפגש. אם תמונת התא כולה מכוסה בתאים, התשובה היא כן. במקרה כזה, כוחות התאים יחושבו על פני כל המסגרת. מצד שני, אם לחלק מהתמונה אין תאים, אז התשובה היא לא. במקרה זה, בצע את ההנחיות של AnViM כדי להקל על פילוח של אזור התמונה המכיל תאים. אם התשובה היא לא, צייר באופן ידני מצולע סביב האובייקט שאינו תא כאשר התוכנה מבקשת לעשות זאת ולאחר מכן בחר שיטה מתאימה עבור פילוח. התוכנה תבקש את הצבע (שחור או לבן) של התאים. בדוק את האפשרות נקודות מילוי באופן אוטומטי בתוכנה ולחץ על אישור.הערה: השלבים לפילוח מונו-שכבתי שאינו מתמשך יכוסו בחלק הראשון של ‘סעיף 2.4. כוחות Cell-ECM מאוחסנים בקבצי ‘*_trac.dat’ בספריה חדשה שנוצרה ‘מתיחה’ בתוך כל תיקיית מיקום, והקלט לתוכנת חישוב הכוח של התא-ECM נשמר בקובץ ‘traction.in’ (איור משלים S8). כוחות תא מאוחסנים בקבצי ‘*_prestress.dat’ בספריה חדשה שנוצרה ‘prestress’ בתוך כל תיקיית מיקום, והקלט לתוכנת חישוב כוח התא נשמר בקובץ ‘prestress.in’ (איור משלים S9). מיפוי ערכי נקודות רשת בתאים בודדיםהערה: אחד המוקדים הנוכחיים של iTACS הוא להציג גישה פשוטה לפרש את האותות המכניים הנמדדים בתחום. גישה זו מועילה לבחינת אינטראקציות מכניות בין תאים סמוכים של אשכול18. בסך הכל, המאפיינים לכמת עד כה נמצאים בנקודות רשת מרווחות באופן קבוע על-פני האשכול הסלולרי. נתונים אלה מזהים סטיית תקן חציונית, ממוצעת ותקן של מאפיינים נבחרים בגבול המורפולוגי של תאים בודדים ומקצה אותם כמאפיינים/אותות פיזיים תאיים. מתוך אלה, סטיית התקן משמשת לציון שונות, ההבדל בין ממוצע לחציון משמש לציון אופי ההפצה, והערך החציוני משמש לציון המצב הכולל של התאים עבור המאפיינים שנבחרו.חלק 1: פילוח של אזור התמונה המכיל תאיםהערה: קלט ידני לשלב זה כולל זיהוי ספריית נתונים ותגובה להנחיות הפילוח לזיהוי תאים מהאזור ללא תאים. קבצים מרכזיים שנוצרו בעבר בשלב זה כוללים ‘p*/phs/*.tif’. קבצים חדשים מרכזיים המיוצרים בשלב זה כוללים ‘p*/phs/bwImages/*.tif’ שהם תמונות בינאריות המפרידות בין אזורי תאים מאזורים ללא תאים, ‘p*/phs/textResults/frameNum_percentHealed.txt’, המפרט אחוז אזור תמונה המכוסה על-ידי תאים בכל מופע, ו- ‘p*/clusterInput.txt’, המתעד בחירות משתמש שהוזנו בממשק AcTrM. ראו איור 9 לתיאור החזותי של השלבים הבאים לפלח את אזור התמונה המכיל תאים. יש להשלים חלק זה לפני חישוב כוחות התא. במקרה כזה, אין צורך לחזור על שלבים אלה. כמו כן, אם שלבים אלה מתבצעים לפני חישובי כוח התא, הם אינם מתבקשים בתחילת חישובי הכוח. הפעל את תוכנת פיג’י, ומהתפריט הנפתח MSM , בחר סגמנטציה – אשכול סלולרי. באמצעות תיבת הדו-שיח של דפדפן הקבצים, בחר את ספריית המיקומים ‘analysis/p0’, ‘analysis/p1′ וכו’, המכילה מאפיינים המכומתים בנקודות רשת מרווחות באופן קבוע. ציין אם המנולאים הוא קונפלנטי.הערה: השלבים שלהלן מופעלים רק כאשר המנוביין אינו משוחח. פעלו בהתאם להנחיות AnViM כדי להחיל את הגישה מרובת הניצבים החדשה כדי לזהות את אזורי התמונה המכילים תאים. התהליך כולל ארבע שיטות – כל אחת מתקרבת פילוח באופן שונה. אחת או יותר משיטות אלה המשמשות בשילוב מכסות מגוון רחב של תמונות של התאים. לכן, נסה גישות שונות כדי לגלות איזה שילוב עובד בצורה הטובה ביותר עבור הנתונים שלהם. התאם את ‘גורם החיבור של התחום’ ואת ‘גורם ההכפשה’ כדי לקבל פילוח אופטימלי.הערה: ‘גורם ההכפשה’ הופך את האזורים המכילים תאים לגדולים יותר. ציין אם התאים מופיעים בשחור או בלבן בתמונה הבינארית. בחלון ‘הוראות לניקוי תמונת הגבול’ , בחרו אם לנקות את התמונה באופן אוטומטי או ידני.הערה: תכונות לא רצויות של התמונות הן כתמים שחורים בפיקסלים הכבושים על-ידי תאים וכתמים לבנים בפיקסלים המנותקים מאשכול התאים שיש לנתח. ניתן לבצע ניתוח רק באזורים המחוברים. לכן יש לנתח אזורים מנותקים מרובים בנפרד. חלק 2: פילוח התאים הבודדים בתמונותהערה: קלט ידני לשלב זה כולל זיהוי ספריית הנתונים ותגובה להנחיות הפילוח לזיהוי תאים בודדים בתוך התמונה. קבצים מרכזיים שנוצרו בעבר בשלב זה כוללים ‘p*/phs/*.tif’ ו- ‘p*/phs/bwImages/*.tif’. קבצים חדשים מפתח המיוצרים כוללים ‘p*/phs/textResults/*.csv’, המכילים תכונות מורפולוגיות הסלולר. ראה איור 10 לקבלת התיאור החזותי של השלבים הבאים לפלח תאים בודדים של הקוברות. הפעל את תוכנת פיג’י, ומהתפריט הנפתח MSM , בחר סגמנטציה – תאים בודדים. באמצעות תיבת הדו-שיח של דפדפן הקבצים, בחר את ספריית המיקומים ‘analysis/p0’, ‘analysis/p1′ וכו’, המכילה מאפיינים המכומתים בנקודות רשת מרווחות באופן קבוע. בחלון בחר את פרמטרי הקלט , ציין את יחס הגובה-רוחב המרבי, בולט עד כמה מרכז התא בולט בהשוואה לגבול התא ושני פרמטרים מטשטשים כדי להנחות את זיהוי התאים (איור משלים S10). במחסנית התמונות עבור כל מיקום, צייר מצולע בתא הנורמלי הקטן ביותר. פעולה זו משמשת לחישוב האזור. כל דבר קטן מזה לא ייחשב כתא על ידי התוכנה. לאחר מכן צייר מצולע סביב התא הנורמלי הגדול ביותר וציין אם מרכז התא או ממשק התא בהיר יותר.הערה: AnViM לאחר מכן יוצר קבצים ‘phs/textResults/0001.csv’, ‘phs/textResults/0002.csv’ וכו ‘, עבור כל מסגרת המכילה מידע על תאים בתוך מסגרת זו. בשלב זה, קובץ זה כולל מידע מורפולוגי על התאים, כולל שטח, centroid, היקף, אוריינטציה, מעגליות, יחס גובה-רוחב, מעוגלות, מוצקות, מרחק מהאזור ללא תא. יחידת האורך במאפיינים אלה היא פיקסלים, והזווית היא במעלות. לבסוף, קובץ זה מתעדכן כדי להכיל את עוצמת הפיקסלים הסלולריים, התנועה והכוחות בשלבים הבאים. חלק 3: מיפוי עוצמות הפיקסלים בתאיםהערה: קלט ידני בשלב זה כולל זיהוי ספריית הנתונים ובחירת מאפייני מיפוי ופרמטרים. המפתח שנוצר בעבר קבצים בשימוש בשלב זה כוללים ‘p*/phs/*.tif’ (או ‘p*/fluo/*.tif’) ו- ‘p*/phs/bwImages/*.tif’. קבצים חדשים מרכזיים המיוצרים בשלב זה כוללים ‘p*/phs/textResults/*.csv’, המפרט מאפיינים מורפולוגיים תאיים. ראה איור 11 לתיאור החזותי של השלבים הבאים כדי להעריך את עוצמות הפיקסלים באזור המקיף תאים בודדים ואת האזור השכן שלהם ולהגדיר אותם כמאפיינים של התאים. הפעל את תוכנת פיג’י, ומהתפריט הנפתח MSM , בחר מפה על תאים – עוצמות. באמצעות תיבת הדו-שיח של דפדפן הקבצים, בחר את ספריית המיקומים ‘analysis/p0’, ‘analysis/p1′ וכו’, המכילה מאפיינים המכומתים בנקודות רשת מרווחות באופן קבוע. בחר זהה חלוקת תאים או כימת פלואורסצנטיות סלולרית כאשר תתבקש על-ידי התוכנה. הגדר את גודל האזור השכן. סמן הן את מאפייני איסוף המאפיינים של האזור השכן והן את מאפייני התאים. לחץ על אישור. במטרה להקליט את החלון ‘עוצמה תאית’, ציין איזה סוג תמונה ישמש למיפוי עוצמה, לגודל האזור השכן והאם נאספים נתונים עבור תאים בודדים או עבור התאים והאזורים הסמוכים שלהם (איור משלים S11).הערה: מיפוי עוצמות הפיקסלים של תמונת ניגודיות פאזה מאפשר זיהוי של אירועי חלוקת תאים. מיפוי עוצמות תמונה פלואורסצנטיות יאפשר זיהוי של תנודות במולקולות ציטופלסמיות מתויגות באופן פלואורסצנטי. הפלט של השלבים לעיל הוא ערכי עוצמת הפיקסל הממוצעים, החציוניים, סטיית התקן, המינימום והמקסימום עבור תאים בודדים. מספרים אלה מוזנים כעמודות חדשות בקבצים ‘phs/textResults/0001.csv’, ‘phs/textResults/0002.csv’ וכו’. חלק 4: מיפוי הכוחות והתנועה על התאיםהערה: קלט ידני לשלב זה כולל זיהוי ספריית הנתונים ובחירת מאפייני מיפוי ופרמטרים. המפתח שנוצר בעבר קבצים המשמשים בשלב זה כוללים ‘p*/phs/textResults/*.csv’, ‘p*/מהירות/*_vel.dat’, ‘p*/תזוזה/*_disp.dat’, ‘p*/מתיחה/*_trac.dat’, ‘p*/prestress/*_prestress.dat’, ו- ‘p*/phs/bwImages/*.tif’. לא נוצרים קבצים חדשים במהלך שלב זה. במקום זאת, המידע החדש (מאפייני כוח סלולרי ותנועה) מתווספים לקבצים ‘p*/phs/textResults/*.csv’. ראה איור 12 לתיאור החזותי של השלבים להערכת הכוחות והתנועה באזור המקיפות תאים בודדים והאזור השכן שלהם ולהגדיר אותם כמאפיינים של התאים. בחר מתוך התפריט הנפתח MSM מפה על תאים – נתוני תנועה /כוח (איור משלים S12). לאחר מכן, בצע את השלבים המפורטים בשלב 2.4.3.הערה: עמודות חדשות מתווספות לקבצים ‘phs/textResults/0001.csv’, ‘phs/textResults/0002.csv’ וכו’ וכוללות את הממוצע, החציון וסטיית התקן של המהירות, כיוון המהירות, מתח הציטוסד הממוצע, אניסוטרופיה של מתח, אנרגיית המתח בהידרוגל, הכיוון של המתח הגבוה ביותר, וגודל המתיחה של התא-ECM (איור S13 משלים). תצוגה חזותית של תוצאות חלק 1: מעקב אחר הזהויות התאיות לאורך הניסויהערה: קלט ידני לשלב זה כולל זיהוי ספריית הנתונים ובחירת מאפיינים ממופים להמחשה חזותית. קבצים שנוצרו בעבר בשלב זה כוללים ‘p*/phs/textResults/*.csv’. קבצים חדשים מרכזיים שהופקו במהלך שלב זה כוללים ‘p*/phs/textResults/cellTimeTrace_*.csv’, המכיל מעקב זמן של הנתונים הסלולריים. ראה איור 13 לקבלת התיאור החזותי של השלבים הבאים כדי לעקוב אחר המאפיינים של תאים בודדים לאורך כל תקופת הניסוי. הפעל את תוכנת פיג’י, ומהתפריט הנפתח MSM , בחר תוצאות – מעקב אחר נתונים. באמצעות תיבת הדו-שיח של דפדפן הקבצים, בחר את ספריית המיקומים ‘analysis/p0’, ‘analysis/p1′ וכו’, המכילה מאפיינים סלולריים שיש לעקוב אחריהם. בסיום לחץ על בחר. בחלון בחירת נקודת התחלה למעקב , בחרו מסגרת ההתחלה לניטור ומספר המסגרות במעקב בו-זמנית (איור משלים S14). התחל תמיד ממסגרת מספר 2 מכיוון שלא ניתן לקבוע מהירות עבור מסגרת מספר 1. בסיום, לחץ על אישור. בחלון בדוק את המשתנים כדי ליצור רצועות , בחר את המשתנים על-ידי הקלדת שמות המשתנים או בחירת המונחים מתיבות הסימון (איור משלים S15). לאחר מכן, לחץ על אישור.הערה: המעקב יוצר קבצי ‘phs/textResults/cellTimeTrace_*.csv’ כאשר כל עמודה מכילה מספר תא ייחודי וכל שורה עוקבת המייצגת את מופע הזמן העוקב. חלק 2: יצירת מסלולי זמן של תכונות הסלולר המוערכתהערה: קלט ידני לשלב זה כולל זיהוי ספריית הנתונים ובחירת מאפיינים ממופים להמחשה חזותית. קבצים שנוצרו בעבר במפתחות בשלב זה כוללים ‘p*/phs/textResults/cellTimeTrace_*.csv’. קבצים חדשים מרכזיים שהופקו במהלך שלב זה כוללים ‘p*/phs/trackedDataPlots/*.tif’, המכילים התוויות של מעקב זמן ו- ‘p*/phs/trackedDataPlots/*.csv’, המכילים נתוני התוויית נתונים. ראה איור 14 לקבלת התיאור החזותי של השלבים הבאים ליצירת פסי זמן של המאפיינים הסלולריים המוערך. הפעל את תוכנת פיג’י, ומהתפריט הנפתח MSM , בחר תוצאות – התוויה. באמצעות תיבת הדו-שיח של דפדפן הקבצים, בחר את ספריית המיקומים ‘analysis/p0’, ‘analysis/p1′ וכו’, המכילה מאפיינים סלולריים מסומנים שיש להתוות. בחר אם להגביל את התוויית התוויה לתאים עם רצועות רצועות רצוף על-ידי לחיצה על לחצן כן או לא .הערה: אפשרות זו מתעלמת מהתאים, שלא היתה אפשרות לזהותם במופע זמן אחד או יותר. בחר את מספר המשתנים שיש להתוות בו-זמנית ולחץ על אישור.הערה: נכון לעכשיו, AnViM מאפשר להציג לכל היותר שלושה משתנים באותה התוויה. בחרו משתנים בודדים להתוויה באמצעות תפריט נפתח.הערה: שלבים אלה יוצרים קובץ תבנית קובץ תמונה מתויגת (TIFF) וקובץ נתונים המופרד באמצעות פסיקים בתיקיה ‘phs/trackedDataPlots/’. שם הקובץ מורכב משמות משתנים המופרדים באמצעות מקף תחתון ומסתיים במספר תא. חלק 3: יצירת מפות חום של תכונות הסלולר המוערכתהערה: קלט ידני בשלב זה כולל זיהוי ספריית הנתונים ובחירת מאפיינים ממופים להמחשה חזותית. קבצים שנוצרו בעבר במפתחות בשלב זה כוללים ‘p*/phs/textResults/cellTimeTrace_*.csv’. קבצים חדשים מרכזיים שנוצרו בשלב זה כוללים ‘p*/phs/segmentedImages/cellPropMaps/*.tif’, שהם מפת החום של מאפיינים סלולריים. ראה איור 15 לתיאור החזותי של השלבים ליצירת מפות חום של המאפיינים הסלולריים המוערך. בחר מתוך התפריט הנפתח MSM תוצאות – תמונה. בצע את השלבים המתוארים בשלב 2.5.2.הערה: הפלט מאוחסן כקבצי קובץ TIFF בתיקיה ‘phs/segmentedImages/cellPropMaps/’. שמות הקבצים הם מספר מופע הזמן ושם המשתנה המופרדים באמצעות מקף תחתון.
Representative Results
אנו מציגים כאן שניים מהפלטים העיקריים עבור הדוגמה המודגמת. הפלט הראשון הוא מעקב הזמן של מהירות התא ומתח שלד עבור תא מספר 1 (איור 16). המאפיינים מוצגים על ציר אנכי משותף כדי להקל על השיוך החזותי בין המאפיינים, והציר האופקי מציין מספר מופע זמן. בניסוי זה, מסגרות רצופות נרכשו במרווח של 15 דקות. הפלט השני הוא מערך של מפות חום 1 שעות לתוך הניסוי (איור 17). המאפיינים המוצגים כאן כוללים אזור פריסה, אוריינטציה, מעגליות, מהירות, כיוון תנועה, כיוון מתח מרבי, מתח שלד, מתיחות מצע, ואניסוטרופיה מתח של תאים בודדים. איור 1: מבנה ערכת כלים אינטגרטיבית לניתוח אותות סלולריים (iTACS). שני מרכיבים מרכזיים של iTACS הם מודול רכישה והדרכה (AcTrM) ומודול ניתוח ופריטים חזותיים (AnViM). AcTrM יכול להשתמש בטכניקות הכנה הידרוג’ל שונות הקיימות כיום להכנת הידרוג’לים שניתן להחזיק בחוזקה על שלב מיקרוסקופ, כל זריעת תאים, ופרוטוקול צמיחה השומר על תאים במישור מוקד אחד. AnViM יכול להשתמש בטכניקות שונות כדי לכמת את עיוות הידרוג’ל ו monolayer, כוחות התא-ECM, וכוחות תא-תאים. ניתן להכיל את כל הרכיבים המועדפים על המשתמש בפרוטוקול מדידות הכוח ב- iTACS, והם זוהו עם תיבות מקווקו. הרכיבים המזוהים עם קופסאות מוצקות הם תרומות חדשניות לטכנולוגיית מדידת הכוח התאי. תצוגה חזותית ב- AnViM מתמקדת בערך החציוני וב ושונות המאפיינים בין תאים בודדים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 2: רכישת תמונת ייחוס – חלק 1. שלבים ליצירת רשימת מיקומים באמצעות AcTrM. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 3: רכישת תמונת התייחסות – חלק 2. שלבים להשגת תמונות ייחוס באמצעות AcTrM. תצוגות מפורטות של שלבים 2, 4 ו- 6 מוצגות בדמויות משלימות S2, S3 ו – S4, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 4: רכישת תמונה אוטומטית עבור הניסוי הנותר. שלבים לחזרת רכישת התמונה כדי להעריך את ההתנהגות הסלולרית באמצעות AcTrM. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 5: הגדרת ניתוח נתונים אוטומטי. שלבים לתחילת ניתוח תמונה אוטומטי באמצעות AnViM. התוכנה מזהה את תבנית התמונה המשמשת את AcTrM. תצוגה מפורטת של הלוחות בשלבים 3 ו-5 מוצגת באיור S5 המשלים ובאיור S6 המשלים, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 6: כימות עיוות של הידרוג’ל ומונו-שכבתייר – חלק 1. צעדים לעסוק, באמצעות AnViM, יישום Velocimetry תמונת החלקיקים של Tseng, Q. et al., PNAS (2012)20 כדי לכמת עיוות של פני השטח העליון של הידרוג’ל. משתמשים יכולים גם ליישם בתוך AnViM גישות אחרות כדי לכמת עיוות הידרוג’ל. תצוגה מפורטת של שלב 3 מוצגת באיור S7 המשלים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 7: כימות עיוות של הידרוג’ל ומונו-שכבתייר – חלק 2. צעדים לעסוק, באמצעות AnViM, יישום Velocimetry תמונת חלקיקים של Tseng, Q. et al., PNAS (2012)20 כדי לכמת את התנועה המקומית של תאים בודדים. משתמשים יכולים גם ליישם בתוך AnViM גישות אחרות כדי לכמת את התנועה הסלולרית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 8: כימות של כוחות תא-ECM ותא-תאים. שלבים לביצוע ניתוח תמונה כדי לעסוק, באמצעות AnViM, יישום מיקרוסקופיית המתיחה של פורייה של Trepat et al., Nature Physics (2009)15 כדי לכמת כוחות המופעלים על ידי התאים על ההידרוג’ל, ויישום מיקרוסקופיית מתח Monolayer של Tambe et al., חומרי טבע (2011)1 כדי לכמת כוחות בתוך תאים בודדים ובין תאים שכנים. משתמשים יכולים גם ליישם בתוך AnViM גישות אחרות כדי לכמת את כוחות התא-ECM ותא-תא. תצוגה מפורטת של שלב 6 מוצגת ב איור משלים S8 ו איור משלים S9. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 9: מיפוי ערכי נקודת רשת בתאים בודדים – חלק 1. שלבים לפלח אזורי התמונה המכילים תאים באמצעות גישה חדשנית מרובת חבטות. גישה זו יכולה לשמש לפלח תמונות ניגודיות פאזה, Brightfield או פלואורסצנטיות של התאים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 10: מיפוי ערכי נקודת רשת בתאים בודדים – חלק 2. שלבים לפלח תאים בודדים של monolayer באמצעות גישה רבת גני חדשני שפותחה ב- AnViM. גישה זו יכולה לשמש לפלח תמונות ניגודיות פאזה, Brightfield או פלואורסצנטיות של התאים. תצוגה מפורטת של שלב 2 מוצגת באיור S10 משלים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 11: מיפוי ערכי נקודת רשת בתאים בודדים – חלק 3. שלבים להערכת עוצמות הפיקסלים באזור בתוך תאים בודדים ובתוך האזור השכן של תאים בודדים באמצעות AnViM. העוצמות המוערכות כוללות עוצמת אור מועברת ועוצמת פלואורסצנטיות. חלק זה ממפה את הערך החציוני ואת סטיית התקן של עוצמות הפיקסלים בתוך תאים בודדים ובתוך אזור סמוך של תאים בודדים. תצוגה מפורטת של שלב 2 מוצגת באיור S11 משלים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 12: מיפוי ערכי נקודות רשת בתאים בודדים – חלק 4. שלבים להערכת כוחות ומאפייני תנועה של נקודות הרשת בתוך תאים בודדים ובתוך האזור השכן של תאים בודדים באמצעות AnViM. חלק זה ממפה את הערך החציוני ואת סטיית התקן של המאפיינים בתוך תאים בודדים ובתוך אזור סמוך של תאים בודדים. תצוגה מפורטת של שלבים 2 ו-3 מוצגים באיור S12 משלים ובאיור S13 משלים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 13: הדמיה של התוצאות – חלק 1. שלבים למעקב אחר מאפיינים של תאים בודדים לאורך כל תקופת הניסוי באמצעות AnViM. תצוגה מפורטת של שלבים 2 ו-3 מוצגים באיור S14 משלים ובאיור S15 משלים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 14: הדמיה של התוצאות – חלק 2. שלבים ליצירת מעקבי זמן של המאפיינים המוערך באמצעות AnViM. למשתמש יש אפשרות להתוות עד שלושה מאפיינים בגרף אחד. מעקבי זמן נוצרים עבור כל התאים או רק עבור התאים שעבורם המעקב הצליח לאורך כל הניסוי. תצוגה מפורטת של שלב 5 מוצגת ב איור משלים S16 ו איור משלים S17. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 15: הדמיה של התוצאות – חלק 3. שלבים ליצירת מפות חום של המאפיינים המוערכים באמצעות AnViM. מפות חום נוצרות עבור כל המסגרות הבאות למסגרת ההתחלה ולכל המאפיינים שנבחרו. תצוגה מפורטת של שלב 3 מוצגת באיור S18 משלים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 16: מעקבי זמן עבור מזהה תא 1. שני מאפיינים המוצגים הם מתח הציטוסד התאי (“avgtenMedian”) ומהירות הסלולר (“speedMedian”). הן מתח הציטוס השלד התאי והן המהירות התאית מכומתים כערך החציוני על פני נקודות הרשת בתוך התאים. שני המאפיינים מותווים על אותו ציר עם יחידות שרירותיות כדי להציג קשרים חזותיים בין המאפיינים המוערך. שמות משתנים נוספים מפורטים בטבלה משלימה S1. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 17: מפות חום של המאפיינים של תאים בודדים על-פני המנו-שכבתית המנותח. כל תא צבוע בערך החציוני של המאפיין המצוין בחלונית. לפיכך, אדום עמוק מציין את הערך התאי המרבי בספקטרום הצבעים, וכחול עמוק מציין את הערך התאי המינימלי על פני המונו-שכבתית המנותח. כפי שתואר בטמבה ואח ‘, PLoS One (2013)2, התאים הממוקמים קרוב יותר לגבול יש כוחות מכניים מושפעים תכונות לא ידועות של התאים מחוץ לתמונה. מכאן שמפת החום נוצרת עבור תאים רחוקים מהגבול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור S1: תמונות לדוגמה של החרוז הפלואורסצנטי העליון והתחתון. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה. איור S2: מבט מפורט על שלב 2 מאיור 3. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה. איור S3: מבט מפורט על שלב 4 מאיור 3. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה. איור S4 A: מבט מפורט על שלב 6 מאיור 3. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה. איור S5: מבט מפורט על שלב 3 מאיור 5. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה. איור S6: מבט מפורט על שלב 5 מאיור 5. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה. איור S7: מבט מפורט על שלב 3 מאיור 6. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה. איור S8: תצוגה מפורטת של פלט הכוח של התא-ECM של שלב 6 מאיור 8. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה. איור S9: תצוגה מפורטת של פלט הכוח התאי של שלב 6 מאיור 8. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה. איור S10: תצוגה מפורטת של שלב 2 מאיור 10. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה. איור S11: תצוגה מפורטת של שלב 2 מאיור 11. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה. איור S12: תצוגה מפורטת של שלב 2 מאיור 12. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה. איור S13: תצוגה מפורטת של הפלט של שלב 3 מאיור 12. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה. איור S14: תצוגה מפורטת של שלב 2 באיור 13. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה. איור S15: תצוגה מפורטת של שלב 3 מאיור 13. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה. איור S16: תצוגה מפורטת של קבצי נתונים שנוצרו בשלב 5 מאיור 14. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה. איור S17: תצוגה מפורטת של עלילה שנוצרה בשלב 5 מאיור 14. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה. איור S18: תצוגה מפורטת של מפת חום והקובץ המכיל את טווח ספקטרום הצבעים שנוצר בשלב 4 מאיור 15. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה. טבלה S1: רשימה של מאפיינים נבחרים הממותבים על-ידי iTACS. נא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
Discussion
תאים דבקים משתמשים באותות מכניים וכימיים כדי לשרוד, לגדול ולתפקד. מגוון רחב של תוכנות מיקרוסקופיה מייעל את חוויית המשתמש בהערכת האותות הכימיים באמצעות הדמיה מבוססת פלואורסצנטיות. עם זאת, הערכת האותות המכניים כרוכה ביכולות שאינן זמינות בתוכנת המיקרוסקופיה הסטנדרטית. יתר על כן, ההערכה של אותות מכניים היא היעילה ביותר כאשר רכישת נתונים משולבת עם ניתוח נתונים. היעדר פלטפורמה מאוחדת העונה על הצרכים הייחודיים של הערכת אותות מכניים היווה פער טכנולוגי גדול בביולוגיה של התאים הניסיוניים. ערכת הכלים האינטגרטיבית לניתוח אותות סלולריים (iTACS) נועדה לעמוד בפער זה. שני הרכיבים של iTACS, AnViM ו- AcTrM, מציידים את המשתמשים ביכולות הדרושות לכימות תכונות תאיות של ארבע קטגוריות רחבות: כוחות, תנועה, מורפולוגיה, פלואורסצנטיות / בהירות. בקטגוריות אלה, iTACS מסוגל כעת לחשוף יותר מ-50 היבטים ייחודיים של תאים חסידיים בודדים. היבטים אלה כוללים מאפיינים ספציפיים של כל קטגוריה רחבה, כולל הערך הייצוגי שלהם והשונות שלהם על פני התא (טבלה משלימה S1). לדוגמה, בתוך הכוחות, ישנם כוחות מתיחה ברחבי cytoskeleton, אניסוטרופיה של מתח זה, הכיוון של מתח מקסימלי, ומתח גיזה על פני ממשק התא-ECM שיש לו השפעה עמוקה על ההתנהגות של תאים דבקים1,3,6.
גישה חדשנית לבחינת ההתנהגות המכנית של תאים בודדים של מונולייר
תאים בודדים של monolayer עוסקים בחילופי אותות של טבע כימי ומכאני3. שני סוגים אלה של אותות מועברים על פני monolayer הסלולר באופן שונה23. עם זאת, הידע בהעברת האות המכני מפגר אחרי זה של העברת אותות כימיים. פער ידע זה עולה בקנה אחד עם חוסר מתמשך של גישות פשוטות ואינטואיטיביות להערכת אותות מכניים סלולריים. גישת מיפוי הנתונים החדשנית המתוארת כאן מצוידת למלא את הפער הזה. מיפוי כזה מגלה כי תנודה של מתח ציטוס שלד מהותי באזור השכן של התא משמשת הרפיה, נוזלים, ועיגון אותות המווסתים שינויים בצורת התא, בגודל ובמהירות של התא18. מפות של המאפיינים של אזורים שכנים מציגות דפוסי “תת-חלוקה רב-תאית” שבהם תאים בתוך חלוקת המשנה חשופים למיקרו-סביבה אחידה יחסית והתאים בגבול חלוקת המשנה חשופים למיקרו-סביבה לא-יחידה להפליא18.
נגישות טכנולוגיית מדידת הכוח
קיים מגוון פרוטוקולים כדי להפוך הידרוג’לים PAA, לנתח עיוות הידרוג’ל ותנועה תאית, ולכומת את כוחות התא-ECM ותאי1,2,7,8,9,13,14,15,18,20,21,24,25,26,27 28,29,30,31,32. עם זאת, התפתחויות אלה נשארות מחוץ להישג ידן של מעבדות ביולוגיות נפוצות של התא ומוגבלות למעבדות עם מומחיות הנדסית. על ידי הפיכת ההיבטים הטכניים של גישות אלה לאוטומטיים ושילובן תחת פלטפורמה מאוחדת וידידותית למשתמש, המטרה של iTACS היא להפוך את הערכת האותות המכניים לפעילות שגרתית במחקר וחינוך ביולוגיה של תאים ניסיוניים.
ImageJ מאפשר למשתמשים לפתח יישומים באמצעות גישות הדורשות הכשרה מועטה או ללא הכשרה11. iTACS בנויה ברובה באמצעות גישות Scripting פשוטות כדי להקל על המשך הפיתוח המונע על ידי הקהילה. חלק גדול של AcTrM מתוכנת באמצעות סקריפטים של BeanShell, ואת רוב AnViM מתוכנת באמצעות פקודות מאקרו ImageJ. סקריפטים אלה והדרכה ליישום יכולות אלה במיקרוסקופ של המשתמש זמינים באמצעות GitHub (https://github.com/IntegrativeMechanobiologyLaboratory/iTACS).
תקינה איכותית של התמונות שנרכשו
למרות שהטכניקות המבוססות על מצע אלסטי לכימות כוחות פיזיים בתאים דבקים פותחו ויושמו במעבדות שונות, הפרוטוקול עדיין חסר סטנדרטיזציה. תחום אחד שהכי זקוק לתקנון הוא איכות תמונות החרוזים המובילות שנרכשו (איור S1 משלים). בעיות משמעותיות נובעות מהסחיפה בפוקוס לאורך כל הניסוי. גישת המיקוד מחדש המבוססת על התמונה החדשה שלנו הופכת את המיקוד הזה לתהליך אובייקטיבי. הפרמטרים המוגדרים בשלב הראשון של AcTrM מטילים מגבלות איכות אובייקטיביות הכרחיות. ניתן לתכנת אמצעי תקינה אחרים בגירסאות עתידיות של AcTrM.
הישימות הרחבה של iTACS
בנוסף לכימות היבטים רבים של תאים דבקים, מבנה iTACS מאפשר את השימוש בו לפרוטוקולים וצרכים ניסיוניים שונים. AcTrM מאפשרת אימון עצמי מונחה תוכנה למשתמש. הדמיה במהירות גבוהה הנדרשת על ידי, למשל, הערכה סימולטנית של תנודות סידן ציטופלסמי מוגבלת כיום על ידי המהירות של מיקום מחדש ומיקוד מחדש של חומרה והיא נעשית בצורה הטובה ביותר במיקום אחד בכל פעם. עם זאת, היישום הנוכחי מצויד היטב להדמיה ארוכת טווח, הדמיה מופרעת, שבה לא ניתן לשמור את המדגם בשלב המיקרוסקופ למשך כל תקופת הניסוי. מכיוון שתמונות הייחוס נרכשות בתחילת הניסוי, iTACS מאפשר הדמיה בזמן אמת של אותות מכניים, ופותח אפיקים חדשים ביישומי סינון תרופות. AnViM מאפשר למשתמשים לספק מידע טכני ביותר במונחים של הדיוטות. היכולת לכמת קשת רחבה של תכונות תאיות ולעקוב אחריהם לאורך הניסוי מהווה יכולות קריטיות הדרושות לגילוי מנגנוני תקשורת בין-תאיים חדשים.
לפיתוח עתידי של iTACS, זיהינו ארבעה תחומי מיקוד: (1) שיפור מהירות רכישת נתונים וניתוח נתונים, (2) יישום גישות להערכת אותות סלולריים חדשים13, (3) פיתוח של סדנאות ומודולי חינוך בהערכת אותות סלולריים מבוססי iTACS, (4) פיתוח פתרונות אוטומציה בעלות נמוכה.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D.T.T. תודה צוות המזוהה עם המרכז לביולוגיה של ריאות באוניברסיטת דרום אלבמה על גירוי דיונים על הצרכים המחקרי הביולוגיה של התא ניסיוני. דיונים אלה היו חיוניים בייזום הפיתוח של iTACS.
עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענקים מהמכון הלאומי לבריאות / דם ריאות הלב הלאומי, P01 HL66299 ו- R37 HL60024 (סטיבנס), R01-HL118334 (אלוורז), F32-HL144040-01 (שו), ומאוניברסיטת דרום אלבמה באמצעות אברהם מיטשל קרן לחקר הסרטן (סינג, פלנקי, טמבה), מענק מחקר ופיתוח מלומד (טמבה), מכללת כבוד, ועמית מחקר לתואר ראשון בקיץ (Nguyen).
Materials
| Reagents and components used in prepare glass surface for hydrogel coating | |||
| (3-Aminopropyl)trimethoxysilane, 97% | Aldrich chemistry | 13822565 | |
| 2% Bis Solution | Bio-rad | 1610142 | |
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate,98% | Acros organics | 2530850 | |
| 40% Acrylamide Solution | Bio-rad | 1610140 | |
| Glass bottom 35 mm dish/ 6 or 12 or 24 well plates | MatTek or CellVis | ||
| Glutaraldehyde, EM Grade, 25% | Polysciences | 1909100 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-aldrich | 1002074706 | |
| Reagents and components used in preparing suitable hydrogel | |||
| 2% Bis Solution | Bio-rad | 1610142 | |
| 40% Acrylamide Solution | Bio-rad | 1610140 | |
| Ammonium Persulfate | Bio-rad | 1610700 | |
| Cover Slips | Electron Microscopy Sciences | 7222301 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (1M) | Gibco | 14190136 | |
| FluoSpheres carboxylate 0.2 um, yellow-green(505/515) | Invitrogen | F8811 | |
| FluoSpheres carboxylate 0.5 um, red(580/605) | Invitrogen | F8812 | |
| FluoSpheres carboxylate 2.0 um, red(580/605) | Invitrogen | F8826 | |
| Rain-X | |||
| TEMED | Bio-rad | 1610801 | |
| Reagents used in coating extracellular matrix on the hydrogel | |||
| Collagen Type I Rat Tail | Corning | 354236 | |
| HEPES(1M) | Gibco | 15630080 | |
| Phosphate Buffered Saline (1M) | Gibco | 10010023 | |
| Sulfo-SANPAH | CovaChem | 102568434 | |
| Microscope hardware used in the current study | |||
| Camera | Hamamatsu Flash 4.0 LT sCMOS Camera | C11440-42U | |
| H117 ProScanTM Stages | Prior Scientific | ||
| Light source- Lambda DG4 and Lambda DG5 | Sutter instrument company | ||
| Microscope | Nikon eclipse TE2000-S | 550372 | |
| ProScan III Universal Microscope Automation Controller | Prior Scientific | ||
| Stagetop incubator | ibidi | 11922 | |
| Stepper Motor Focus Drive | Prior Scientific |
References
- Tambe, D. T., et al. Collective cell guidance by cooperative intercellular forces. Nature Materials. 10 (6), 469-475 (2011).
- Tambe, D. T., et al. Monolayer stress microscopy: limitations, artifacts, and accuracy of recovered intercellular stresses. PloS One. 8 (2), 55172 (2013).
- Das, T., et al. A molecular mechanotransduction pathway regulates collective migration of epithelial cells. Nature Cell Biology. 17 (3), 276-287 (2015).
- Vedula, S. R., et al. Mechanics of epithelial closure over non-adherent environments. Nature Communications. 6, 6111 (2015).
- Lamason, R. L., et al. Rickettsia Sca4 reduces vinculin-mediated intercellular tension to promote spread. Cell. 167 (3), 670-683 (2016).
- Sunyer, R., et al. Collective cell durotaxis emerges from long-range intercellular force transmission. Science. 353 (6304), 1157-1161 (2016).
- Dong, L., Oberai, A. A. Recovery of cellular traction in three-dimensional nonlinear hyperelastic matrices. Computer Methods in Applied Mechanics and Engineering. 314, 296-313 (2017).
- Nier, V., et al. Kalman inversion stress microscopy. Biophysical Journal. 115 (9), 1808-1816 (2018).
- Serrano, R., et al. Three-dimensional Monolayer Stress Microscopy. Biophysical Journal. 117 (1), 111-128 (2019).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of Image Analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji – an Open Source platform for biological image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. Computer control of microscopes using microManager. Current Protocols in Molecular Biology. , 20 (2010).
- Patel, N. G., et al. Unleashing shear: Role of intercellular traction and cellular moments in collective cell migration. Biochemical and Biophysical Research Communications. 522 (2), 279-285 (2020).
- Yeung, T., et al. Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion. Cell Motility and the Cytoskeleton. 60 (1), 24-34 (2005).
- Trepat, X., et al. Physical forces during collective cell migration. Nature Physics. 5, 426-430 (2009).
- Aratyn-Schaus, Y., Oakes, P. W., Stricker, J., Winter, S. P., Gardel, M. L. Preparation of complaint matrices for quantifying cellular contraction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (46), (2010).
- King, J., et al. Structural and functional characteristics of lung macro- and microvascular endothelial cell phenotypes. Microvascular Research. 67 (2), 139-151 (2004).
- Patel, G., et al. Mechanical signaling in a pulmonary microvascular endothelial cell monolayer. Biochemical and Biophysical Research Communications. 519 (2), 337-343 (2019).
- Kähler, C. J., et al. Main results of the 4th International PIV Challenge. Experiments in Fluids. 57 (6), 97 (2016).
- Tseng, Q., et al. Spatial organization of the extracellular matrix regulates cell-cell junction positioning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (5), 1506-1511 (2012).
- Alvarez-Gonzalez, B., et al. Two-layer elastographic 3-D traction force microscopy. Scientific Reports. 7, 39315 (2017).
- Makarchuk, S., Beyer, N., Gaiddon, C., Grange, W., Hebraud, P. Holographic traction force microscopy. Scientific Reports. 8 (1), 3038 (2018).
- Janmey, P. A., Miller, R. T. Mechanisms of mechanical signaling in development and disease. Journal of Cell Science. 124 (1), 9-18 (2011).
- Dembo, M., Oliver, T., Ishihara, A., Jacobson, K. Imaging the traction stresses exerted by locomoting cells with the elastic substratum method. Biophysical Journal. 70 (4), 2008-2022 (1996).
- Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).
- Butler, J. P., Tolic-Norrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology: Cell Physiology. 282 (3), 595-605 (2002).
- Saez, A., et al. Traction forces exerted by epithelial cell sheets. Journal of Physics. Condensed Matter. 22 (19), 194119 (2010).
- Deforet, M., et al. Automated velocity mapping of migrating cell populations (AVeMap). Nature Methods. 9 (11), 1081-1083 (2012).
- Polio, S. R., Smith, M. L. Patterned hydrogels for simplified measurement of cell traction forces. Methods in Cell Biology. 121, 17-31 (2014).
- Toyjanova, J., et al. 3D Viscoelastic traction force microscopy. Soft Matter. 10 (40), 8095-8106 (2014).
- Serra-Picamal, X., Conte, V., Sunyer, R., Munoz, J. J., Trepat, X. Mapping forces and kinematics during collective cell migration. Methods in Cell Biology. 125, 309-330 (2015).
- Charrier, E. E., et al. A novel method to make viscoelastic polyacrylamide gels for cell culture and traction force microscopy. APL Bioengineering. 4 (3), 036104 (2020).
Cite This Article
Nguyen, A., Battle, K., Paudel, S. S., Xu, N., Bell, J., Ayers, L., Chapman, C., Singh, A. P., Palanki, S., Rich, T., Alvarez, D. F., Stevens, T., Tambe, D. T. Integrative Toolkit to Analyze Cellular Signals: Forces, Motion, Morphology, and Fluorescence. J. Vis. Exp. (181), e63095, doi:10.3791/63095 (2022).