JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

Hücresel Sinyalleri Analiz Etmek için Bütünleştirici Araç Seti: Kuvvetler, Hareket, Morfoloji ve Floresan

Published: March 05, 2022
doi:
10.3791/63095
, , , , , , , , , , , ,
1Biomedical Sciences, Pat Capps Covey College of Allied Health Professions,University of South Alabama, 2Department of Physiology and Cell Biology, College of Medicine,University of South Alabama, 3Center for Lung Biology, College of Medicine,University of South Alabama, 4William B. Burnsed Jr. Mechanical, Aerospace, and Biomedical Engineering Department, College of Engineering,University of South Alabama, 5Mitchell Cancer Institute, College of Medicine,University of South Alabama, 6Department of Chemical and Biomedical Engineering,West Virginia University, 7Department of Pharmacology, College of Medicine,University of South Alabama, 8Department of Physiology & Pharmacology, College of Osteopathic Medicine,Sam Houston State University

Summary

Hücresel Sinyalleri Analiz Etmek için Bütünleştirici Araç Seti (iTACS) platformu, bağlı hücrelerdeki çok çeşitli kimyasal ve mekanik sinyalleri aynı anda ölçme işlemini otomatikleştirir. iTACS, topluluk odaklı gelişimi kolaylaştırmak ve araştırmacıların eğitim geçmişlerine bakılmaksızın tüm platform özelliklerini kullanmalarını sağlamak için tasarlanmıştır.

Abstract

Hücresel kuvvetlerin ve hareketin nicel değerlendirmesi son 40 yılda önemli ölçüde ilerlemiştir. Bu gelişmeler, hücre kültürü sistemlerindeki içgörülü mekanik sinyalizasyon süreçlerini incelemek için çerçeve sağladı. Bununla birlikte, alan şu anda üç sorunla karşı karşıyadır: elde edilen verilerin kalite standardizasyonunun olmaması, veri analizi ve görselleştirmede teknik hatalar ve belki de en önemlisi, teknoloji yaygın hücre biyolojisi laboratuvarları için büyük ölçüde ulaşılamaz durumdadır. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için yeni bir deneysel platform geliştirdik – Hücresel Sinyalleri Analiz Etmek için Bütünleştirici Araç Seti (iTACS). iTACS iki bileşenden oluşur: Edinme ve Eğitim Modülü (ACTrM) ve Analiz ve Görselleştirme Modülü (AnViM). ACTrM, NIH-ImageJ tabanlı bir mikroskop kontrol yazılımı olan μManager’ı temel alıyor ve ortak görüntü alma protokollerinin kullanıcı tarafından kendi kendine eğitilmesini ve otomasyonunun kolaylaştırılmasını kolaylaştırıyor. AnViM, NIH-ImageJ’ye dayanır ve veri analizinin kullanıcı dostu otomasyonunu ve sonuçların içgörülü görselleştirilmesini kolaylaştırır. Bu deneyler, hidrojeller üzerindeki yapışan hücrelerin kültleştirilmesini, hidrojel içine gömülü fidüsyal belirteçlerin görüntülenmesini ve son olarak bu görüntülerden hücrelerin kapsamlı bir mekanik karakterizasyonunun çıkarılmasını içerir. Şu anda, iTACS kullanıcının morfoloji, hareket, sitoskeletal kuvvetler ve tek tek hücrelerin ve komşu bölgelerinin floresanını içeren çok çeşitli özellikleri analiz etmesini ve izlemesini sağlar. Kalite standardizasyonu sorunu, referans görüntü destekli yeniden odaklama tekniği olan ACTrM’de ele alındı. Veri analizindeki teknik sorunlar, anvim’de çok uçlu görüntü segmentasyon prosedürü, sınır koşullarını tanımlamak için kullanıcı dostu bir yaklaşım ve yeni bir hücresel özellik tabanlı veri görselleştirmesi ile ele alındı. ACTrM, temel floresan mikroskopların deneysel hücre mekaniği makinelerine basit dönüşümlerini kolaylaştırmak için tasarlanmıştır ve AnViM, kullanıcıların mühendislik arka planı gerektirmeden hücresel mekanik sinyalleri ölçmelerini sağlamak için donatılmıştır. iTACS, topluluk odaklı geliştirme özelliklerine sahip açık kaynaklı bir paket olarak araştırma topluluğuna sunulacaktır.

Introduction

Yaygın olarak kullanılan optik görüntüleme ve veri analizi araçları, neredeyse eskimiş donanım ve yazılım teknolojilerini kullanmaktadır. Elektronik cihazlardaki ilerlemelerin, hesaplamalı yaklaşımların ve matematiksel analizin yaygın deneysel hücre biyolojisi araçlarına çevrilmesi ve uygulanmasındaki gecikme, hücresel fizyoloji bilgimizdeki büyüme hızı üzerinde önemli bir kısıtlamadır. Şu anda, hücre biyolojisi araştırmacıları ulaşılabilecek moleküler biyoloji araçları bulmaktadır, ancak mühendislik ilkelerine dayanan araçlar ulaşılamazdır. Bu tür mühendislik ilkelerine dayalı bir araç Monolayer Stres Mikroskopisi (MSM)1,2’dir. MSM dünya çapında çeşitli laboratuvarlarda uyarlanmış ve incelenmiş olsa da, kullanımı öncelikle mühendislik uzmanlığına sahip laboratuvarlarla sınırlıdır3,4,5,6,7,8,9.

NIH-ImageJ, hücre biyolojisi araştırmacıları arasında en popüler açık kaynaklı araçlardan biridir10. Kullanıcı topluluğu katkı odaklı gelişmeler popülerliğinin merkezinde yer 11,12 olmuştur. ImageJ, kullanıcıların gelişmiş bir programlama dili ve basitleştirilmiş komut dosyası yaklaşımlarının bir karışımıyla uygulama geliştirmelerine izin veren özelliklere sahiptir. Bu özellikler, temel programlama bilgisine sahip kullanıcıların yazılıma yeni katkıları uygulamasını, uyarlamasını ve ilerletmesini kolaylaştırır. NIH-ImageJ’in bu niteliklerine dayanarak, çok çeşitli kimyasal ve mekanik sinyallerin yapışan hücreler arasında ölçümünü otomatikleştirmek için istenen donanım ve yazılım araçlarının düşük maliyetli entegrasyonunu sağlayan Hücresel Sinyalleri Analiz Etmek için Bütünleştirici Araç Seti’ni (iTACS) geliştirdik11,12.

iTACS iki bileşenden oluşur: Edinme ve Eğitim Modülü (ACTrM) ve Analiz ve Görselleştirme Modülü (AnViM). ACTrM, kullanıcıların geleneksel optik özelliklerin zaman atlamalı ölçümlerini ve birden fazla numunedeki yapışık hücrelerin çeşitli fiziksel özelliklerini ayarlamalarını sağlamak için NIH-ImageJ tabanlı bir görüntü alma uygulaması olan μManager üzerine inşa edilir12. ACTrM, grafik arayüzde yer alan kısa yol tarifleri aracılığıyla kullanıcı eğitimini kolaylaştırır. Buna ek olarak, fiziksel kuvvetlerin gerçek zamanlı ölçümlerini kolaylaştırmak ve elde edilen verilerin kalite standardizasyonunu sağlamak için tasarlanmış referans görüntü tabanlı otomatik odaklamanın yeni bir özelliğine sahiptir.

AnViM, kullanıcıların hücresel şekil, boyut, oryantasyon, hız ve hareket yönü, hücre dışı matris (ECM) üzerinde uygulanan çekişler ve komşu hücreler, hem bireysel bağlı hücrelerin hem de komşu bölgelerinin sözleşme ve kesme anları dahil olmak üzere 50’den fazla özelliği nicel olarak değerlendirmelerini sağlayan ImageJ eklentileri, hızlandırılmış yazılım ve dosya işleme komut dosyaları üzerine inşa edilmiştir. AnViM, kullanıcıların temel teknik arka plana hakim olmadan hücresel fiziksel özellikleri ölçmelerini kolaylaştırır11. Ayrıca, etkileşimli veya toplu işleme modunda veri analizi sağlar. Mekansal varyasyonu ortaya çıkaran ısı haritaları ve tek tek hücrelerin özelliklerinin zamansal varyasyonlarını gösteren grafikler üretir.

Tipik bir deneyde, kullanıcı, üst yüzeyde uygun hücre dışı matris proteinleri ve iki tür gömülü floresan belirteçleri ile elastik bir hidrojel üzerindeki hücreleri kültürler. Esasen, hücreleri kültlemeden önce ve sonra bu floresan belirteçlerin görüntüleri, bireysel hücrelerin içindeki ve etrafındaki kuvvetleri ölçmek için yeterlidir2,13. AnViM, bu sonuçları bağlı kümenin tek tek hücrelerine eşler ve içgörülü görüntüler ve grafikler oluşturur.

Protocol

NOT: iTACS platformu kullanılarak incelenen örnekler, yumuşak bir substrata yapışmış hücrelerdir. Mekanik ve kimyasal sinyalleri değerlendirme protokolü iki sıralı bölüme ayrılmıştır: Edinme ve Eğitim Modülü (ACTrM) ve Analiz ve Görselleştirme Modülü (AnViM). 1. Satın Alma ve Eğitim Modülü (ACTrM) NOT: ACTrM, veri toplama ve kullanıcı kendi kendine eğitim sürecini otomatikleştirir. Herhangi bir veri toplama işleminden önce, hücrelerin üzerinde uyguladığı kuvvetleri ölçmek için gerekli bilgileri sağlayabilen yumuşak bir alt tabaka hazırlayın. Hidrojel hazırlamaNOT: Buradaki amaç, yaklaşık 100 μm kalınlığında ve 22 mm çapında poliakrilamid (PAA) hidrojel olan 1.250 Pa kesme modülü hazırlamaktır. Yeung ve ark. yöntemini izleyerek poliakrilamid çözeltisi hazırlayın ve Trepat ve ark.14,15 tarafından açıklanan adımları izleyerek hidrojelleri atın. Prosedürün bir istisnası, hücrelerin hemen altına gömülü boncukların 0,5 μm çapında olması ve sarı floresan yayılmasıdır. Görüntüleme alanının büyük bir hücresiz bölgeye sahip olması bekleniyorsa, kapak kılıflarına 2 μm boncuk takma adımını atlayın.NOT: Hidrojel hazırlama protokolü artık sahada oldukça oluşturulmuştur16. Sonraki açıklama boyunca, 0,5 μm boncuklar ‘üst boncuklar’ ve 2 μm boncuklar ‘alt boncuklar’ olarak adlandırılır. Ancak, alt boncuklar, görüntülenmiş bölgenin büyük bir hücresiz alan içerdiği durumlarda isteğe bağlıdır. Böyle hücresiz bir bölgeden gelen üst boncuk deseni, alt boncuk deseninin amacına hizmet edecektir. Hidrojelleri mikroskop aşamasına gömülü floresan boncuklarla monte edin. Plakanın sıcaklığının sabit bir duruma geçmesi için 15-20 dakika izin verin.NOT: Plakanın üst yüzeyi hücre dışı matris proteinleri ile işlevsel hale getirilir, ancak hücreler henüz hidrojel üzerinde tohumlanmamıştır. Referans görüntü alımı Bölüm 1: Pozisyon listesi oluşturmaNOT: Bu adımda manuel giriş, en iyi boncuk dağıtımına sahip konumları seçmek için ACTrM istemlerini takip etmeyi içerir. Bu adımda önceden oluşturulmuş dosya kullanılmaz. Bu adımda üretilen önemli yeni klasörler arasında ‘t0imgs’, ‘tnimgs’ ve ‘textfiles’ klasörleri bulunur ve üretilen dosya konum listesi dosyasını içerir. AcTrM kullanarak konum listesi oluşturulmasına rehberlik eden aşağıdaki adımların görsel açıklaması için Şekil 2’ye bakın. Gösterilen örnek, 20x büyütmede veri alır. μManager 2.0 – Beta’yı başlatın. IMBL Kaynakları penceresindeki AcTrM.bsh düğmesine tıklayarak ACTrM’yi çalıştırın . Edinme Özelliklerini Tanımla başlıklı pencerede, uygun hedefi, yanal pozisyon (xY) kurtarmanın doğruluğuna toleransı, kaba ve rafine yeniden odaklama (örneğin, z) işleminin adım boyutunu ve odak kurtarma için kabul edilebilir görüntü korelasyon katsayısının değerini seçin.NOT: Yanal pozisyon kurtarma için daha ince bir tolerans pozisyon kurtarmayı yavaşlatır, ancak önemli bir tolerans veri analizi sırasında pozisyon düzeltmeye ihtiyaç duyacaktır ve odak kurtarmada zorluğe neden olabilir. Daha küçük bir adım boyutu yeniden odaklama işlemini yavaşlatır, ancak çok yüksek bir adım boyutu odağı kaçırma fırsatlarıyla hızlı harekete neden olabilir. AcTrM – Adım 0 penceresinde, bir pozisyon listesi oluşturmak için Yeni Edinme’yi seçin.NOT: AcTrM – Adım 1 başlıklı pencerede sonraki tüm önemli adımlar listelenmiştır. Bu adımlar sahneyi taşımayı, odağı ayarlamayı ve μManager’daki düğmelere tıklamayı içerir. Bu adımlar, veri alımına uygun pozisyonların listesini oluşturmada kılavuz oluşturur. AcTrM – Adım 1 penceresinde listelenen manuel ayarlamalar için örnekleri görselleştirmek için Micromanager’da Canlı’ya tıklayın. Bu pencerede listelenen adımları izleyin. Şimdi boncukların görüntüsünü alın. Üst boncuklar için uygun kanalı seçin. Alt boncuklara da baktığınızdan emin olun. Bunu yapmak için, alt boncukların kanallarını seçin. Alt boncukların bulanık bir görüntüsü görülür.NOT: Kanallar, ana μManager penceresindeki önceden ayarlanmış açılır menüden değiştirilebilir. Denemede alt boncuklar kullanılıyorsa, seçilen konumda olduklarından emin olun. Bu boncuklar bulanık görünecektir. Uygun konumu seçtikten sonra, konumu kaydetmek için Sahne Alanı Konum Listesi penceresinde İşaretle’yi tıklatın.NOT: En iyi konum, üst yüzeyin hemen altına gömülü üst boncukların (yani üst boncukların) ve kapak camına bağlı en az iki boncukun (yani alt boncukların) yoğun ve düzgün bir dağılımı ile tanımlanır (Ek Şekil S1). Alt boncuklar büyük, odak dışı halkalar olarak görünürse odak kurtarma daha hızlıdır. Ancak, denemeler odak veya yanal konum kurtarma gerek kalmadan tek bir konumda yapılırsa, alt boncuk görüntüsüyle ilgili talimatları yoksayın. Listeye ek pozisyonlar eklemek için Şekil 2’de açıklanan 6-9 arası adımları izleyin.NOT: Birkaç ek pozisyon seçin, böylece bir eleme turu plakada seçilen en iyi pozisyonlara izin verebilir. Bölüm 2: Referans görüntülerinin alınmasıNOT: Bu adım herhangi bir el ile giriş içermez. Bu adımda kullanılan önceden oluşturulmuş anahtar dosyaları ‘textfiles/*.pos’ içerir. Bu adımda üretilen önemli yeni dosya ve klasörler arasında ‘t0imgs’ ve ‘tnimgs’ klasörlerindekiler bulunur. AcTrM kullanarak başvuru görüntülerinin alınmasına rehberlik eden aşağıdaki adımların görsel açıklaması için Şekil 3 ve Tamamlayıcı Şekil S2’ye bakın. ACTrM – Adım 2 penceresi de tüm önemli adımları listeler. AcTrM – Adım 2 penceresinde listelenen adımları izleyerek, seçimleri Çok Boyutlu Edinme penceresinde yapın. Örneğin, uzun süreli bir hata gerçekleştirmek için, alınacak birkaç görüntü belirtin, ilk kanalı faz kanalı olarak seçin ve sonra üst boncuklar için bir sonrakini ve bundan sonrakini alt boncuklar için seçin. Çok Boyutlu Edinme penceresinde Kapat’a tıklayın ve ardından ActrM – Adım 2 penceresinde Tamam’a tıklayın. ACTrM – Adım 3 penceresinde, referans görüntü tabanlı XYZ konum kurtarmayı devreye sokmayı seçin. Seçim genellikle evettir. Ancak, görüntüler odak veya sahne kayması için yer olmayan bir konumda elde edilirse, AcTrM – Adım 3 penceresindeki seçim Hayır olacaktır. AcTrM – XYZ Kurtarma Seçenekleri penceresinde, kaba XYZ kurtarma kanalını, rafine XYZ kurtarma için rafine XYZ kurtarma, bölge ve kanal gerçekleştirip gerçekleştirmeyeceği ve yeniden odaklanmaya başlama yönünü ayarlayın (Ek Şekil S4). Tamamlandığında, AcTrM referans görüntüleri alır.NOT: Kanal için tipik seçenekler alt boncuk kanalı olacaktır. XYZ kurtarma, mevcut uygulamada tam görüntü ile gerçekleştirildiğinde en iyi şekilde çalışır. Referans görüntüler genellikle hidrojelin iletilen bir ışık görüntüsünü, üst boncukların floresan görüntüsünü ve alt boncukların floresan görüntüsünü içerir. Her görüntü kümesinin içeriği , Çok Boyutlu Edinme penceresinde yapılan seçimlere bağlı olarak değişebilir. Yine de, yazılım Şekil 2’de belirlenen her konumda ayarlanan referans görüntüyü alacaktır. Bu adımın sonunda, seçilen dizinde üç klasör oluşturulur: ‘t0imgs’, ‘tnimgs’ ve ‘textfiles’. ‘t0imgs’ klasörü, μManager tarafından tanınan ve sonraki adımlarda kullanılan biçimde referans görüntüler içerir; ‘tnimgs’ klasöründe dosya adları ‘c0_p0_t0.tif’, ‘c1_p0_t0.tif’ vb. Burada kanal ‘c’, pozisyon ‘p’ ve ‘t’ zaman anlamına gelir. Bu harflerin ardından sırasıyla kanal numarası, konum numarası ve çerçeve numarası vardır. ‘Textfiles’ klasörü, konum listesini XML biçiminde ve görüntü alma ve konum kurtarma için kullanıcı seçeneklerini içerir. Hücre tohumlama ve büyümeNOT: iTACS platformu, seyrek hücreler, tamamen bir arada monolayer, ağ oluşumu tahlilleri ve delikli veya önemli boşluklu monolayerler de dahil olmak üzere yapışık hücrelerin mekanik davranışlarının ortak in vitro değerlendirmesinde kullanılan numune hazırlama protokollerini karşılama esnekliğine sahiptir. Kültür sıçanı pulmoner mikrovasküler endotel hücreleri bir şişede birleştiğinde17,18. Tripin kullanarak hücreleri ayırın. fetal sığır serumu içeren bir kültür ortamındaki hücreleri 1 x 106 hücre/mL konsantrasyonuna yeniden biriktirin. Yeniden depolanmış hücrelerin 5 μL’lik bir damlacığı kısmen kuru bir hidrojel yüzeyine yerleştirin ve hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin.NOT: fetal sığır serumu içeren kültür ortamında 2 gün kaldıktan sonra, bu damlacıktaki hücreler kalabalık bir hücre adası oluşturur1. Kalan deney için otomatik görüntü almaNOT: Bu adım için el ile giriş, görüntü almaya devam etmek için AcTrM istemlerini takip etmeyi içerir. Bu adım tarafından kullanılan daha önce oluşturulan anahtar dosyaları ‘textfiles/*.pos’ ve ‘t0imgs’ klasöründeki alt boncuk görüntü dosyalarını içerir. Bu adımda üretilen önemli yeni dosyalar güncellenmiş konum listesi dosyaları ve görüntüler ‘tnimgs/*_t*.tif’. Mikroskop çevre kontrol sisteminin kararlı doku kültürü koşullarına ulaştığından emin olun. Kültürlü hücreler içeren plakayı mikroskop aşamasına hafifçe monte edin. Sıcaklık ve nemin stabilize olması için 15-20 dakika izin verin.NOT: AcTrM kullanarak kalan deneme için görüntülerin alınmasına rehberlik eden aşağıdaki adımların görsel açıklaması için Şekil 4’e bakın. μManager 2.0 – Beta’yı başlatın. IMBL Kaynakları penceresindeki AcTrM.bsh düğmesine tıklayarak ACTrM’yi çalıştırın .NOT: Edinme Özelliklerini Tanımla penceresinde yapılan seçimleri yoksayın, ancak önceki adımda yapılan seçimleri kullanın. ACTrM – Adım 0 penceresinde Duraklatılmış Edinmeye Devam Et’i seçin. Veri klasörlerinin (‘t0imags’, ‘tnimgs’ ve ‘textfiles’) kaydedildiği önceki adımda Çok Boyutlu Edinme penceresinde tanımlanan büyütmeyi ve dizini seçin.NOT: Pencerenin başlığı, kullanıcıya uygun dizini seçmesi için rehberlik eder. Plakayı Yeniden Konumlandırma penceresinde, plakayı (üç toplama olmayan konum) yeniden konumlandırma için kullanılan kanalla birlikte seçenekleri belirleyin.NOT: Kaydedilen görüntüler kamerada görülecektir. Çakışan görüntüler kırmızı, yeşil ve siyah renkli görüntü olarak görüntüleniyorsa el ile ayarlama yapın. Edinme işlemine devam etmek için Kabul Et’e tıklayın.NOT: Bu adım, plaka mikroskop aşamasında yeniden monte edildiğinde plaka hizalamasının dayanılmazlığındaki hafif kaymaların üstesinden gelir. Kırmızı renkte gösterilen referans görüntünün (genellikle alt boncukların) ve şu anda yeşil renkte gösterilen hedef aracılığıyla gözlemlenen görüntünün bileşik bir görüntüsünü göstererek üç konumun her birinde hizalamayı hızlandırmak için AcTrM istemlerini izleyin. Yeşili kırmızıya yeterince yaklaştırmak yazılım için daha az iş bırakır. Çakışma mükemmel olduğunda, bileşik görüntü sarı ve siyah görünür. Yeterince yakın, genellikle aynı alt boncuklar hem kırmızı hem de yeşil görüntülerde görünür olduğunda ve karşılık gelen kırmızı ve yeşil odak dışı halkalar birbirine dokunduğunda olur. Plaka yeniden konumlandırma tamamlandıktan sonra, AcTrM sahneyi seçilen her konuma alır ve referans görüntüyü şu anda kamerada görülenlerle eşleştirerek XYZ konumunu kurtarır. İlk yanal (XY) konum eşleştirilir ve sonra odak (Z) eşleştirilir. Kaba toparlanmayı pozisyonun ve odağın rafine toparlanması takip edilir. Denemenin geçerli durumunun güncelleştirmeleri, Tamamlayıcı Şekil S3’te gösterilen dört parçalı bir pencereden ekranda görüntülenir. Elde edilen görüntüler, ‘*_t1.tif’, ‘*_t2.tif’ ardından ‘tnimgs’ klasörüne kaydedilir ve bu da görüntü kümesinin zaman sayısını gösterir. XYZ kurtarma güncelleştirilmiş bir konum tanımlarsa, yeni konum listesi oluşturulur ve ‘metin dosyaları’ klasörüne kaydedilir. 2. Analiz ve Görselleştirme Modülü (AnViM) Otomatik veri analizi ayarlamaNOT: Bu adımda manuel giriş, ‘tnimgs’ klasörünün konumunu tanımlamayı içerir. Bu adımda kullanılan daha önce oluşturulan anahtar dosyalar arasında ‘tnimgs/*.tif’ bulunur. Bu adımda üretilen önemli yeni dosya ve klasörler arasında ‘tnimgs’ ile aynı üst klasördeki ‘analysis’ klasörü ve her konum için klasörler ‘analysis/p*’ bulunur. Her ‘analiz/p*’ içinde, bu adım ‘phs’ ve ‘tny’ klasörlerinde yeni bir ‘*.tif’ görüntü dosyaları oluşturur. Bu görüntüler, hücrelerin ve üst boncukların kırpılmış ve sürüklenmiş görüntüleridir. Oluşturulan diğer dosyalar arasında analiz seçimlerini listeleyen ‘analysis/analysisChoices.txt’, önceden var olan önemli sürüklenme nedeniyle analizin atlandığı örnekleri listeleyen ‘analysis/p*/skipAnalysis.txt’ ve tahmini drift değerlerini listeleyen ‘analysis/p*/part_shift_values_pixel_degree.dat’ sayılıyor. AnViM, ‘tnimgs’ klasöründeki ham verileri değiştirmez. AnViM kullanarak otomatik veri analizinin ayarlanmasına rehberlik eden aşağıdaki adımların görsel açıklaması için Şekil 5’e bakın. Fiji yazılımını başlatın ve MSM açılır menüsünde MSM – ön işleme olarak etiketlenmiş ilk seçeneği belirleyin. Dosya tarayıcısı iletişim kutusunu kullanarak, çözümlenen verileri içeren ‘tnimgs’ klasörünü içeren klasörü seçin. Görüntüler için kanalı tanımlayın. Ek Şekil S5’in yönergelerini izleyerek, hücrelerin iletilen ışık görüntüsünün kanal numaralarını (hücrelerin faz kontrast görüntüsü), alt boncuk görüntüsünü ve üst boncuk görüntüsünü tanımlayın. Aşağıdaki üç onay kutusu (‘Dosyaları konum klasörüne taşı’, ‘Sert hareket için ek düzeltme yap’ ve ‘Verileri kırp ve konum klasörüne kaydet’) genellikle denetlenir. Son olarak, yoğun olarak sürüklenen verileri, piksel boyutunu ve hücrelerin geçtiği görüntünün kenarlarını reddetme toleransı tanımlayın. Boncukların belirgin görünmesi için alt boncuk görüntülerinin parlaklığını ve kontrastını artırma istemine yanıt verin. Menüdeki kaydırıcı çubuğunu kullanarak bunu ayarlayın ve Tamam’ı tıklatın. Şimdi varsa vardiyalardan kurtulmak için konum düzeltmesi gerçekleştirin. Tamamlandığında, bir çözümleme klasörü oluşturulur.NOT: Kontrast geliştirme genellikle gerekli değildir, ancak bu hüküm lazerlere maruz kalmanın en aza indirilmesi gereken deneyler için kullanılabilir. Bu seçimden sonra, AnViM dosyaları ‘tnimgs’ klasöründen ‘analiz’ klasörüne kopyalar. Her konuma karşılık gelen dosyalar ‘analysis/p0, analysis/p1’ vb. Bu konum klasörlerinin her birinde, AnViM sırasıyla orijinal iletilen ışık görüntüsünü, üst boncuk görüntülerini ve alt boncuk görüntülerini içeren ‘cels’, ‘defs’ ve ‘refs’ klasörleri yapar (Ek Şekil S6). AnViM daha sonra alt boncukların görüntülerindeki sert hareketi analiz eder ve hücrelerin düzeltilmiş iletilen ışık görüntüsünü içeren bir ‘phs’ klasörü ve güncellenmiş üst boncuk görüntüleri içeren bir ‘tny’ klasörü oluşturur. Son olarak, kanalların, işlemlerin, toleransın, piksel boyutunun ve sınır geçişinin kullanıcı seçimleri ‘analysisChoices.txt’ dosyasına kaydedilir (Tamamlayıcı Şekil S6). Hidrojel ve monolayer deformasyonunun nicelleştirilmesiNOT: Bir dizi görüntüden hareketin nicelleştirilmesinin hızla gelişen bir alan olduğunu unutmayın19. Teknoloji, hız, doğruluk, ham görüntülerdeki belirli özellikler ve belirli deformasyon desenleri de dahil olmak üzere özellikler için sürekli olarak optimize edilmiştir. Bu nedenle, bazı kullanıcıların burada sunulandan farklı bir deformasyon niceleme yaklaşımı kullanması muhtemeldir. Bölüm 1: Hidrojel deformasyonunun nicelleştirilmesiNOT: Bu adımdaki manuel girişler, veri dizinini tanımlamayı ve kılavuz çözünürlüğü seçimini içerir. Bu adımda kullanılan daha önce oluşturulmuş anahtar dosyalar arasında ‘p*/tny/*.tif’ bulunur. Bunda üretilen önemli yeni dosyalar arasında hidrojel üst yüzeyinin deplasman vektörlerini listeleyen ‘p*/displacement/*_disp.dat’ bulunur. AnViM aracılığıyla, üst boncuk görüntülerindeki Parçacık Görüntüsü Velocimetry analizini devreye sokmak için aşağıdaki adımların görsel açıklaması için Şekil 6’ya bakın20. Fiji yazılımını başlatın ve MSM açılır menüsünden MSM – Jel Deformasyonu’nun öğesini seçin. Buradan, deneme için uygun olan seçeneği belirleyin. Dosya tarayıcısı iletişim kutusunu kullanarak, çözümlenen verileri içeren ‘çözümleme’ klasörünün üst dizinini seçin. Jel Deformasyonunu Hesaplama Parametreleri penceresinde, uygun çapraz korelasyon penceresi boyutunu, gürültü düzeyini ve eşiğini seçin (Tamamlayıcı Şekil S7)20.NOT: Sonuçlar, her konum klasöründeki ‘analysis/p0, analysis/p1’ vb. Tüm çıktı dosyalarının depolandığı yer burasıdır. Bölüm 2: Monolayer deformasyonun nicelleştirilmesiNOT: Bu adımdaki manuel girişler, veri dizinini tanımlamayı ve kılavuz çözünürlüğü seçimini içerir. Bu adımda kullanılan daha önce oluşturulmuş anahtar dosyalar arasında ‘p*/tny/*.tif’ bulunur. Bunda üretilen önemli yeni dosyalar, hücrelerin hareket vektörlerini listeleyen ‘p*/velocity/*_vel.dat’ içerir. AnViM aracılığıyla, üst boncuk görüntülerindeki Parçacık Görüntüsü Velosimetrisi analizi20 ile etkileşime geçme adımlarının görsel açıklaması için Şekil 7’ye bakın. Prosedür, hidrojel deformasyonunu ölçmek için izlenene benzer ve MSM açılır menüsünden MSM – Hücresel Hareket’i seçer. Sonuçlar, her konum klasöründeki ‘analysis/p0’, ‘analysis/p1’ vb. Hücre-ECM ve hücre-hücre kuvvetlerinin nicelleştirilmesiNOT: Bu adımda el ile giriş, veri dizinini tanımlamayı, hidrojel sertliğini göstermeyi ve hücresel olmayan bölgedeki hücreleri algılamak için hücresel küme segmentasyon istemlerine yanıt vermeyi içerir. Bu adımda kullanılan daha önce oluşturulmuş anahtar dosyalar arasında ‘p*/displacement/*_disp.dat’ bulunur. Bu adımda üretilen önemli yeni dosyalar şunlardır: hidrojel üzerindeki hücreler tarafından uygulanan kuvvetleri listeleyen ‘p*/traction/*_trac.dat’; Hücreleri içeren ızgara noktalarının konumunu listeleyen ‘p*/traction/*_domain.dat’; ve bu adım için kullanıcı seçimlerini kaydeden ‘p*/traction.in, p*/clusterInput.txt’ ve ‘p*/prestress.in’ giriş dosyaları. Hücre-ECM ve hücre-hücre kuvvetlerinin ilk nicel değerlendirmesinin ardından, tekniğin çeşitli varyasyonları geliştirilmiştir1,15. Varyasyonlar belirli substrat, hücre, deneysel durum veya sayısal araçlara odaklanır7,8,21,22. Hidrojel deformasyon verileri üzerinde AnViM, Fourier Transform Traction Microscopy ve Monolayer Stress Microscopy analizi yoluyla etkileşim kurmak için görsel açıklama için Şekil 8’e bakın1,2,15. Fiji yazılımını başlatın ve MSM açılır menüsünden MSM – Hücre-ECM ve Hücre Hücre Kuvvetleri’ni (açılır menüde üçüncü seçenek) seçin. Dosya tarayıcısı iletişim kutusunu kullanarak, analiz edilen verileri içeren ‘tnimgs’ ve ‘analysis’ klasörlerini içeren ‘analysis’ klasörünün üst dizinini seçin. Seç’e tıklayın. Hücresel Kuvvetleri Hesaplama Parametreleri penceresinde, kesme modüllerini, hidrojel kalınlığını ve beklenen gürültü seviyesini girin. Tamam’ı seçin. Bu, MATLAB işlevi aracılığıyla çekiş yürütmesini sağlar.NOT: Bu girişleri takiben, AnViM hücre-ECM kuvvetlerini hesaplar. Bundan sonra, monolayer’ın bir arada olup olmadığını belirtin. Tüm hücre görüntüsü hücrelerle kaplıysa, yanıt Evet’tir. Bu durumda, hücre hücresi kuvvetleri tüm çerçeve boyunca hesaplanır. Öte yandan, görüntünün bir bölümünde hücre yoksa, yanıt Hayır’dır. Bu durumda, hücreleri içeren görüntü bölgesinin segmentasyonunu kolaylaştırmak için AnViM istemlerini izleyin. Yanıt hayır ise, yazılım bunu istediğinde hücre dışı nesnenin etrafına el ile bir çokgen çizin ve segmentasyon için uygun bir yöntem seçin. Yazılım, hücrelerin rengini (siyah veya beyaz) isteyecektir. Yazılımda Noktaları Otomatik Olarak Doldur seçeneğini işaretleyin ve Tamam’a tıklayın.NOT: Bir arada olmayan bir monolayerin segmentlere ayırılmasına ilişkin adımlar ‘Bölüm 2.4’ün ilk bölümünde ele alınacaktır. Hücre-ECM kuvvetleri her konum klasöründe yeni oluşturulan bir dizin ‘çekişi’ içinde ‘*_trac.dat’ dosyalarında depolanır ve hücre-ECM kuvvet hesaplama yazılımına giriş ‘traction.in’ dosyasına kaydedilir (Ek Şekil S8). Hücre hücresi kuvvetleri, her konum klasöründe yeni oluşturulan bir dizin ‘prestress’te ‘*_prestress.dat’ dosyalarında depolanır ve hücre hücre gücü hesaplama yazılımına giriş ‘prestress.in’ dosyasına kaydedilir (Tamamlayıcı Şekil S9). Tek tek hücrelerde kılavuz noktası değerlerini eşlemeNOT: iTACS’in mevcut odak noktalarından biri, alandaki ölçülen mekanik sinyalleri yorumlamak için basit bir yaklaşım sunmaktır. Bu yaklaşım, bir kümenin komşu hücreleri arasındaki mekanik etkileşimleri incelemek için faydalıdır18. Genel olarak, şimdiye kadar ölçülen özellikler hücresel küme boyunca düzenli olarak aralıklı ızgara noktalarındadır. Bu veriler, tek tek hücrelerin morfolojik sınırı içindeki seçili özelliklerin ortanca, ortalama ve standart sapması tanımlar ve bunları hücresel fiziksel özellikler/sinyaller olarak atar. Bunlardan, standart sapma değişkenliği belirtmek için kullanılır, ortalama ve ortanca arasındaki fark dağılımın doğasını belirtmek için kullanılır ve ortanca değer seçilen özellikler için hücrelerin genel durumunu belirtmek için kullanılır.Bölüm 1: Hücreleri içeren görüntü bölgesinin segmentasyonuNOT: Bu adıma el ile giriş, veri dizinini tanımlamayı ve hücre olmayan bölgedeki hücreleri algılamak için segmentasyon istemlerine yanıt vermeyi içerir. Bu adımda kullanılan daha önce oluşturulan anahtar dosyalar arasında ‘p*/phs/*.tif’ bulunur. Bu adımda üretilen önemli yeni dosyalar arasında hücre bölgelerini hücresiz bölgelerden ayıran ikili görüntüler olan ‘p*/phs/bwImages/*.tif’, her örnekteki hücrelerin kapsadığı yüzdelik görüntü alanını listeleyen ‘p*/phs/textResults/frameNum_percentHealed.txt’ ve AcTrM arabirimine girilen kullanıcı seçimlerini kaydeden ‘p*/clusterInput.txt’ bulunur. Hücreleri içeren görüntü bölgesini segmentlere ayıracak aşağıdaki adımların görsel açıklaması için Şekil 9’a bakın. Hücre hücre kuvvetleri hesaplanmadan önce bu bölümün tamamlanması gerekir. Bu durumda, bu adımların yinelanması gerekmez. Ayrıca, bu adımlar hücre-hücre kuvveti hesaplamalarından önce yapılırsa, kuvvet hesaplamalarının başında istenmez. Fiji yazılımını başlatın ve MSM açılır menüsünde Segmentasyon – Hücresel Küme’yi seçin. Dosya tarayıcısı iletişim kutusunu kullanarak, düzenli aralıklı ızgara noktalarında ölçülen özellikleri içeren ‘analysis/p0’, ‘analysis/p1’ vb. konum dizinini seçin. Monolayer’ın birleştiğinde olup olmadığını belirtin.NOT: Aşağıdaki adımlar yalnızca monolayer bir arada olmadığında çağrılır. Hücre içeren görüntü bölgelerini tanımlamak için yeni çok uçlu yaklaşımı uygulamak için AnViM istemlerini izleyin. Süreç dört yöntem içerir – her biri segmentasyona farklı bir şekilde yaklaşır. Kombinasyon halinde kullanılan bu yöntemlerden biri veya birkaçı, hücrelerin çok çeşitli görüntülerini kapsar. Bu nedenle, hangi birleşimin verileri için en iyi şekilde çalıştığını bulmak için farklı yaklaşımlar deneyin. Optimum segmentasyon elde etmek için ‘Etki alanı bağlantı faktörü’ ve ‘Smear faktörü’nün ayarını yapın.NOT: ‘Smear faktörü’ hücre içeren bölgeleri daha büyük hale getirir. Hücrelerin ikili görüntüde siyah mı yoksa beyaz mı görünmeyeceğini belirtin. Sınır Görüntüsü’nün Temizleneceği Yol Tarifleri penceresinde, görüntünün otomatik olarak mı yoksa el ile mi temizleneceğini seçin.NOT: Görüntülerin istenmeyen özellikleri, hücrelerin kapladığı piksellerdeki siyah noktalar ve analiz edilecek hücre kümesinden bağlantısı kesilen piksellerdeki beyaz noktalardır. Analiz sadece bağlı olan bölgelerde yapılabilir. Bu nedenle, bağlantısı kesilmiş birden fazla bölge ayrı ayrı analiz edilmelidir. Bölüm 2: Görüntülerdeki tek tek hücrelerin segmentasyonuNOT: Bu adıma manuel girişler, veri dizinini tanımlamayı ve görüntüdeki tek tek hücreleri algılamak için segmentasyon istemlerine yanıt vermeyi içerir. Bu adımda kullanılan daha önce oluşturulan anahtar dosyalar arasında ‘p*/phs/*.tif’ ve ‘p*/phs/bwImages/*.tif’ bulunur. Üretilen önemli yeni dosyalar arasında hücresel morfolojik özellikler içeren ‘p*/phs/textResults/*.csv’ bulunur. Tek katmanlı hücreleri tek tek segmentlere ayıracak aşağıdaki adımların görsel açıklaması için Şekil 10’a bakın. Fiji yazılımını başlatın ve MSM açılır menüsünde Segmentasyon – Tek Tek Hücreler’i seçin. Dosya tarayıcısı iletişim kutusunu kullanarak, düzenli aralıklı ızgara noktalarında ölçülen özellikleri içeren ‘analysis/p0’, ‘analysis/p1’ vb. konum dizinini seçin. Giriş Parametrelerini Seç penceresinde, maksimum en boy oranını, hücre merkezinin hücre sınırına kıyasla ne kadar öne çıktığının belirginliğini ve hücrelerin algılanmasını yönlendirmek için iki bulanıklaştırma parametresini belirtin (Tamamlayıcı Şekil S10). Her konum için görüntü yığınında, en küçük normal hücreye bir çokgen çizin. Bu, alanı hesaplamak için kullanılır. Bundan daha küçük bir şey yazılım tarafından bir hücre olarak kabul edilmeyecektir. Daha sonra en büyük normal hücrenin etrafına bir çokgen çizin ve hücre merkezinin mi yoksa hücre hücresi arabiriminin mi daha parlak olduğunu belirtin.NOT: AnViM daha sonra bu çerçevedeki hücreler hakkında bilgi içeren her kare için ‘phs/textResults/0001.csv’, ‘phs/textResults/0002.csv’ vb. Bu aşamada, bu dosya, bölge, merkezkoid, çevre, oryantasyon, dairesellik, en boy oranı, yuvarlaklık, sağlamlık, hücresiz bölgeden uzaklık dahil olmak üzere hücreler hakkında morfolojik bilgiler içerir. Bu özelliklerdeki uzunluk birimi pikseldir ve açı derece cinsindendir. Son olarak, bu dosya sonraki adımlarda hücresel piksel yoğunluğu, hareket ve kuvvetler içerecek şekilde güncelleştirilir. Bölüm 3: Hücrelerde piksel yoğunluklarının eşlenerek eşlenNOT: Bu adımdaki el ile girişler, veri dizinini tanımlamayı ve eşleme özelliklerini ve parametrelerini seçmeyi içerir. Bu adımda kullanılan daha önce oluşturulan anahtar dosyalar arasında ‘p*/phs/*.tif’ (veya ‘p*/fluo/*.tif’) ve ‘p*/phs/bwImages/*.tif’ bulunur. Bu adımda üretilen önemli yeni dosyalar, hücresel morfolojik özellikleri listeleyen ‘p*/phs/textResults/*.csv’ içerir. Tek tek hücreler ve komşu bölgeleri tarafından kapsanan bölgedeki piksel yoğunluklarını değerlendirmek ve bunları hücrelerin özellikleri olarak tanımlamak için aşağıdaki adımların görsel açıklaması için Şekil 11’e bakın. Fiji yazılımını başlatın ve MSM açılır menüsünden Hücrelerde Eşle – Yoğunluklar’ı seçin. Dosya tarayıcısı iletişim kutusunu kullanarak, düzenli aralıklı ızgara noktalarında ölçülen özellikleri içeren ‘analysis/p0’, ‘analysis/p1’ vb. konum dizinini seçin. Yazılım tarafından istendiğinde Hücre Bölünmesini Algıla veya Hücresel Floresan’ı Ölç’ü seçin. Komşu bölgenin boyutunu tanımlayın. Hem Komşu Bölgenin Özelliklerini Topla hem de Hücrelerin Özelliklerini Topla kutularını işaretleyin. Tamam’a tıklayın. Hücresel Yoğunluğu Kaydetme Amacı penceresinde, yoğunluk eşleme için ne tür bir görüntünün kullanılacağını, komşu bölgenin boyutunu ve verilerin tek tek hücreler veya hem hücreler hem de komşu bölgeleri için toplanıp toplanmadığını belirtin (Tamamlayıcı Şekil S11).NOT: Faz kontrastlı görüntünün piksel yoğunluklarını eşlemek, hücre bölme olaylarının algılanmasını sağlar. Floresan görüntü yoğunluklarının haritalandırılması, floresan etiketli sitoplazmik moleküllerdeki dalgalanmaların tespit edilmesini sağlayacaktır. Yukarıdaki adımların çıktısı, tek tek hücreler için ortalama, ortanca, standart sapma, minimum ve maksimum piksel yoğunluğu değerleridir. Bu numaralar ‘phs/textResults/0001.csv’, ‘phs/textResults/0002.csv’ vb. Bölüm 4: Hücrelerin üzerindeki kuvvetlerin ve hareketin haritalandırılmasıNOT: Bu adıma el ile girişler, veri dizinini tanımlamayı ve eşleme özelliklerini ve parametrelerini seçmeyi içerir. Bu adımda daha önce kullanılan anahtar dosyalar arasında ‘p*/phs/textResults/*.csv’, ‘p*/velocity/*_vel.dat’, ‘p*/displacement/*_disp.dat’, ‘p*/traction/*_trac.dat’, ‘p*/prestress/*_prestress.dat’ ve ‘p*/phs/bwImages/*.tif ‘. Bu adım sırasında yeni dosya oluşturulmaz. Bunun yerine, yeni bilgiler (hücresel kuvvet ve hareket özellikleri) ‘p*/phs/textResults/*.csv’ dosyalarına eklenir. Tek tek hücreler ve komşu bölgeleri tarafından kapsanan bölgedeki kuvvetleri ve hareketi değerlendirme ve bunları hücrelerin özellikleri olarak tanımlama adımlarının görsel açıklaması için Şekil 12’ye bakın. MSM açılır menüsünden seçim yapın Hücrelerde Harita – Hareket/Kuvvet Verileri (Tamamlayıcı Şekil S12). Ardından, 2.4.3 adımında listelenen adımları izleyin.NOT: ‘phs/textResults/0001.csv’ dosyalarına yeni sütunlar eklenir, ‘phs/textResults/0002.csv’ vb. Sonuçların görselleştirilmesi Bölüm 1: Deney genelinde hücresel kimliklerin izlenmesiNOT: Bu adıma el ile girişler, veri dizinini tanımlamayı ve görselleştirmek için eşlenen özellikleri seçmeyi içerir. Bu adımda kullanılan daha önce oluşturulmuş anahtar dosyalar arasında ‘p*/phs/textResults/*.csv’ bulunur. Bu adım sırasında üretilen önemli yeni dosyalar arasında hücresel verilerin zaman izini içeren ‘p*/phs/textResults/cellTimeTrace_*.csv’ bulunur. Denemenin tüm süresi boyunca tek tek hücrelerin özelliklerini izlemek için aşağıdaki adımların görsel açıklaması için Şekil 13’e bakın. Fiji yazılımını başlatın ve MSM açılır menüsünden Sonuçlar – Verileri İzle’yi seçin. Dosya tarayıcısı iletişim kutusunu kullanarak, izlenecek hücresel özellikleri içeren ‘analysis/p0’, ‘analysis/p1’ vb. Bittiğinde Seç’e tıklayın. İzleme için Başlangıç Noktasını Seç penceresinde, izleme için başlangıç çerçevesini ve aynı anda izlenen kare sayısını seçin (Tamamlayıcı Şekil S14). Hız 1 kare numarası için belirlenemediğinden, her zaman kare numarası 2’den başlayın. Bittiğinde Tamam’a tıklayın. İz Yapmak için Değişkenleri Denetle penceresinde, değişken adlarını yazarak veya onay kutularından terimleri seçerek değişkenleri seçin (Tamamlayıcı Şekil S15). Ardından Tamam’a tıklayın.NOT: İzleme, benzersiz bir hücre numarası içeren her sütun ve ardışık zaman örneğini temsil eden her ardışık satırla ‘phs/textResults/cellTimeTrace_*.csv’ dosyaları oluşturur. Bölüm 2: Değerlendirilen hücresel özelliklerin zaman izlerinin üretilmesiNOT: Bu adıma el ile girişler, veri dizinini tanımlamayı ve görselleştirmek için eşlenen özellikleri seçmeyi içerir. Bu adımda kullanılan daha önce oluşturulmuş anahtar dosyalar arasında ‘p*/phs/textResults/cellTimeTrace_*.csv’ bulunur. Bu adım sırasında üretilen önemli yeni dosyalar arasında zaman izleme çizimleri içeren ‘p*/phs/trackedDataPlots/*.tif’, arsa verilerini içeren ‘p*/phs/trackedDataPlots/*.csv’ bulunur. Değerlendirilen hücresel özelliklerin zaman izlerini oluşturmak için aşağıdaki adımların görsel açıklaması için Şekil 14’e bakın. Fiji yazılımını başlatın ve MSM açılır menüsünden Sonuçlar – çizim’i seçin. Dosya tarayıcısı iletişim kutusunu kullanarak, çizilecek izlenen hücresel özellikleri içeren ‘analysis/p0’, ‘analysis/p1’ vb. Evet veya Hayır düğmesini tıklatarak çizimin kırılmamış izlere sahip hücrelerle sınırlandırılıp sınırlandırılamayacağını seçin.NOT: Bu seçenek, bir veya daha fazla zaman örneğinde algılanamayan hücreleri yoksayar. Aynı anda çizilecek değişken sayısını seçin ve Tamam’ı tıklatın.NOT: Şu anda AnViM, aynı çizimde en fazla üç değişkenin görüntülenmesine izin verir. Açılan menü kullanarak çizim yapmak için tek tek değişkenleri seçin.NOT: Bu adımlar, ‘phs/trackedDataPlots/’ klasöründe etiketli bir görüntü dosyası biçimi (TIFF) dosyası ve virgülle ayrılmış bir veri dosyası oluşturur. Dosya adı, alt çizgiyle ayrılmış değişken adlarından oluşur ve hücre numarasıyla sona erer. Bölüm 3: Değerlendirilen hücresel özelliklerin ısı haritalarının üretimiNOT: Bu adımdaki el ile girişler, veri dizinini tanımlamayı ve görselleştirmek için eşlenen özellikleri seçmeyi içerir. Bu adımda kullanılan daha önce oluşturulmuş anahtar dosyalar arasında ‘p*/phs/textResults/cellTimeTrace_*.csv’ bulunur. Bu adımda oluşturulan önemli yeni dosyalar arasında hücresel özelliklerin ısı haritası olan ‘p*/phs/segmentedImages/cellPropMaps/*.tif’ bulunur. Değerlendirilen hücresel özelliklerin ısı haritalarını oluşturma adımlarının görsel açıklaması için Şekil 15’e bakın. MSM açılan menüsünden Sonuçlar – Resim’i seçin. 2.5.2 adımında açıklanan adımları izleyin.NOT: Çıktı, ‘phs/segmentedImages/cellPropMaps/’ klasöründe TIFF dosya dosyaları olarak depolanır. Dosya adları, alt çizgiyle ayrılmış zaman örneği numarası ve değişken adıdır.

Representative Results

Burada gösterilen örnek için iki önemli çıktı sunuyoruz. İlk çıktı, hücresel hız ve 1 numaralı hücre için sitoskeletal gerilimin zaman izidir (Şekil 16). Özellikler arasındaki görsel ilişkiyi kolaylaştırmak için özellikler paylaşılan bir dikey eksende gösterilir ve yatay eksen zaman örneği numarasını gösterir. Bu deneyde, 15 dakikalık bir aralıkta ardışık çerçeveler elde edildi. İkinci çıkış, deneye 1 saat boyunca bir dizi ısı haritasıdır (Şekil 17). Burada gösterilen özellikler yayılma alanı, oryantasyon, dairesellik, hız, hareket yönü, maksimum gerilim yönelimi, sitoskeletal gerilim, substrat çekişleri ve bireysel hücrelerin gerilim anizotropisini içerir. Şekil 1: Hücresel Sinyalleri Analiz Etmek için Bütünleştirici Araç Setinin Yapısı (iTACS). iTACS’in iki temel bileşeni Edinme ve Eğitim Modülü (ACTrM) ve Analiz ve Görselleştirme Modülü (AnViM). ACTrM, mikroskop aşamasında sıkıca tutulabilen hidrojelleri hazırlamak için şu anda mevcut olan çeşitli hidrojel hazırlama tekniklerini, herhangi bir hücre tohumlamasını ve hücreleri bir odak düzleminde tutan bir büyüme protokolünü kullanabilir. AnViM, hidrojel ve monolayer deformasyonunu, hücre-ECM kuvvetlerini ve hücre-hücre kuvvetlerini ölçmek için çeşitli teknikler kullanabilir. Kuvvet ölçümleri protokolünün kullanıcı tarafından tercih edilen tüm bileşenleri iTACS’de barındırılabilir ve kesikli kutularla tanımlanmıştır. Katı kutularla tanımlanan bileşenler hücresel kuvvet ölçüm teknolojisine yeni katkılardır. AnViM’deki görselleştirme, özelliklerin tek tek hücreler arasında ortanca değerine ve değişkenliğine odaklanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 2: Referans görüntü alımı – bölüm 1. AcTrM kullanarak konum listesi oluşturma adımları. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 3: Referans görüntü alımı – bölüm 2. AcTrM kullanarak başvuru görüntüleri edinme adımları. Adım 2, 4 ve 6’nın ayrıntılı görünümleri sırasıyla Ek Rakamlar S2, S3 ve S4’te sunulur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 4: Kalan deney için otomatik görüntü alımı. AcTrM kullanarak hücresel davranışı değerlendirmek için görüntü almaya devam etme adımları. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 5: Otomatik veri analizinin ayarlanması. AnViM kullanarak otomatik görüntü analizine başlama adımları. Yazılım, AcTrM tarafından kullanılan görüntü biçimini tanır. 3. ve 5. basamaklardaki panellerin ayrıntılı bir görünümü sırasıyla Ek Şekil S5 ve Tamamlayıcı Şekil S6’da sunulmaktadır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 6: Hidrojel ve monolayer deformasyonunun nicelleştirilmesi – bölüm 1. Hidrojel üst yüzeyinin deformasyonunu ölçmek için Tseng, Q. ve ark., PNAS (2012)20’nin Parçacık Görüntü Velosimetrisi uygulaması olan AnViM aracılığıyla devreye girme adımları. Kullanıcılar ayrıca AnViM içinde hidrojel deformasyonunu ölçmek için diğer yaklaşımları da uygulayabilirler. Ek Şekil S7’de 3. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 7: Hidrojel ve monolayer deformasyonunun nicelleştirilmesi – bölüm 2. Tek tek hücrelerin yerel hareketini ölçmek için Tseng, Q. ve ark., PNAS (2012)20’nin Parçacık Görüntü Velosimetrisi uygulaması, AnViM aracılığıyla devreye girme adımları. Kullanıcılar ayrıca hücresel hareketi ölçmek için AnViM içinde diğer yaklaşımları da uygulayabilirler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 8: Hücre-ECM ve hücre-hücre kuvvetlerinin nicelemesi. AnViM aracılığıyla , Trepat ve ark.’ın Fourier Transform Traction Mikroskopisi uygulaması, hidrojel üzerindeki hücreler tarafından uygulanan kuvvetleri ölçmek için Doğa Fiziği (2009)15 ve tüm hücreler içindeki ve komşu hücreler arasındaki kuvvetleri ölçmek için Tambe ve ark., Nature Materials (2011)1 Monolayer Stres Mikroskopisi uygulamasını gerçekleştirmek için adımlar. Kullanıcılar ayrıca AnViM içinde hücre-ECM ve hücre hücre kuvvetlerini ölçmek için diğer yaklaşımları uygulayabilir. Ek Şekil S8 ve Tamamlayıcı Şekil S9’da 6. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 9: Tek tek hücrelerdeki ızgara noktası değerlerini eşleme – bölüm 1. Yeni bir çok uçlu yaklaşım kullanarak hücreleri içeren görüntü bölgelerini segmentlere ayıracak adımlar. Bu yaklaşım, hücrelerin faz kontrastını, parlak alanı veya floresan görüntülerini segmentlere ayırabilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 10: Tek tek hücrelerdeki ızgara noktası değerlerini eşleme – bölüm 2. AnViM’de geliştirilen yeni çok uçlu bir yaklaşım kullanarak tek katmanlı bir hücreyi tek tek segmentlere ayıracak adımlar. Bu yaklaşım, hücrelerin faz kontrastını, parlak alanı veya floresan görüntülerini segmentlere ayırabilir. Ek Şekil S10’da 2. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 11: Tek tek hücrelerdeki ızgara noktası değerlerini eşleme – bölüm 3. AnViM kullanarak tek tek hücreler içinde ve tek tek hücrelerin komşu bölgesinde bölgedeki piksel yoğunluklarını değerlendirme adımları. Değerlendirilen yoğunluklar arasında iletilen ışık yoğunluğu ve floresan yoğunluğu yer almaktadır. Bu bölüm, tek tek hücreler içinde ve tek tek hücrelerin komşu bir bölgesinde piksel yoğunluklarının ortanca değerini ve standart sapması eşler. Ek Şekil S11’de adım 2’nin ayrıntılı bir görünümü sunulmuştur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 12: Tek tek hücrelerdeki ızgara noktası değerlerini eşleme – bölüm 4. AnViM kullanarak tek tek hücreler içinde ve tek tek hücrelerin komşu bölgesinde ızgara noktalarının kuvvetlerini ve hareket özelliklerini değerlendirme adımları. Bu bölüm, tek tek hücreler içindeki ve tek tek hücrelerin komşu bir bölgesindeki özelliklerin ortanca değerini ve standart sapmasıyla eşler. 2. ve 3. adımların ayrıntılı görünümü Ek Şekil S12 ve Tamamlayıcı Şekil S13’te sunulmaktadır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 13: Sonuçların görselleştirilmesi – bölüm 1. AnViM kullanarak denemenin tüm süresi boyunca tek tek hücrelerin özelliklerini izleme adımları. 2. ve 3. adımların ayrıntılı görünümü Ek Şekil S14 ve Tamamlayıcı Şekil S15’te sunulmaktadır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 14: Sonuçların görselleştirilmesi – bölüm 2. AnViM kullanarak değerlendirilen özelliklerin zaman izlemelerini oluşturma adımları. Kullanıcı, bir grafikte en fazla üç özellik çizme seçeneğine sahiptir. Zaman izlemeleri, tüm hücreler veya yalnızca izlemenin tüm deneme boyunca başarılı olduğu hücreler için oluşturulur. Ek Şekil S16 ve Tamamlayıcı Şekil S17’de 5. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 15: Sonuçların görselleştirilmesi – bölüm 3. AnViM kullanarak değerlendirilen özelliklerin ısı haritalarını oluşturma adımları. Isı haritaları, başlangıç karesini izleyen tüm kareler ve seçilen tüm özellikler için oluşturulur. Adım 3’ün ayrıntılı bir görünümü ek Şekil S18’de sunulmuştur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 16: Hücre kimliği 1 için zaman izlemeleri. Görüntülenen iki özellik hücresel sitoskeletal gerilim (“avgtenMedian”) ve hücresel hız (“speedMedian”). Hem hücresel sitoskeletal gerilim hem de hücresel hız, hücrelerin içindeki ızgara noktaları boyunca ortanca değer olarak ölçülür. İki özellik, değerlendirilen özellikler arasındaki ilişkileri görselleştirmek için rasgele birimlerle aynı eksende çizilir. Ek değişken adları Tamamlayıcı Tablo S1’de listelenir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 17: Analiz edilen monolayer boyunca tek tek hücrelerin özelliklerinin ısı haritaları. Her hücre, panelde belirtilen özelliğin ortanca değeriyle renklendirilir. Bu nedenle, koyu kırmızı renk spektrumundaki maksimum hücresel değeri, koyu mavi ise analiz edilen monolayer genelinde minimum hücresel değeri gösterir. Tambe ve ark., PLoS One (2013)2’de açıklandığı gibi, sınıra daha yakın bulunan hücreler, görüntünün dışındaki hücrelerin bilinmeyen özelliklerinden etkilenen mekanik kuvvetlere sahiptir. Bu nedenle ısı haritası sınırdan uzak hücreler için oluşturulur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil S1: Üst ve alt floresan boncuk örnek görüntüler. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız. Şekil S2: Şekil 3’ten 2. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız. Şekil S3: Şekil 3’ten 4. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız. Şekil S4 A: Şekil 3’ten 6. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız. Şekil S5: Şekil 5’ten 3. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız. Şekil S6: Şekil 5’ten 5. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız. Şekil S7: Şekil 6’dan 3. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız. Şekil S8: Şekil 8’den 6. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız. Şekil S9: Şekil 8’den 6. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız. Şekil S10: Şekil 10’dan 2. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız. Şekil S11: Şekil 11’den 2. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız. Şekil S12: Şekil 12’den 2. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız. Şekil S13: Şekil 12’den 3. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız. Şekil S14: Şekil 13’teki 2. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız. Şekil S15: Şekil 13’ten 3. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız. Şekil S16: Şekil 14’ten 5. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız. Şekil S17: Şekil 14’ten 5. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız. Şekil S18: Şekil 15’ten 4. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız. Tablo S1: iTACS tarafından ölçülen seçili özelliklerin listesi. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Discussion

Yapışan hücreler hayatta kalmak, büyümek ve işlev görmek için hem mekanik hem de kimyasal sinyaller kullanır. Çok çeşitli mikroskopi yazılımı, floresan bazlı görüntüleme yoluyla kimyasal sinyalleri değerlendirmede kullanıcı deneyimini optimize eder. Bununla birlikte, mekanik sinyallerin değerlendirilmesi, standart mikroskopi yazılımında bulunmayan yetenekleri içerir. Ayrıca, veri toplama veri analizi ile entegre edildiğinde mekanik sinyallerin değerlendirilmesi en verimli olanıdır. Mekanik sinyal değerlendirmesinin benzersiz ihtiyaçlarını karşılayan birleşik bir platformun olmaması, deneysel hücre biyolojisinde önemli bir teknolojik boşluk olmuştur. Hücresel Sinyalleri Analiz Etmek için Bütünleştirici Araç Seti (iTACS) bu boşluğu karşılamak için tasarlanmıştır. iTACS’in iki bileşeni olan AnViM ve AcTrM, kullanıcıları dört geniş kategorinin hücresel özelliklerini ölçmek için gerekli yeteneklerle donatır: kuvvetler, hareket, morfoloji ve floresan/parlaklık. Bu kategorilerde, iTACS şu anda bireysel yapışan hücrelerin 50’den fazla benzersiz yönünü ortaya çıkarabiliyor. Bu yönler, hücre genelinde temsili değerleri ve değişkenlikleri de dahil olmak üzere her geniş kategorinin belirli özelliklerini içerir (Tamamlayıcı Tablo S1). Örneğin, kuvvetler içinde, sitoskeleton boyunca çekme kuvvetleri, bu gerilimin anizotropisi, maksimum gerilimin yönelimi ve bağlı hücrelerin davranışı üzerinde derin bir etkiye sahip hücre-ECM arayüzünde kesme stresi vardır1,3,6.

Bir monolayerin bireysel hücrelerinin mekanik davranışını incelemek için yeni bir yaklaşım
Bir monolayerin bireysel hücreleri, kimyasal ve mekanik nitelikteki sinyallerin değişimiyle uğraşır3. Bu iki tür sinyal hücresel monolayer boyunca farklı bir şekilde iletilir23. Bununla birlikte, mekanik sinyal iletim bilgisi kimyasal sinyal iletiminin gerisinde kalır. Bu bilgi boşluğu, hücresel mekanik sinyalleri değerlendirmek için sürekli basit ve sezgisel yaklaşım eksikliği ile çakışmaktadır. Burada açıklanan yeni veri eşleme yaklaşımı bu boşluğu dolduracak donanıma sahip. Bu tür bir haritalama, bir hücrenin komşu bölgesinde içsel sitoskeletal gerginliğin dalgalanmasının hücresel şekil, boyut ve hücrenin hızındaki değişiklikleri düzenleyen gevşeme, akışkanlaştırma ve bağlantı sinyalleri olarak hizmet ettiğini ortaya koymaktadır18. Komşu bölgelerin özelliklerinin haritaları, alt bölümdeki hücrelerin nispeten düzgün bir mikroçevreye maruz kaldığı ve alt bölümün sınırında bulunan hücrelerin dikkat çekici derecede biçimsiz bir mikroçevreye maruz kaldığı “çok hücreli alt bölüm” desenleri sergiler18.

Kuvvet ölçüm teknolojisinin erişilebilirliği
PAA hidrojelleri yapmak, hidrojel deformasyonunu ve hücresel hareketi analiz etmek ve hücre-ECM ve hücre hücre kuvvetlerini ölçmek için çeşitli protokoller vardır1,2,7,8,9,13,14,15,18,20,21,24,25,26,27 ,28,29,30,31,32. Ancak bu gelişmeler ortak hücre biyolojisi laboratuvarlarının ulaşamayacağı bir yerde kalmakla birlikte mühendislik uzmanlığına sahip laboratuvarlarla sınırlı kalmaktadır. Bu yaklaşımların teknik yönlerini otomatikleştirerek ve birleşik ve kullanıcı dostu bir platform altında entegre ederek, iTACS’ın amacı mekanik sinyallerin değerlendirilmesini deneysel hücre biyolojisi araştırma ve eğitiminde rutin bir faaliyet haline getirmektir.

ImageJ, kullanıcıların çok az eğitim gerektiren veya hiç eğitim gerektirmeyen yaklaşımları kullanarak uygulamalar geliştirmelerine izin verir11. iTACS, topluluk odaklı sürekli geliştirmeyi kolaylaştırmak için büyük ölçüde basit komut dosyası yaklaşımları kullanılarak oluşturulmuştur. AcTrM’nin büyük bir kısmı BeanShell komut dosyaları kullanılarak programlanır ve AnViM’in büyük bölümü ImageJ Makroları kullanılarak programlanır. Bu komut dosyaları ve bu yetenekleri kullanıcının mikroskobuna uygulamak için rehberlik GitHub (https://github.com/IntegrativeMechanobiologyLaboratory/iTACS) aracılığıyla kullanılabilir.

Elde edilen görüntülerin kalite standardizasyonu
Yapışan hücrelerdeki fiziksel kuvvetleri ölçmek için elastik-substrat tabanlı teknikler çeşitli laboratuvarlarda geliştirilmiş ve uygulanmış olsa da, protokol hala standardizasyondan yoksundur. Standardizasyona en çok ihtiyaç duyan alanlardan biri, elde edilen üst boncuk görüntülerinin kalitesidir (Ek Şekil S1). Deney boyunca odaktaki sürüklenmeden önemli sorunlar ortaya çıkar. Yeni referans-imaj temelli yeniden odaklanma yaklaşımımız, böyle bir odaklanmayı objektif bir süreç haline getiriyor. ACTrM’nin ilk adımında tanımlanan parametreler gerekli objektif kalite sınırlarını uygular. Diğer standardizasyon önlemleri AcTrM’nin gelecekteki sürümlerinde programlanabilir.

iTACS’in geniş uygulanabilirliği
Yapışan hücrelerin çok sayıda yönünü ölçmenin yanı sıra, iTACS yapısı çeşitli deneysel protokoller ve ihtiyaçlar için kullanımını kolaylaştırır. ACTrM, yazılım destekli kullanıcının kendi kendini eğitmesine izin verir. Örneğin, sitoplazmik kalsiyum dalgalanmalarının eşzamanlı olarak değerlendirilmesi gereken yüksek hızlı görüntüleme, şu anda donanımı yeniden konumlandırma ve yeniden odaklama hızı ile sınırlıdır ve en iyi şekilde aynı anda tek bir yerde yapılır. Bununla birlikte, mevcut uygulama, numunenin deney boyunca mikroskop aşamasında tutulamadığı uzun süreli görüntüleme, kesintiye uğramış görüntüleme için iyi bir donanıma sahiptir. Referans görüntüleri deneyin başında elde edildiğinden, iTACS mekanik sinyallerin gerçek zamanlı görüntülenmesini sağlar ve uyuşturucu tarama uygulamalarında yeni yollar açar. AnViM, kullanıcıların layman açısından son derece teknik bilgiler sağlamalarını sağlar. Geniş bir hücresel özellik spektrumunu ölçme ve deney boyunca izleme yeteneği, yeni hücreler arası iletişim mekanizmalarını keşfetmek için gereken kritik yetenekleri oluşturmaktadır.

iTACS’in gelecekteki gelişimi için dört odak alanı belirledik: (1) veri toplama ve veri analizi hızının geliştirilmesi, (2) yeni hücresel sinyalleri değerlendirmek için yaklaşımların uygulanması13, (3) iTACS tabanlı hücresel sinyal değerlendirmesi üzerinde atölyelerin ve eğitim modüllerinin geliştirilmesi, (4) düşük maliyetli otomasyon çözümlerinin geliştirilmesi.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

D.T.T., Güney Alabama Üniversitesi Akciğer Biyolojisi Merkezi’ne bağlı personele deneysel hücre biyolojisi araştırma ihtiyaçlarıyla ilgili tartışmaları teşvik eden için teşekkür eder. Bu tartışmalar iTACS’in geliştirilmesinin başlatılmasında çok önemliydi.

Bu çalışma kısmen Ulusal Sağlık Enstitüsü/Ulusal Kalp Akciğer Kanı Enstitüsü, P01 HL66299 ve R37 HL60024 (Stevens), R01-HL118334 (Alvarez), F32-HL144040-01 (Xu) ve Güney Alabama Üniversitesi’nden Abraham Mitchell Kanser Araştırma Fonu (Singh, Palanki, Tambe), Araştırma ve Akademik Gelişim Hibesi (Tambe), Honors College ve Yaz Lisans Araştırma Görevlisi (Nguyen).

Materials

Reagents and components used in prepare glass surface for hydrogel coating
(3-Aminopropyl)trimethoxysilane, 97% Aldrich chemistry 13822565
2% Bis Solution Bio-rad 1610142
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate,98% Acros organics 2530850
40% Acrylamide Solution Bio-rad 1610140
Glass bottom 35 mm dish/ 6 or 12 or 24 well plates MatTek or CellVis
Glutaraldehyde, EM Grade, 25% Polysciences 1909100
Sodium Hydroxide Sigma-aldrich 1002074706
Reagents and components used in preparing suitable hydrogel
2% Bis Solution Bio-rad 1610142
40% Acrylamide Solution Bio-rad 1610140
Ammonium Persulfate Bio-rad 1610700
Cover Slips Electron Microscopy Sciences 7222301
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (1M) Gibco 14190136
FluoSpheres carboxylate 0.2 um, yellow-green(505/515) Invitrogen F8811
FluoSpheres carboxylate 0.5 um, red(580/605) Invitrogen F8812
FluoSpheres carboxylate 2.0 um, red(580/605) Invitrogen F8826
Rain-X
TEMED Bio-rad 1610801
Reagents used in coating extracellular matrix on the hydrogel
Collagen Type I Rat Tail Corning 354236
HEPES(1M) Gibco 15630080
Phosphate Buffered Saline (1M) Gibco 10010023
Sulfo-SANPAH CovaChem 102568434
Microscope hardware used in the current study
Camera Hamamatsu Flash 4.0 LT sCMOS Camera C11440-42U
H117 ProScanTM Stages Prior Scientific
Light source- Lambda DG4 and Lambda DG5 Sutter instrument company
Microscope Nikon eclipse TE2000-S 550372
ProScan III Universal Microscope Automation Controller Prior Scientific
Stagetop incubator ibidi 11922
Stepper Motor Focus Drive Prior Scientific
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tambe, D. T., et al. Collective cell guidance by cooperative intercellular forces. Nature Materials. 10 (6), 469-475 (2011).
  2. Tambe, D. T., et al. Monolayer stress microscopy: limitations, artifacts, and accuracy of recovered intercellular stresses. PloS One. 8 (2), 55172 (2013).
  3. Das, T., et al. A molecular mechanotransduction pathway regulates collective migration of epithelial cells. Nature Cell Biology. 17 (3), 276-287 (2015).
  4. Vedula, S. R., et al. Mechanics of epithelial closure over non-adherent environments. Nature Communications. 6, 6111 (2015).
  5. Lamason, R. L., et al. Rickettsia Sca4 reduces vinculin-mediated intercellular tension to promote spread. Cell. 167 (3), 670-683 (2016).
  6. Sunyer, R., et al. Collective cell durotaxis emerges from long-range intercellular force transmission. Science. 353 (6304), 1157-1161 (2016).
  7. Dong, L., Oberai, A. A. Recovery of cellular traction in three-dimensional nonlinear hyperelastic matrices. Computer Methods in Applied Mechanics and Engineering. 314, 296-313 (2017).
  8. Nier, V., et al. Kalman inversion stress microscopy. Biophysical Journal. 115 (9), 1808-1816 (2018).
  9. Serrano, R., et al. Three-dimensional Monolayer Stress Microscopy. Biophysical Journal. 117 (1), 111-128 (2019).
  10. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of Image Analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  11. Schindelin, J., et al. Fiji – an Open Source platform for biological image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  12. Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. Computer control of microscopes using microManager. Current Protocols in Molecular Biology. , 20 (2010).
  13. Patel, N. G., et al. Unleashing shear: Role of intercellular traction and cellular moments in collective cell migration. Biochemical and Biophysical Research Communications. 522 (2), 279-285 (2020).
  14. Yeung, T., et al. Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion. Cell Motility and the Cytoskeleton. 60 (1), 24-34 (2005).
  15. Trepat, X., et al. Physical forces during collective cell migration. Nature Physics. 5, 426-430 (2009).
  16. Aratyn-Schaus, Y., Oakes, P. W., Stricker, J., Winter, S. P., Gardel, M. L. Preparation of complaint matrices for quantifying cellular contraction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (46), (2010).
  17. King, J., et al. Structural and functional characteristics of lung macro- and microvascular endothelial cell phenotypes. Microvascular Research. 67 (2), 139-151 (2004).
  18. Patel, G., et al. Mechanical signaling in a pulmonary microvascular endothelial cell monolayer. Biochemical and Biophysical Research Communications. 519 (2), 337-343 (2019).
  19. Kähler, C. J., et al. Main results of the 4th International PIV Challenge. Experiments in Fluids. 57 (6), 97 (2016).
  20. Tseng, Q., et al. Spatial organization of the extracellular matrix regulates cell-cell junction positioning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (5), 1506-1511 (2012).
  21. Alvarez-Gonzalez, B., et al. Two-layer elastographic 3-D traction force microscopy. Scientific Reports. 7, 39315 (2017).
  22. Makarchuk, S., Beyer, N., Gaiddon, C., Grange, W., Hebraud, P. Holographic traction force microscopy. Scientific Reports. 8 (1), 3038 (2018).
  23. Janmey, P. A., Miller, R. T. Mechanisms of mechanical signaling in development and disease. Journal of Cell Science. 124 (1), 9-18 (2011).
  24. Dembo, M., Oliver, T., Ishihara, A., Jacobson, K. Imaging the traction stresses exerted by locomoting cells with the elastic substratum method. Biophysical Journal. 70 (4), 2008-2022 (1996).
  25. Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).
  26. Butler, J. P., Tolic-Norrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology: Cell Physiology. 282 (3), 595-605 (2002).
  27. Saez, A., et al. Traction forces exerted by epithelial cell sheets. Journal of Physics. Condensed Matter. 22 (19), 194119 (2010).
  28. Deforet, M., et al. Automated velocity mapping of migrating cell populations (AVeMap). Nature Methods. 9 (11), 1081-1083 (2012).
  29. Polio, S. R., Smith, M. L. Patterned hydrogels for simplified measurement of cell traction forces. Methods in Cell Biology. 121, 17-31 (2014).
  30. Toyjanova, J., et al. 3D Viscoelastic traction force microscopy. Soft Matter. 10 (40), 8095-8106 (2014).
  31. Serra-Picamal, X., Conte, V., Sunyer, R., Munoz, J. J., Trepat, X. Mapping forces and kinematics during collective cell migration. Methods in Cell Biology. 125, 309-330 (2015).
  32. Charrier, E. E., et al. A novel method to make viscoelastic polyacrylamide gels for cell culture and traction force microscopy. APL Bioengineering. 4 (3), 036104 (2020).

Tags

Cellular SignalsForcesMotionMorphologyFluorescenceMonolayer Stress MicroscopyHydrogelFluorescent BeadsAcTrMAnViMCell MonolayerImage AcquisitionLive ViewPosition ListPhase ImagingFluorescence Imaging

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Nguyen, A., Battle, K., Paudel, S. S., Xu, N., Bell, J., Ayers, L., Chapman, C., Singh, A. P., Palanki, S., Rich, T., Alvarez, D. F., Stevens, T., Tambe, D. T. Integrative Toolkit to Analyze Cellular Signals: Forces, Motion, Morphology, and Fluorescence. J. Vis. Exp. (181), e63095, doi:10.3791/63095 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image