Boîte à outils intégrative pour analyser les signaux cellulaires: forces, mouvement, morphologie et fluorescence

REMARQUE: Les échantillons examinés à l’aide de la plate-forme iTACS sont des cellules collées à un substrat mou. Le protocole d’évaluation des signaux mécaniques et chimiques est divisé en deux parties séquentielles : module d’acquisition et de formation (AcTrM) et module d’analyse et de visualisation (AnViM). 1. Module d’acquisition et de formation (AcTrM) REMARQUE: AcTrM automatise le processus d’acquisition de données et d’auto-formation des utilisateurs. Avant toute acquisition de données, préparez un substrat souple capable de fournir les informations nécessaires pour quantifier les forces que les cellules exercent sur lui. Préparation d’hydrogelREMARQUE: L’objectif ici est de préparer un module de cisaillement de 1 250 Pa, d’environ 100 μm d’épaisseur et d’hydrogel de polyacrylamide (PAA) de 22 mm de diamètre. Préparer la solution de polyacrylamide en suivant la méthode de Yeung et al. et couler les hydrogels en suivant les étapes décrites par Trepat et al.14,15. Une exception à la procédure est que les perles incorporées immédiatement sous les cellules ont un diamètre de 0,5 μm et émettent une fluorescence jaune. Sautez l’étape consistant à fixer des billes de 2 μm à la vitre de couverture si la zone de visualisation doit avoir une grande région sans cellule.NOTE: Le protocole de préparation de l’hydrogel est maintenant assez établi sur le terrain16. Tout au long de la description suivante, les perles de 0,5 μm sont appelées « perles supérieures » et les perles de 2 μm sont appelées « perles inférieures ». Toutefois, les perles inférieures sont facultatives lorsque la région imagée contient une grande zone sans cellule. Le motif de perle supérieure d’une telle région sans cellule servira le motif de perle inférieure. Montez l’hydrogel avec des perles fluorescentes intégrées sur la scène du microscope. Prévoyez 15-20 min pour que la température de la plaque atteigne un état d’équilibre.REMARQUE: La surface supérieure de la plaque est fonctionnalisée avec des protéines de matrice extracellulaire, mais les cellules ne sont pas encore ensemencées sur l’hydrogel. Acquisition d’images de référence Partie 1 : Création d’une liste de postesREMARQUE: La saisie manuelle dans cette étape comprend le suivi des invites AcTrM pour choisir les emplacements avec la meilleure distribution de perles. Aucun fichier créé précédemment n’est utilisé dans cette étape. Les nouveaux dossiers clés produits dans cette étape incluent les dossiers ‘t0imgs’, ‘tnimgs’ et ‘textfiles’, et le fichier produit inclut le fichier de liste de positions. Reportez-vous à la Figure 2 pour la description visuelle des étapes suivantes qui guident la création d’une liste de positions à l’aide d’AcTrM. L’exemple démontré acquiert des données à un grossissement de 20x. Démarrez μManager 2.0 – Bêta. Exécutez AcTrM en cliquant sur le bouton AcTrM.bsh dans la fenêtre Ressources IMBL . Dans la fenêtre intitulée Définir les propriétés d’acquisition, sélectionnez l’objectif approprié, la tolérance pour la précision de la récupération de position latérale (c.-à-d. XY), la taille de l’étape de la mise au point approximative et raffinée (c.-à-d. z) et la valeur du coefficient de corrélation d’image acceptable pour la récupération de la mise au point.REMARQUE: Une tolérance plus fine pour la récupération de position latérale ralentira la récupération de position, mais une tolérance substantielle nécessitera une correction de position pendant l’analyse des données et peut entraîner des difficultés de récupération de la mise au point. Une taille de pas plus petite ralentira l’opération de recentrage, mais une taille de pas très élevée peut provoquer un mouvement rapide avec des occasions de manquer la mise au point. Dans la fenêtre AcTrM – Étape 0 , sélectionnez Nouvelle acquisition pour créer une liste de positions.REMARQUE: La fenêtre intitulée AcTrM – Étape 1 répertorie toutes les étapes suivantes clés. Ces étapes impliquent de déplacer la scène, d’ajuster la mise au point et de cliquer sur les boutons du μManager. Ces étapes guident la construction de la liste des postes adaptés à l’acquisition de données. Cliquez sur Live in Micromanager pour visualiser les échantillons pour les réglages manuels répertoriés dans la fenêtre AcTrM – Étape 1 . Suivez les étapes indiquées dans cette fenêtre. Maintenant, acquérez l’image des perles. Sélectionnez le canal approprié pour les perles supérieures. Assurez-vous également de regarder les perles inférieures. Pour ce faire, sélectionnez les canaux pour les perles inférieures. Une image floue de perles du bas est vue.REMARQUE: Les canaux peuvent être commutés à partir du menu déroulant prédéfini de la fenêtre principale de μManager. Si les perles inférieures sont utilisées dans l’expérience, assurez-vous qu’elles sont présentes dans la position sélectionnée. Ces perles apparaîtront floues. Après avoir sélectionné la position appropriée, cliquez sur Marquer dans la fenêtre Liste des positions de la scène pour enregistrer la position.REMARQUE : La meilleure position est définie par une distribution dense et uniforme des perles supérieures encastrées immédiatement sous la surface supérieure (c.-à-d. les perles supérieures) et d’au moins deux perles attachées au verre de couverture (c.-à-d. les perles inférieures) (figure supplémentaire S1). La récupération de la mise au point est plus rapide si les perles inférieures apparaissent comme de grandes bagues floues. Cependant, si les expériences sont effectuées dans une position sans besoin de mise au point ou de récupération de position latérale, ignorez les instructions relatives à l’image des perles inférieures. Suivez les étapes 6 à 9 décrites à la figure 2 pour inclure des positions supplémentaires dans la liste.REMARQUE: Choisissez quelques positions supplémentaires afin qu’un tour d’élimination puisse permettre les meilleures positions choisies sur la plaque. Partie 2 : Acquisition d’images de référenceREMARQUE: Cette étape n’implique aucune saisie manuelle. Les fichiers clés précédemment créés et utilisés dans cette étape incluent ‘textfiles/*.pos’. Les nouveaux fichiers et dossiers clés produits au cours de cette étape incluent ceux des dossiers ‘t0imgs’ et ‘tnimgs’. Reportez-vous à la Figure 3 et à la Figure S2 supplémentaire pour la description visuelle des étapes suivantes qui guident l’acquisition d’images de référence à l’aide d’AcTrM. La fenêtre AcTrM – Étape 2 répertorie également toutes les étapes clés. En suivant les étapes répertoriées dans la fenêtre AcTrM – Étape 2 , faites les choix dans la fenêtre Acquisition multidimensionnelle . Par exemple, pour effectuer un laps de temps long, indiquez un certain nombre d’images à prendre, sélectionnez le premier canal comme canal de phase, puis sélectionnez le suivant pour les perles supérieures et celui qui suit est pour les perles inférieures. Cliquez sur Fermer dans la fenêtre Acquisition multidimensionnelle , puis cliquez sur OK dans la fenêtre ActrM – Étape 2 . Dans la fenêtre AcTrM – Étape 3 , choisissez d’activer la récupération de position XYZ basée sur l’image de référence. Le choix est généralement oui. Cependant, si les images sont acquises à une position sans place pour la mise au point ou la dérive de la scène, le choix dans la fenêtre AcTrM – Étape 3 sera Non. Dans la fenêtre AcTrM – Options de récupération XYZ , définissez le canal pour la récupération XYZ approximative, si vous souhaitez effectuer une récupération XYZ affinée, une région et un canal pour une récupération XYZ affinée et la direction à suivre pour commencer le recentrage (Figure supplémentaire S4). Une fois terminé, AcTrM acrégera des images de référence.REMARQUE: Les choix typiques pour le canal seront le canal des perles inférieures. La récupération XYZ fonctionne mieux lorsqu’elle est effectuée avec l’image complète dans l’implémentation actuelle. Les images de référence comprennent généralement une image de lumière transmise de l’hydrogel, une image fluorescente des perles supérieures et une image fluorescente des perles inférieures. Le contenu de chaque ensemble d’images peut varier en fonction des choix effectués dans la fenêtre Acquisition multidimensionnelle . Néanmoins, le logiciel acquerra l’image de référence définie à chaque position déterminée à la figure 2. À la fin de cette étape, trois dossiers sont créés dans le répertoire choisi : ‘t0imgs’, ‘tnimgs’ et ‘textfiles’. Le dossier ‘t0imgs’ contient des images de référence dans le format reconnu par μManager et utilisé dans les étapes suivantes; Le dossier ‘tnimgs’ contient des images TIFF séparées avec des noms de fichiers ‘c0_p0_t0.tif’, ‘c1_p0_t0.tif’, etc. Ici, ‘c’ représente le canal, ‘p’ représente la position et ‘t’ représente l’heure. Ces lettres suivent respectivement le numéro de canal, le numéro de position et le numéro d’image. Le dossier ‘textfiles’ contient la liste des positions au format XML et les choix de l’utilisateur pour l’acquisition d’images et la récupération de position. Ensemencement et croissance des cellulesREMARQUE: La plate-forme iTACS a la flexibilité nécessaire pour s’adapter aux protocoles de préparation d’échantillons utilisés dans l’évaluation in vitro courante du comportement mécanique des cellules adhérentes, y compris les cellules clairsemées, les monocouches entièrement confluentes, le test de formation de réseau et les monocouches avec des trous ou des lacunes importantes. Cultiver des cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires de rat pour confluencer dans une fiole17,18. Détachez les cellules à l’aide de la trypsine. Remettre en suspension les cellules dans un milieu de culture contenant 10 % de sérum fœtal bovin à une concentration de 1 x 106 cellules/mL. Placez une gouttelette de 5 μL des cellules remises en suspension sur une surface d’hydrogel partiellement sèche et placez-la dans l’incubateur de culture cellulaire.REMARQUE: Après 2 jours dans le milieu de culture contenant 10% de sérum bovin fœtal, les cellules de cette gouttelette forment un îlot de cellules encombré1. Acquisition automatisée d’images pour l’expérience restanteREMARQUE: La saisie manuelle pour cette étape comprend le respect des invites AcTrM pour reprendre l’acquisition d’image. Les principaux fichiers précédemment créés utilisés par cette étape incluent ‘textfiles/*.pos’ et les fichiers image de perles inférieures dans le dossier ‘t0imgs’. Les nouveaux fichiers clés produits à cette étape incluent des fichiers de liste de positions mis à jour et des images ‘tnimgs/*_t*.tif’. Assurez-vous que le système de contrôle de l’environnement du microscope atteint des conditions de culture tissulaire stables. Montez doucement la plaque contenant les cellules cultivées sur la scène du microscope. Prévoir 15-20 min pour que la température et l’humidité se stabilisent.REMARQUE : Reportez-vous à la figure 4 pour la description visuelle des étapes suivantes qui guident l’acquisition d’images pour l’expérience restante à l’aide d’AcTrM. Démarrez μManager 2.0 – Bêta. Exécutez AcTrM en cliquant sur le bouton AcTrM.bsh dans la fenêtre Ressources IMBL .Remarque : Ignorez les choix effectués dans la fenêtre Définir les propriétés d’acquisition , mais utilisez les choix effectués à l’étape précédente. Dans la fenêtre AcTrM – Étape 0 , sélectionnez Continuer l’acquisition suspendue. Sélectionnez le grossissement et le répertoire identifiés dans la fenêtre Acquisition multidimensionnelle de l’étape précédente où les dossiers de données (‘t0imags’, ‘tnimgs’ et ‘textfiles’) ont été enregistrés.REMARQUE : Le titre de la fenêtre guide l’utilisateur pour choisir le répertoire approprié. Dans la fenêtre Repositionnement de la plaque , sélectionnez les choix de repositionnement de la plaque (trois positions non collinéaires) ainsi que le canal utilisé pour le repositionnement.REMARQUE: Les images enregistrées seront visibles dans l’appareil photo. Si les images qui se chevauchent s’affichent sous forme d’image en couleur rouge, verte et noire, effectuez un réglage manuel. Cliquez sur Accepter pour procéder à l’acquisition.REMARQUE: Cette étape surmonte les légers changements par rapport à l’irreproductibilité de l’alignement de la plaque lorsque la plaque est remontée sur la scène du microscope. Suivez les invites AcTrM pour accélérer l’alignement à chacune des trois positions en affichant une image composite de l’image de référence en rouge (généralement des perles inférieures) et de l’image actuellement observée à travers l’objectif affiché en vert. Obtenir le vert suffisamment proche du rouge laisse moins de travail pour le logiciel. Lorsque le chevauchement est parfait, l’image composite apparaît en jaune et noir. On est généralement suffisamment proche lorsque les mêmes perles inférieures sont visibles dans les images rouges et vertes, et que les bagues rouges et vertes correspondantes se touchent. Une fois le repositionnement de la plaque terminé, AcTrM amène la scène à chaque position sélectionnée et récupère la position XYZ en faisant correspondre l’image de référence avec ce qui est actuellement vu à travers la caméra. La première position latérale (XY) est mise en correspondance, puis la mise au point (Z) est mise en correspondance. La récupération brutale est suivie d’une récupération affinée de la position et de la concentration. Les mises à jour de l’état actuel de l’expérience sont affichées à l’écran par le biais d’une fenêtre en quatre parties illustrée à la figure supplémentaire S3. Les images acquises sont enregistrées dans le dossier ‘tnimgs’ suivant ‘*_t1.tif’, ‘*_t2.tif’, indiquant le nombre de temps pour l’ensemble d’images. Si la récupération XYZ identifie une position mise à jour, la nouvelle liste de positions est générée et enregistrée dans le dossier ‘textfiles’. 2. Module d’analyse et de visualisation (AnViM) Mise en place d’une analyse automatisée des donnéesREMARQUE: La saisie manuelle dans cette étape comprend l’identification de l’emplacement du dossier ‘tnimgs’. Les principaux fichiers précédemment créés utilisés dans cette étape incluent ‘tnimgs/*.tif’. Les nouveaux fichiers et dossiers clés produits à cette étape incluent le dossier ‘analysis’ dans le même dossier parent que ‘tnimgs’ et les dossiers pour chaque position ‘analysis/p*’. Dans chaque ‘analyse/p*’, cette étape crée un nouveau fichier image ‘*.tif’ dans les dossiers ‘phs’ et ‘tny’. Ces images sont des images recadrées et dérivées de cellules et de perles supérieures. Les autres fichiers créés incluent ‘analysis/analysisChoices.txt’ qui répertorie les choix d’analyse, ‘analysis/p*/skipAnalysis.txt’, qui répertorie les cas où l’analyse est ignorée en raison d’une dérive préexistante importante, et ‘analysis/p*/part_shift_values_pixel_degree.dat’ qui répertorie les valeurs de dérive estimées. AnViM ne modifie pas les données brutes dans le dossier ‘tnimgs’. Reportez-vous à la figure 5 pour la description visuelle des étapes suivantes qui guident la configuration de l’analyse automatisée des données à l’aide d’AnViM. Démarrez le logiciel Fidji et sélectionnez la première option dans le menu déroulant MSM intitulé MSM – prétraitement. À l’aide de la boîte de dialogue de l’explorateur de fichiers, sélectionnez le dossier contenant le dossier ‘tnimgs’, qui contient les données analysées. Définissez le canal des images. En suivant les directives de la figure supplémentaire S5, identifiez les numéros de canal de l’image de lumière transmise des cellules (image de contraste de phase des cellules), l’image des perles inférieures et l’image des perles supérieures. Les trois cases à cocher suivantes (« Déplacer les fichiers vers le dossier de position », « Effectuer une correction supplémentaire pour un mouvement rigide » et « Recadrer les données et enregistrer dans le dossier de position ») sont généralement cochées. Enfin, définissez la tolérance pour le rejet des données fortement dérivées, la taille des pixels et les côtés de l’image où les cellules se croisent. Répondez à l’invite pour améliorer la luminosité et le contraste des images de perles inférieures afin que les perles apparaissent bien en évidence. Ajustez ceci à l’aide de la barre de défilement dans le menu et cliquez sur OK. Maintenant, effectuez une correction de position pour vous débarrasser des quarts de travail, le cas échéant. Une fois cela fait, un dossier d’analyse est créé.REMARQUE: L’amélioration du contraste n’est généralement pas nécessaire, mais cette disposition est disponible pour les expériences où l’exposition aux lasers doit être minimisée. Après ce choix, AnViM copie les fichiers du dossier ‘tnimgs’ vers le dossier ‘analysis’. Les fichiers correspondant à chaque position sont enregistrés dans les dossiers ‘analysis/p0, analysis/p1’, etc. Dans chacun de ces dossiers de position, AnViM crée des dossiers ‘cels’, ‘defs’ et ‘refs’ contenant respectivement l’image lumineuse transmise d’origine, des images de perles supérieures et des images de perles inférieures (figure supplémentaire S6). AnViM analyse ensuite le mouvement rigide dans les images des perles inférieures et crée un dossier ‘phs’ contenant une image de lumière transmise corrigée des cellules et un dossier ‘tny’ contenant des images de perles supérieures mises à jour. Enfin, les choix de l’utilisateur concernant les canaux, les opérations, la tolérance, la taille des pixels et le franchissement des limites sont enregistrés dans le fichier ‘analysisChoices.txt’ (Figure supplémentaire S6). Quantification de la déformation de l’hydrogel et de la monocoucheREMARQUE: Il est important de noter que la quantification du mouvement à partir d’une séquence d’images est un domaine en évolution rapide19. La technologie est constamment optimisée pour les fonctionnalités, y compris la vitesse, la précision, les caractéristiques spécifiques dans les images brutes et les modèles de déformation spécifiques. Par conséquent, il est probable que certains utilisateurs utilisent une approche de quantification de la déformation différente de celle présentée ici. Partie 1 : Quantification de la déformation de l’hydrogelREMARQUE: Les entrées manuelles de cette étape incluent l’identification du répertoire de données et la sélection de la résolution de grille. Les principaux fichiers précédemment créés utilisés dans cette étape incluent ‘p*/tny/*.tif’. Les nouveaux fichiers clés produits dans ce domaine incluent ‘p*/displacement/*_disp.dat’ qui répertorie les vecteurs de déplacement de la surface supérieure de l’hydrogel. Voir la Figure 6 pour la description visuelle des étapes suivantes pour engager, via AnViM, l’analyse de vélocimétrie d’image de particules sur les images de perles supérieures20. Démarrez le logiciel Fidji et, dans le menu déroulant MSM , sélectionnez MSM – Gel Deformation. À partir de là, sélectionnez l’option qui convient à l’expérience. À l’aide de la boîte de dialogue de l’explorateur de fichiers, sélectionnez le répertoire parent du dossier ‘analysis’ contenant les données analysées. Dans la fenêtre Paramètres de calcul de la déformation du gel , sélectionnez la taille de la fenêtre de corrélation croisée, le niveau de bruit et le seuil appropriés (figure supplémentaire S7)20.REMARQUE: Les résultats sont enregistrés dans un répertoire « déplacement » nouvellement créé dans chaque dossier de position « analyse / p0, analyse / p1 », etc. C’est là que tous les fichiers de sortie sont stockés. Partie 2 : Quantification de la déformation monocoucheREMARQUE: Les entrées manuelles de cette étape incluent l’identification du répertoire de données et la sélection de la résolution de grille. Les principaux fichiers précédemment créés utilisés dans cette étape incluent ‘p*/tny/*.tif’. Les nouveaux fichiers clés produits dans ce domaine incluent ‘p*/velocity/*_vel.dat’ qui répertorie les vecteurs de mouvement des cellules. Voir la figure 7 pour la description visuelle des étapes à suivre pour engager, via AnViM, l’analyse de vélocimétrie d’image de particules sur les images de perles supérieures20. La procédure est similaire à celle suivie pour quantifier la déformation de l’hydrogel et sélectionne MSM – Cellular Motion dans le menu déroulant MSM . Les résultats sont enregistrés dans un répertoire ‘velocity’ nouvellement créé dans chaque dossier de position ‘analysis/p0’, ‘analysis/p1’, etc. Quantification de l’ECM et des forces cellule-celluleREMARQUE: La saisie manuelle dans cette étape comprend l’identification du répertoire de données, l’indication de la rigidité de l’hydrogel et la réponse aux invites de segmentation des clusters cellulaires pour détecter les cellules de la région sans cellule. Les principaux fichiers précédemment créés utilisés dans cette étape incluent ‘p*/displacement/*_disp.dat’. Les nouveaux fichiers clés produits à cette étape comprennent: « p * / traction / * _trac.dat », qui répertorie les forces exercées par les cellules sur l’hydrogel; « p*/traction/*_domain.dat », qui indique l’emplacement des points de la grille contenant des cellules; et les fichiers d’entrée ‘p*/traction.in, p*/clusterInput.txt’ et ‘p*/prestress.in’ qui enregistrent les choix de l’utilisateur pour cette étape. À la suite de la première évaluation quantitative de l’ECM cellulaire et des forces cellule-cellule, plusieurs variantes de la technique ont été développées1,15. Les variations se concentrent sur des cas particuliers de substrats, de cellules, de conditions expérimentales ou d’outils numériques7,8,21,22. Voir la figure 8 pour la description visuelle à engager via AnViM, la microscopie de traction à transformée de Fourier et l’analyse de microscopie de contrainte monocouche sur les données de déformation de l’hydrogel1,2,15. Démarrez le logiciel Fidji et, dans le menu déroulant MSM , sélectionnez MSM – Cell-ECM et Cell-Cell Forces (troisième option dans le menu déroulant). À l’aide de la boîte de dialogue du navigateur de fichiers, sélectionnez le répertoire parent du dossier ‘analysis’ contenant les dossiers ‘tnimgs’ et ‘analysis’ contenant les données analysées. Cliquez sur Sélectionner. Dans la fenêtre Paramètres de calcul des forces cellulaires , entrez le module de cisaillement, l’épaisseur de l’hydrogel et le niveau de bruit prévu. Sélectionnez OK. Cela lui permet d’exécuter la traction via la fonction MATLAB.REMARQUE: Après ces entrées, AnViM calcule les forces cell-ECM. Après cela, indiquez si la monocouche est confluente. Si l’image entière de la cellule est recouverte de cellules, la réponse est Oui. Dans ce cas, les forces cellule-cellule seront calculées sur l’ensemble du cadre. D’autre part, si une partie de l’image n’a pas de cellules, alors la réponse est Non. Dans ce cas, suivez les invites AnViM pour faciliter la segmentation de la région d’image qui contient des cellules. Si la réponse est non, dessinez manuellement un polygone autour de l’objet non-cellule lorsque le logiciel vous invite à le faire, puis sélectionnez une ou plusieurs méthodes appropriées pour la segmentation. Le logiciel demandera la couleur (noir ou blanc) des cellules. Cochez l’option Remplir automatiquement les taches dans le logiciel et cliquez sur OK.NOTE: Les étapes de segmentation d’une monocouche non confluente seront abordées dans la première partie de la section 2.4. Les forces Cell-ECM sont stockées dans des fichiers ‘*_trac.dat’ dans un répertoire ‘traction’ nouvellement créé dans chaque dossier de position, et l’entrée dans le logiciel de calcul de force cell-ECM est enregistrée dans le fichier ‘traction.in’ (Figure supplémentaire S8). Les forces cellule-cellule sont stockées dans des fichiers ‘*_prestress.dat’ dans un répertoire nouvellement créé ‘prestress’ dans chaque dossier de position, et l’entrée dans le logiciel de calcul de force cellule-cellule est enregistrée dans le fichier ‘prestress.in’ (Figure supplémentaire S9). Mappage des valeurs des points de grille sur des cellules individuellesREMARQUE: L’un des objectifs actuels d’iTACS est d’introduire une approche simple pour interpréter les signaux mécaniques mesurés sur le terrain. Cette approche est bénéfique pour examiner les interactions mécaniques entre les cellules voisines d’un cluster18. Dans l’ensemble, les propriétés quantifiées jusqu’à présent se trouvent sur des points de grille régulièrement espacés à travers le cluster cellulaire. Ces données identifient la médiane, la moyenne et l’écart-type des propriétés sélectionnées à l’intérieur des limites morphologiques des cellules individuelles et les attribuent en tant que propriétés/signaux physiques cellulaires. À partir de ceux-ci, l’écart-type est utilisé pour indiquer la variabilité, la différence entre la moyenne et la médiane est utilisée pour indiquer la nature de la distribution, et la valeur médiane est utilisée pour indiquer l’état global des cellules pour les propriétés sélectionnées.Partie 1 : Segmentation de la région d’image qui contient des cellulesREMARQUE : la saisie manuelle de cette étape comprend l’identification du répertoire de données et la réponse aux invites de segmentation pour détecter les cellules de la région sans cellule. Les principaux fichiers précédemment créés utilisés dans cette étape incluent ‘p*/phs/*.tif’. Les nouveaux fichiers clés produits à cette étape incluent ‘p*/phs/bwImages/*.tif’ qui sont des images binaires séparant les régions cellulaires des régions sans cellule, ‘p*/phs/textResults/frameNum_percentHealed.txt’, qui répertorie le pourcentage de zone d’image couverte par les cellules dans chaque instance, et ‘p*/clusterInput.txt’, qui enregistre les choix utilisateur saisis dans l’interface AcTrM. Reportez-vous à la Figure 9 pour obtenir la description visuelle des étapes suivantes pour segmenter la région de l’image qui contient des cellules. Cette partie doit être complétée avant de calculer les forces cellule-cellule. Dans ce cas, ces étapes n’ont pas besoin d’être répétées. De plus, si ces étapes sont effectuées avant les calculs de force cellule-cellule, elles ne sont pas demandées au début des calculs de force. Démarrez le logiciel Fidji et, dans le menu déroulant MSM , sélectionnez Segmentation – Cluster cellulaire. À l’aide de la boîte de dialogue de l’explorateur de fichiers, sélectionnez le répertoire de position ‘analysis/p0’, ‘analysis/p1’, etc., qui contient des propriétés quantifiées sur des points de grille régulièrement espacés. Indiquez si la monocouche est confluente.REMARQUE: Les étapes ci-dessous ne sont appelées que lorsque la monocouche n’est pas confluente. Suivez les invites AnViM pour appliquer la nouvelle approche à plusieurs volets afin d’identifier les régions d’image qui contiennent des cellules. Le processus implique quatre méthodes – chacune abordant la segmentation d’une manière différente. Une ou plusieurs de ces méthodes utilisées en combinaison couvrent une grande variété d’images des cellules. Par conséquent, essayez différentes approches pour trouver la combinaison qui fonctionne le mieux pour leurs données. Ajustez le ‘Facteur de connexion au domaine’ et le ‘Facteur de frottis’ pour obtenir une segmentation optimale.REMARQUE: Le « facteur de frottis » rend les régions qui contiennent des cellules plus grandes. Indiquez si les cellules apparaissent en noir ou blanc dans l’image binaire. Dans la fenêtre Instructions pour nettoyer l’image de frontière , choisissez de nettoyer l’image automatiquement ou manuellement.REMARQUE: Les caractéristiques indésirables des images sont des taches noires sur les pixels occupés par les cellules et des taches blanches sur les pixels déconnectés du groupe de cellules à analyser. L’analyse ne peut être effectuée que sur les régions connectées. Ainsi, plusieurs régions déconnectées doivent être analysées séparément. Partie 2: Segmentation des cellules individuelles dans les imagesREMARQUE: Les entrées manuelles de cette étape incluent l’identification du répertoire de données et la réponse aux invites de segmentation pour détecter les cellules individuelles dans l’image. Les principaux fichiers précédemment créés utilisés dans cette étape incluent ‘p*/phs/*.tif’ et ‘p*/phs/bwImages/*.tif’. Les nouveaux fichiers clés produits incluent ‘p*/phs/textResults/*.csv’, qui contiennent des propriétés morphologiques cellulaires. Reportez-vous à la Figure 10 pour la description visuelle des étapes suivantes pour segmenter les cellules individuelles de la monocouche. Démarrez le logiciel Fidji et, dans le menu déroulant MSM , sélectionnez Segmentation – Cellules individuelles. À l’aide de la boîte de dialogue de l’explorateur de fichiers, sélectionnez le répertoire de position ‘analysis/p0’, ‘analysis/p1’, etc., qui contient des propriétés quantifiées sur des points de grille régulièrement espacés. Dans la fenêtre Choisir les paramètres d’entrée , indiquez le rapport d’aspect maximal, la proéminence de la position du centre de la cellule par rapport à la limite de la cellule et deux paramètres de flou pour guider la détection des cellules (figure supplémentaire S10). Sur la pile d’images pour chaque position, dessinez un polygone sur la plus petite cellule normale. Ceci est utilisé pour calculer la zone. Tout ce qui est plus petit que cela ne sera pas considéré comme une cellule par le logiciel. Ensuite, dessinez un polygone autour de la plus grande cellule normale et indiquez si le centre cellulaire ou l’interface cellule-cellule est plus lumineux.REMARQUE: AnViM crée ensuite des fichiers ‘phs/textResults/0001.csv’, ‘phs/textResults/0002.csv’, etc., pour chaque cadre contenant des informations sur les cellules de ce cadre. À ce stade, ce fichier comprend des informations morphologiques sur les cellules, y compris la surface, le centroïde, le périmètre, l’orientation, la circularité, le rapport d’aspect, l’arrondi, la solidité, la distance par rapport à la région sans cellule. L’unité de longueur dans ces propriétés est en pixels et l’angle est en degrés. Enfin, ce fichier est mis à jour pour contenir l’intensité, le mouvement et les forces des pixels cellulaires dans les étapes suivantes. Partie 3 : Cartographie des intensités de pixels sur les cellulesREMARQUE : Les entrées manuelles de cette étape incluent l’identification du répertoire de données et la sélection des propriétés et paramètres de mappage. Les principaux fichiers précédemment créés utilisés à cette étape incluent ‘p*/phs/*.tif’ (ou ‘p*/fluo/*.tif ‘) et ‘p*/phs/bwImages/*.tif’. Les nouveaux fichiers clés produits dans cette étape incluent ‘p*/phs/textResults/*.csv’, qui répertorie les propriétés morphologiques cellulaires. Reportez-vous à la figure 11 pour la description visuelle des étapes suivantes afin d’évaluer les intensités de pixels dans la région englobée par les cellules individuelles et leur région voisine et de les définir comme propriétés des cellules. Démarrez le logiciel Fidji et, dans le menu déroulant MSM , sélectionnez Carte sur les cellules – Intensités. À l’aide de la boîte de dialogue de l’explorateur de fichiers, sélectionnez le répertoire de position ‘analysis/p0’, ‘analysis/p1’, etc., qui contient des propriétés quantifiées sur des points de grille régulièrement espacés. Sélectionnez Détecter la division cellulaire ou Quantifier la fluorescence cellulaire lorsque le logiciel vous y invite. Définissez la taille de la région voisine. Cochez les cases Collecter les propriétés de la région voisine et Collecter les propriétés des cellules. Cliquez sur OK. Dans la fenêtre But de l’enregistrement de l’intensité cellulaire, indiquez le type d’image à utiliser pour la cartographie de l’intensité, la taille de la région voisine et si des données sont collectées pour des cellules individuelles ou les deux cellules et leurs régions voisines (figure supplémentaire S11).REMARQUE: Le mappage des intensités de pixels d’une image à contraste de phase permet de détecter les événements de division cellulaire. La cartographie des intensités d’images fluorescentes permettra de détecter les fluctuations des molécules cytoplasmiques marquées par fluorescence. La sortie des étapes ci-dessus est la moyenne, la médiane, l’écart-type, le minimum et le maximum d’intensité en pixels pour les cellules individuelles. Ces numéros sont saisis sous forme de nouvelles colonnes dans les fichiers ‘phs/textResults/0001.csv’, ‘phs/textResults/0002.csv’, etc. Partie 4: Cartographie des forces et du mouvement sur les cellulesREMARQUE : Les entrées manuelles de cette étape incluent l’identification du répertoire de données et la sélection des propriétés et paramètres de mappage. Les principaux fichiers précédemment créés utilisés dans cette étape incluent ‘p*/phs/textResults/*.csv’, ‘p*/velocity/*_vel.dat’, ‘p*/displacement/*_disp.dat’, ‘p*/traction/*_trac.dat’, ‘p*/prestress/*_prestress.dat’ et ‘p*/phs/bwImages/*.tif ‘. Aucun nouveau fichier n’est créé au cours de cette étape. Au lieu de cela, les nouvelles informations (propriétés de force cellulaire et de mouvement) sont ajoutées aux fichiers ‘p*/phs/textResults/*.csv ‘. Voir la figure 12 pour la description visuelle des étapes afin d’évaluer les forces et les mouvements dans la région englobée par les cellules individuelles et leur région voisine et de les définir comme propriétés des cellules. Choisissez dans le menu déroulant MSM Map on Cells – Motion/Force Data (Figure supplémentaire S12). Ensuite, suivez les étapes répertoriées à l’étape 2.4.3.REMARQUE: De nouvelles colonnes sont ajoutées aux fichiers ‘phs/textResults/0001.csv’, ‘phs/textResults/0002.csv’, etc. et incluent la moyenne, la médiane et l’écart-type de vitesse, l’orientation de la vitesse, la tension cytosquelettique moyenne, l’anisotropie de tension, l’énergie de déformation dans l’hydrogel, l’orientation de la tension la plus élevée et l’amplitude de la traction cellule-ECM (figure supplémentaire S13). Visualisation des résultats Partie 1: Suivi des identités cellulaires à travers l’expérienceREMARQUE : Les entrées manuelles de cette étape incluent l’identification du répertoire de données et la sélection des propriétés mappées à visualiser. Les principaux fichiers précédemment créés utilisés dans cette étape incluent ‘p*/phs/textResults/*.csv’. Les nouveaux fichiers clés produits au cours de cette étape incluent ‘p*/phs/textResults/cellTimeTrace_*.csv’, qui contient une trace temporelle des données cellulaires. Reportez-vous à la figure 13 pour la description visuelle des étapes suivantes afin de suivre les propriétés des cellules individuelles pendant toute la durée de l’expérience. Démarrez le logiciel Fidji et, dans le menu déroulant MSM , sélectionnez Résultats – Données de suivi. À l’aide de la boîte de dialogue du navigateur de fichiers, sélectionnez le répertoire de position ‘analysis/p0’, ‘analysis/p1’, etc., contenant les propriétés cellulaires à suivre. Lorsque vous avez terminé, cliquez sur Sélectionner. Dans la fenêtre Choisir le point de départ pour le suivi , choisissez l’image de départ pour la surveillance et le nombre d’images suivies simultanément (figure supplémentaire S14). Commencez toujours à partir de l’image numéro 2 car la vitesse ne peut pas être déterminée pour l’image numéro 1. Lorsque vous avez terminé, cliquez sur OK. Dans la fenêtre Vérifier les variables pour effectuer des pistes , choisissez les variables en tapant les noms des variables ou en cochant les termes dans les cases à cocher (Figure supplémentaire S15). Ensuite, cliquez sur OK.REMARQUE : Le suivi génère des fichiers ‘phs/textResults/cellTimeTrace_*.csv’ avec chaque colonne contenant un numéro de cellule unique et chaque ligne successive représentant l’instance temporelle consécutive. Partie 2 : Génération de traces temporelles des propriétés cellulaires évaluéesREMARQUE : Les entrées manuelles de cette étape incluent l’identification du répertoire de données et la sélection des propriétés mappées à visualiser. Les principaux fichiers précédemment créés utilisés dans cette étape incluent ‘p*/phs/textResults/cellTimeTrace_*.csv’. Les nouveaux fichiers clés produits au cours de cette étape incluent ‘p*/phs/trackedDataPlots/*.tif’, qui contiennent des tracés de suivi temporel et ‘p*/phs/trackedDataPlots/*.csv’, qui contiennent des données de tracé. Voir la figure 14 pour la description visuelle des étapes suivantes afin de générer des traces temporelles des propriétés cellulaires évaluées. Démarrez le logiciel Fidji et, dans le menu déroulant MSM , sélectionnez Résultats – tracé. À l’aide de la boîte de dialogue du navigateur de fichiers, sélectionnez le répertoire de position ‘analysis/p0’, ‘analysis/p1’, etc., contenant les propriétés cellulaires suivies à tracer. Choisissez de limiter le tracé aux cellules avec des pistes ininterrompues en cliquant sur le bouton Oui ou Non .Remarque : Cette option ignore les cellules, qui n’ont pas pu être détectées dans une ou plusieurs instances de temps. Choisissez le nombre de variables à tracer simultanément et cliquez sur OK.REMARQUE: Actuellement, AnViM permet d’afficher un maximum de trois variables dans le même tracé. Choisissez des variables individuelles à tracer à l’aide d’un menu déroulant.REMARQUE : ces étapes créent un fichier TIFF (tagged image file format) et un fichier de données séparé par des virgules dans le dossier ‘phs/trackedDataPlots/’. Le nom de fichier est composé de noms de variables séparés par un trait de soulignement et se termine par un numéro de cellule. Partie 3 : Génération de cartes thermiques des propriétés cellulaires évaluéesREMARQUE : Les entrées manuelles de cette étape incluent l’identification du répertoire de données et la sélection des propriétés mappées à visualiser. Les principaux fichiers précédemment créés utilisés dans cette étape incluent ‘p*/phs/textResults/cellTimeTrace_*.csv’. Les nouveaux fichiers clés générés à cette étape incluent ‘p*/phs/segmentedImages/cellPropMaps/*.tif’, qui sont les cartes thermiques des propriétés cellulaires. Voir la figure 15 pour la description visuelle des étapes permettant de générer des cartes thermiques des propriétés cellulaires évaluées. Choisissez dans le menu déroulant MSM Résultats – Image. Suivez les étapes décrites à l’étape 2.5.2.REMARQUE: La sortie est stockée sous forme de fichiers TIFF dans le dossier ‘phs/segmentedImages/cellPropMaps/’. Les noms de fichiers sont le numéro d’instance de temps et le nom de la variable séparés par un trait de soulignement.