Kit de ferramentas integrativas para analisar sinais celulares: forças, movimento, morfologia e fluorescência

NOTA: As amostras examinadas usando a plataforma iTACS são células aderidas a um substrato macio. O protocolo de avaliação de sinais mecânicos e químicos é dividido em duas partes sequenciais: Módulo de Aquisição e Treinamento (AcTrM) e Módulo de Análise e Visualização (AnViM). 1. Módulo de Aquisição e Treinamento (AcTrM) NOTA: A AcTrM automatiza o processo de aquisição de dados e auto-treinamento do usuário. Antes de qualquer aquisição de dados, prepare um substrato macio capaz de fornecer informações necessárias para quantificar forças que as células exercem sobre ele. Preparação de hidrogelNOTA: O objetivo aqui é preparar um módulo de cisalhamento de 1.250 Pa, aproximadamente 100 μm de espessura, e um hidrogel de poliacrilamida de 22 mm de diâmetro (PAA). Prepare a solução de poliacrilamida seguindo o método de Yeung et al. e lance os hidrogéis seguindo as etapas descritas por Trepat et al.14,15. Uma exceção ao procedimento é que as contas incorporadas imediatamente sob as células têm 0,5 μm de diâmetro e emitem fluorescência amarela. Pule o passo de anexar contas de 2 μm ao vidro de cobertura se a área de visualização tiver uma região grande e livre de células.NOTA: O protocolo de preparação de hidrogel está agora bastante estabelecido no campo16. Ao longo da descrição subsequente, as contas de 0,5 μm são referidas como “contas superiores”, e as contas de 2 μm são referidas como “contas inferiores”. No entanto, as contas inferiores são opcionais onde a região de imagem contém uma grande área livre de células. O padrão de contas superior de uma região livre de células servirá ao propósito do padrão de contas inferior. Monte o hidrogel com contas fluorescentes incorporadas no estágio do microscópio. Deixe 15-20 min para que a temperatura da placa atinja um estado estável.NOTA: A superfície superior da placa é funcionalizada com proteínas de matriz extracelular, mas as células ainda não estão semeadas no hidrogel. Aquisição de imagem de referência Parte 1: Criando uma lista de posiçõesNOTA: A entrada manual nesta etapa inclui seguir as instruções acTrM para escolher locais com a melhor distribuição de contas. Nenhum arquivo criado anteriormente é usado nesta etapa. As principais novas pastas produzidas nesta etapa incluem pastas ‘t0imgs’, ‘tnimgs’ e ‘textfiles’, e o arquivo produzido inclui o arquivo de lista de posição. Consulte a Figura 2 para obter a descrição visual das seguintes etapas que orientam a criação de uma lista de posições usando AcTrM. O exemplo demonstrado adquire dados em ampliação de 20x. Iniciar μManager 2.0 – Beta. Execute o AcTrM clicando no botão AcTrM.bsh na janela Recursos IMBL . Na janela intitulada Define Propriedades de Aquisição, selecione o objetivo adequado, tolerância para a precisão da recuperação da posição lateral (ou seja, XY), tamanho da etapa da operação de refoco áspero e refinado (ou seja, z) e valor do coeficiente de correlação de imagem aceitável para recuperação do foco.NOTA: Uma tolerância mais fina para a recuperação da posição lateral retardará a recuperação da posição, mas uma tolerância substancial precisará de correção de posição durante a análise dos dados e poderá causar dificuldade na recuperação do foco. Um tamanho de passo menor diminuirá a operação de refoco, mas um tamanho de passo muito alto pode causar movimento rápido com oportunidades de perder o foco. Na janela AcTrM – Passo 0 , selecione Nova Aquisição para criar uma lista de posições.NOTA: A janela intitulada AcTrM – Passo 1 lista todos os principais próximos passos. Essas etapas envolvem mover o palco, ajustar o foco e clicar em botões no μManager. Essas etapas orientam na construção da lista de posições adequadas para aquisição de dados. Clique em Live in Micromanager para visualizar as amostras para ajustes manuais listados na janela AcTrM – Passo 1 . Siga os passos listados nesta janela. Agora adquira a imagem das contas. Selecione o canal apropriado para as contas superiores. Certifique-se de olhar para as contas inferiores também. Para isso, selecione os canais para as contas inferiores. Uma imagem embaçada de contas inferiores é vista.NOTA: Os canais podem ser alternados a partir do menu suspenso predefinido na janela principal do μManager. Se as contas inferiores forem usadas no experimento, certifique-se de que elas estejam presentes na posição selecionada. Essas contas vão parecer embaçadas. Ao selecionar a posição apropriada, clique em Marcar na janela Lista de posição do estágio para salvar a posição.NOTA: A melhor posição é definida por uma distribuição densa e uniforme das contas superiores embutidas imediatamente sob a superfície superior (ou seja, contas superiores) e pelo menos duas contas presas ao vidro de cobertura (ou seja, contas inferiores) (Figura Suplementar S1). A recuperação do foco é mais rápida se as contas inferiores aparecerem como anéis grandes e fora de foco. No entanto, se os experimentos forem feitos em uma posição sem necessidade de foco ou recuperação de posição lateral, ignore as instruções relacionadas à imagem das contas inferiores. Siga os passos 6-9 descritos na Figura 2 para incluir posições adicionais na lista.NOTA: Escolha algumas posições adicionais para que uma rodada de eliminação possa permitir as melhores posições escolhidas na placa. Parte 2: Aquisição de imagens de referênciaNOTA: Esta etapa não envolve nenhuma entrada manual. Arquivos-chave criados anteriormente usados nesta etapa incluem ‘textfiles/*.pos’. Os principais arquivos e pastas produzidos nesta etapa incluem aqueles dentro das pastas ‘t0imgs’ e ‘tnimgs’. Consulte Figura 3 e Figura Suplementar S2 para obter a descrição visual das seguintes etapas que orientam a aquisição de imagens de referência usando AcTrM. A janela AcTrM – Passo 2 também lista todos os passos principais. Seguindo as etapas listadas na janela AcTrM – Passo 2 , faça as escolhas na janela Aquisição Multidimensional . Por exemplo, para executar um lapso de longo tempo, indique uma série de imagens a serem tiradas, selecione o primeiro canal como canal de fase e, em seguida, selecione o próximo para as contas superiores e a seguinte é para contas inferiores. Clique em Fechar na janela Aquisição Multidimensional e, em seguida, clique em OK na janela ActrM – Passo 2 . Na janela AcTrM – Passo 3 , escolha engajar a recuperação de posição XYZ baseada em imagem de referência. A escolha é geralmente sim. No entanto, se as imagens forem adquiridas em uma posição sem espaço para foco ou deriva de palco, a escolha na janela AcTrM – Passo 3 será No. Na janela Opções de Recuperação AcTrM – XYZ , defina o canal para recuperação áspera do XYZ, quer realize a recuperação, região e canal de XYZ refinados e a direção para começar a refocar (Figura Suplementar S4). Quando concluída, a AcTrM adquirirá imagens de referência.NOTA: As opções típicas para o canal serão o canal de contas inferiores. A recuperação do XYZ funciona melhor quando realizada com a imagem completa na implementação atual. As imagens de referência normalmente incluem uma imagem de luz transmitida do hidrogel, uma imagem fluorescente de contas superiores e uma imagem fluorescente das contas inferiores. O conteúdo de cada conjunto de imagens pode variar de acordo com as escolhas feitas na janela Aquisição Multidimensional . Ainda assim, o software adquirirá o conjunto de imagens de referência em cada posição determinada na Figura 2. Ao final desta etapa, três pastas são criadas no diretório escolhido: ‘t0imgs’, ‘tnimgs’ e ‘textfiles’. A pasta ‘t0imgs’ contém imagens de referência no formato reconhecido pelo μManager e usado em etapas subsequentes; A pasta ‘tnimgs’ contém imagens TIFF separadas com nomes de arquivos ‘c0_p0_t0.tif’, ‘c1_p0_t0.tif’, etc. Aqui, ‘c’ significa o canal, ‘p’ significa a posição, e ‘t’ significa para o tempo. Seguindo essas letras estão o número do canal, número de posição e número do quadro, respectivamente. Os ‘arquivos de texto’ da pasta contêm a lista de posições no formato XML e as escolhas do usuário para aquisição de imagens e recuperação de posições. Semeadura celular e crescimentoNOTA: A plataforma iTACS tem a flexibilidade de acomodar protocolos de preparação de amostras usados em avaliação in vitro comum do comportamento mecânico de células aderentes, incluindo células esparsas, monocamada totalmente confluente, ensaio de formação de rede e monocamadas com buracos ou lacunas significativas. Cultura rato células microvasculares microvasculares para confluência em um frasco17,18. Desprende as células usando trippsina. Resuspend as células em um meio de cultura contendo 10% de soro bovino fetal a uma concentração de 1 x 106 células/mL. Coloque uma gota de 5 μL das células resuspended em uma superfície de hidrogel parcialmente seca e coloque-a na incubadora de cultura celular.NOTA: Após 2 dias no meio cultural contendo 10% de soro bovino fetal, as células dessa gotícula formam uma ilha lotada de células1. Aquisição automatizada de imagens para o experimento restanteNOTA: A entrada manual para esta etapa inclui seguir as instruções acTrM para retomar a aquisição da imagem. Os principais arquivos criados anteriormente usados por esta etapa incluem ‘textfiles/*.pos’ e arquivos de imagem de contas inferiores na pasta ‘t0imgs’. Os principais novos arquivos produzidos nesta etapa incluem arquivos de lista de posição atualizadas e imagens ‘tnimgs/*_t*.tif’. Certifique-se de que o sistema de controle ambiental do microscópio atinja condições estáveis de cultura tecidual. Monte suavemente a placa contendo células cultivadas no estágio do microscópio. Deixe 15-20 min para que a temperatura e a umidade se estabilizem.NOTA: Consulte a Figura 4 para obter a descrição visual das seguintes etapas que orientam a aquisição de imagens para o experimento restante usando AcTrM. Iniciar μManager 2.0 – Beta. Execute o AcTrM clicando no botão AcTrM.bsh na janela Recursos IMBL .NOTA: Ignore as escolhas feitas na janela Definir Propriedades de Aquisição , mas use as escolhas feitas na etapa anterior. Na janela AcTrM – Passo 0 , selecione Continuar a aquisição pausada. Selecione a ampliação e o diretório identificados na janela Aquisição Multidimensional na etapa anterior, onde as pastas de dados (‘t0imags’, ‘tnimgs’ e ‘textfiles’) foram salvas.NOTA: O título da janela orienta o usuário a escolher o diretório apropriado. Na janela Reposicionamento da placa , selecione opções para reposicionar a placa (três posições não-lineares) juntamente com o canal usado para reposicionamento.NOTA: Imagens salvas serão vistas na câmera. Se as imagens sobrepostas forem exibidas como uma imagem de cor vermelha, verde e preta, realize o ajuste manual. Clique em Aceitar para prosseguir com a aquisição.NOTA: Este passo supera as ligeiras mudanças da irreprodutibilidade do alinhamento da placa quando a placa é remontada no estágio do microscópio. Siga o AcTrM solicita agilizar o alinhamento em cada uma das três posições, mostrando uma imagem composta da imagem de referência mostrada em vermelho (tipicamente das contas inferiores) e a imagem atualmente observada através do objetivo mostrado em verde. Obter o verde suficientemente perto do vermelho deixa menos trabalho para o software. Quando a sobreposição é perfeita, a imagem composta aparece amarela e preta. Suficientemente perto é normalmente quando as mesmas contas inferiores são visíveis em imagens vermelhas e verdes, e os anéis vermelho e verde correspondentes estão se tocando. Após o reposicionamento da placa estar concluído, o AcTrM sobe ao palco para cada posição selecionada e recupera a posição XYZ combinando a imagem de referência com o que é visto atualmente através da câmera. A primeira posição lateral (XY) é combinada, e então o foco (Z) é combinado. A recuperação áspera é seguida pela recuperação refinada da posição e do foco. As atualizações do status atual do experimento são exibidas na tela através de uma janela de quatro partes mostrada na Figura Suplementar S3. As imagens adquiridas são salvas na pasta ‘tnimgs’ após ‘*_t1.tif’, ‘*_t2.tif’, indicando a contagem de tempo para o conjunto de imagens. Se a recuperação do XYZ identificar uma posição atualizada, a nova lista de posições será gerada e salva na pasta ‘textfiles’. 2. Módulo de Análise e Visualização (AnViM) Configuração automatizada da análise de dadosNOTA: A entrada manual nesta etapa inclui identificar a localização da pasta ‘tnimgs’. Os principais arquivos criados anteriormente usados nesta etapa incluem ‘tnimgs/*.tif’. Os principais arquivos e pastas produzidos nesta etapa incluem a pasta ‘análise’ na mesma pasta pai como ‘tnimgs’ e pastas para cada posição ‘análise/p*’. Dentro de cada ‘análise/p*’, esta etapa cria um novo arquivo de imagem ‘*.tif’ nas pastas ‘phs’ e ‘tny’. Essas imagens são cropped e des drifted imagens de células e contas superiores. Os outros arquivos criados incluem ‘análise/análiseChoices.txt’ que lista escolhas de análise, ‘análise/p*/skipAnalysis.txt’, que lista casos em que a análise é ignorada devido à deriva pré-existente significativa, e ‘análise/p*/part_shift_values_pixel_degree.dat’ que lista valores de deriva estimados. A AnViM não altera os dados brutos na pasta ‘tnimgs’. Consulte a Figura 5 para obter a descrição visual das seguintes etapas que orientam a configuração da análise automatizada de dados usando o AnViM. Inicie o software Fiji e selecione a primeira opção no menu suspenso msm rotulado como MSM – pré-processamento. Usando a caixa de diálogo do navegador de arquivos, selecione a pasta contendo a pasta ‘tnimgs’, que contém os dados analisados. Defina o canal para as imagens. Seguindo as diretrizes da Figura Suplementar S5, identifique os números de canais da imagem de luz transmitida das células (imagem de contraste de fase das células), imagem de contas inferiores e imagem superior das contas. As seguintes três caixas de seleção (‘Mover arquivos para a pasta de posição’, ‘Fazer correção adicional para movimento rígido’ e ‘Cortar dados e salvar na pasta de posição’) são normalmente verificadas. Por fim, defina tolerância para rejeitar dados fortemente derivados, tamanho do pixel e lados da imagem onde as células se cruzam. Responda ao prompt para melhorar o brilho e o contraste das imagens de contas inferiores para que as contas apareçam com destaque. Ajuste isso usando a barra de controle deslizante no menu e clique em OK. Agora execute a correção de posição para se livrar dos turnos, se houver. Uma vez feita, uma pasta de análise é criada.NOTA: O aprimoramento do contraste normalmente não é necessário, mas esta disposição está disponível para experimentos onde a exposição a lasers precisa ser minimizada. Após essa escolha, o AnViM copia os arquivos da pasta ‘tnimgs’ para a pasta ‘análise’. Os arquivos correspondentes a cada posição são salvos nas pastas ‘análise/p0, análise/p1’, etc. Dentro de cada uma dessas pastas de posição, a AnViM faz pastas ‘cels’, ‘defs’ e ‘refs’ contendo a imagem de luz transmitida original, imagens de contas superiores e imagens de contas inferiores, respectivamente (Figura Suplementar S6). O AnViM então analisa o movimento rígido nas imagens das contas inferiores e cria uma pasta ‘phs’ contendo uma imagem de luz transmitida corrigida das células e uma pasta ‘tny’ contendo imagens de contas superiores atualizadas. Finalmente, as escolhas dos usuários dos canais, operações, tolerância, tamanho do pixel e cruzamento de limites são salvas no arquivo ‘analysisChoices.txt’ (Figura Suplementar S6). Quantificação da deformação de hidrogel e monocamadasNOTA: É importante notar que a quantificação do movimento a partir de uma sequência de imagens é um campo em rápida evolução19. A tecnologia é constantemente otimizada para recursos, incluindo velocidade, precisão, características específicas dentro das imagens brutas e padrões específicos de deformação. Portanto, é provável que alguns usuários possam usar uma abordagem de quantificação de deformação diferente da apresentada aqui. Parte 1: Quantificação da deformação do hidrogelNOTA: As entradas manuais nesta etapa incluem a identificação do diretório de dados e a seleção da resolução da grade. Os principais arquivos criados anteriormente usados nesta etapa incluem ‘p*/tny/*.tif’. Os principais novos arquivos produzidos neste incluem ‘p*/displacement/*_disp.dat’ que lista vetores de deslocamento da superfície superior do hidrogel. Consulte a Figura 6 para obter a descrição visual das seguintes etapas para engajar, via AnViM, a análise de Velocimetria de Imagem de Partículas nas imagens superiores das contas20. Inicie o software Fiji e, a partir do menu suspenso do MSM , selecione MSM – Deformação de Gel. A partir daqui, selecione a opção que é adequada para o experimento. Usando a caixa de diálogo do navegador de arquivos, selecione o diretório pai da pasta ‘análise’ contendo os dados analisados. Na janela Parâmetros para calcular a deformação do gel , selecione o tamanho da janela de correlação cruzada apropriada, o nível de ruído e o limiar (Figura Suplementar S7)20.NOTA: Os resultados são salvos em um diretório recém-criado de ‘deslocamento’ dentro de cada pasta de posição ‘análise/p0, análise/p1’, etc. É aqui que todos os arquivos de saída são armazenados. Parte 2: Quantificação da deformação de monocamadasNOTA: As entradas manuais nesta etapa incluem a identificação do diretório de dados e a seleção da resolução da grade. Os principais arquivos criados anteriormente usados nesta etapa incluem ‘p*/tny/*.tif’. Os principais novos arquivos produzidos neste incluem ‘p*/velocity/*_vel.dat’ que lista vetores de movimento das células. Consulte a Figura 7 para obter a descrição visual das etapas a serem engatar, via AnViM, a análise de Velocimetria de Imagem de Partículas nas imagens superiores das contas20. O procedimento é semelhante ao seguido para quantificar a deformação do hidrogel e seleciona o MSM – Cellular Motion do menu suspenso MSM . Os resultados são salvos em um diretório ‘velocity’ recém-criado dentro de cada pasta de posição ‘análise/p0’, ‘análise/p1’, etc. Quantificação de células-ECM e forças célula-célulaNOTA: A entrada manual nesta etapa inclui identificar o diretório de dados, indicar a rigidez do hidrogel e responder às solicitações de segmentação de clustercelular para detectar células da região sem células. Os principais arquivos criados anteriormente usados nesta etapa incluem ‘p*/displacement/*_disp.dat’. Os principais arquivos produzidos nesta etapa incluem: ‘p*/traction/*_trac.dat’, que lista forças exercidas pelas células do hidrogel; ‘p*/traction/*_domain.dat’, que lista a localização dos pontos de grade contendo células; e arquivos de entrada ‘p*/traction.in, p*/clusterInput.txt’ e ‘p*/prestress.in’ que registram as escolhas do usuário para esta etapa. Após a primeira avaliação quantitativa das forças célula-ECM e células-células, várias variações à técnica foram desenvolvidas1,15. As variações se concentram em casos específicos de substratos, células, condições experimentais ou ferramentas numéricas7, 8,21,22. Consulte a Figura 8 para obter a descrição visual para se engajar via AnViM, a Microscopia de Tração de Quatro Transformações e a análise de Microscopia de Estresse monocamada nos dados de deformação do hidrogel1,2,15. Inicie o software Fiji e, a partir do menu suspenso do MSM , selecione MSM – Cell-ECM e Cell-Cell Forces (terceira opção no menu suspenso). Usando a caixa de diálogo do navegador de arquivos, selecione o diretório pai da pasta ‘análise’ contendo as pastas ‘tnimgs’ e ‘análise’ contendo dados analisados. Clique em Selecionar. Na janela Parâmetros para calcular forças celulares , entre no módulo de cisalhamento, espessura do hidrogel e no nível de ruído previsto. Selecione OK. Isso permite que ele execute a tração através da função MATLAB.NOTA: Seguindo essas entradas, o AnViM calcula as forças do ECM celular. Depois disso, indique se a monocamada é confluente. Se toda a imagem celular está coberta de células, então a resposta é Sim. Nesse caso, as forças celulares serão computadas em todo o quadro. Por outro lado, se uma parte da imagem não tem células, então a resposta é Não. Nesse caso, siga as instruções do AnViM para facilitar a segmentação da região de imagem que contém células. Se a resposta for não, desenhe manualmente um polígono em torno do objeto não-celular quando o software solicitar isso e selecione um método apropriado para segmentação. O software pedirá a cor (preto ou branco) das células. Verifique a opção Preencher pontos automaticamente no software e clique em OK.NOTA: As etapas para segmentar uma monocamada não confluente serão cobertas na primeira parte da ‘Seção 2.4. As forças do Cell-ECM são armazenadas em arquivos ‘*_trac.dat’ em uma ‘tração’ de diretório recém-criada dentro de cada pasta de posição, e a entrada para o software de cálculo de força cell-ECM é salva no arquivo ‘traction.in’ (Figura Suplementar S8). As forças de células celulares são armazenadas em arquivos ‘*_prestress.dat’ em um diretório recém-criado ‘prestress’ dentro de cada pasta de posição, e a entrada para o software de cálculo de força celular é salva no arquivo ‘prestress.in’ (Figura Suplementar S9). Mapeamento de valores de pontos de grade em células individuaisNOTA: Um dos focos atuais do iTACS é introduzir uma abordagem simples para interpretar os sinais mecânicos medidos no campo. Esta abordagem é benéfica para examinar interações mecânicas entre células vizinhas de um cluster18. No geral, as propriedades quantificadas até agora estão em pontos de grade regularmente espaçados em todo o aglomerado celular. Esses dados identificam o desvio mediano, médio e padrão das propriedades selecionadas dentro do limite morfológico das células individuais e as atribui como propriedades/sinais físicos celulares. A partir disso, o desvio padrão é utilizado para indicar variabilidade, a diferença entre média e mediana é usada para indicar a natureza da distribuição, e o valor médio é usado para indicar o estado geral das células para as propriedades selecionadas.Parte 1: Segmentação da região da imagem que contém célulasNOTA: A entrada manual nesta etapa inclui identificar o diretório de dados e responder às solicitações de segmentação para detectar células da região sem células. Os principais arquivos criados anteriormente usados nesta etapa incluem ‘p*/phs/*.tif’. Os principais novos arquivos produzidos nesta etapa incluem ‘p*/phs/bwImages/*.tif’ que são imagens binárias que separam regiões celulares de regiões sem células, ‘p*/phs/textResults/frameNum_percentHealed.txt’, que lista por cento área de imagem coberta por células em cada instância, e ‘p*/clusterInput.txt’, que registra escolhas de usuário inseridas na interface AcTrM. Consulte a Figura 9 para obter a descrição visual das seguintes etapas para segmentar a região da imagem que contém células. Esta parte deve ser concluída antes de calcular as forças célula-célula. Nesse caso, essas etapas não precisam ser repetidas. Além disso, se essas etapas forem conduzidas antes dos cálculos de força celular-célula, elas não são solicitadas no início dos cálculos da força. Inicie o software Fiji e, a partir do menu suspenso do MSM , selecione Segmentação – Cluster Celular. Usando a caixa de diálogo do navegador de arquivos, selecione o diretório de posição ‘analysis/p0’, ‘analysis/p1’, etc., que contém propriedades quantificadas em pontos de grade regularmente espaçados. Indique se a monocamada é confluente.NOTA: As etapas abaixo são invocadas somente quando a monocamada não estiver confluente. Siga o AnViM solicita a aplicação da nova abordagem multifacetado para identificar as regiões de imagem que contêm células. O processo envolve quatro métodos – cada um abordando a segmentação de uma forma diferente. Um ou vários desses métodos usados em combinação cobrem uma grande variedade de imagens das células. Portanto, tente diferentes abordagens para descobrir qual combinação funciona melhor para seus dados. Ajuste o ‘fator de conexão de domínio’ e ‘Fator de difamação’ para obter a segmentação ideal.NOTA: O ‘fator difamação’ torna as regiões que contêm células maiores. Indique se as células aparecem em preto ou branco na imagem binária. Nas instruções para limpar a janela Imagem de limite , escolha se deve limpar a imagem automaticamente ou manualmente.NOTA: Características indesejadas das imagens são manchas pretas nos pixels ocupados por células e manchas brancas nos pixels desconectados do cluster celular a serem analisados. A análise só pode ser feita nas regiões conectadas. Assim, várias regiões desconectadas devem ser analisadas separadamente. Parte 2: Segmentação das células individuais nas imagensNOTA: As entradas manuais para esta etapa incluem identificar o diretório de dados e responder às solicitações de segmentação para detectar células individuais dentro da imagem. Os principais arquivos criados anteriormente usados nesta etapa incluem ‘p*/phs/*.tif’ e ‘p*/phs/bwImages/*.tif’. Os principais arquivos produzidos incluem ‘p*/phs/textResults/*.csv’, que contêm propriedades morfológicas celulares. Consulte a Figura 10 para obter a descrição visual das seguintes etapas para segmentar células individuais da monocamada. Inicie o software Fiji e, a partir do menu suspenso do MSM , selecione Segmentação – Células Individuais. Usando a caixa de diálogo do navegador de arquivos, selecione o diretório de posição ‘analysis/p0’, ‘analysis/p1’, etc., que contém propriedades quantificadas em pontos de grade regularmente espaçados. Na janela Escolher os Parâmetros de Entrada , indicar a proporção máxima, destaque de quanto o centro celular se destaca em relação ao limite celular e dois parâmetros de desfoque para orientar a detecção das células (Figura Suplementar S10). Na pilha de imagens para cada posição, desenhe um polígono na menor célula normal. Isso é usado para calcular a área. Qualquer coisa menor do que isso não será considerada como uma célula pelo software. Em seguida, desenhe um polígono em torno da maior célula normal e indique se o centro celular ou a interface celular é mais brilhante.NOTA: O AnViM cria então arquivos ‘phs/textResults/0001.csv’, ‘phs/textResults/0002.csv’ , etc., para cada quadro contendo informações sobre células dentro desse quadro. Nesta fase, este arquivo inclui informações morfológicas sobre as células, incluindo área, centroide, perímetro, orientação, circularidade, proporção, arredondamento, solidez, distância da região sem células. A unidade de comprimento nessas propriedades são pixels, e o ângulo está em graus. Finalmente, este arquivo é atualizado para conter intensidade, movimento e forças de pixels celulares nas etapas subsequentes. Parte 3: Mapeamento das intensidades dos pixels nas célulasNOTA: As entradas manuais nesta etapa incluem identificar o diretório de dados e selecionar propriedades e parâmetros de mapeamento. Os principais arquivos criados anteriormente usados nesta etapa incluem ‘p*/phs/*.tif’ (ou ‘p*/fluo/*.tif ‘) e ‘p*/phs/bwImages/*.tif’. Os principais novos arquivos produzidos nesta etapa incluem ‘p*/phs/textResults/*.csv’, que lista propriedades morfológicas celulares. Consulte a Figura 11 para obter a descrição visual das seguintes etapas para avaliar as intensidades de pixels na região englobadas por células individuais e sua região vizinha e defini-las como propriedades das células. Inicie o software Fiji e, a partir do menu suspenso do MSM , selecione Mapa em Células – Intensidades. Usando a caixa de diálogo do navegador de arquivos, selecione o diretório de posição ‘analysis/p0’, ‘analysis/p1’, etc., que contém propriedades quantificadas em pontos de grade regularmente espaçados. Selecione Detectar divisão celular ou quantificar fluorescência celular quando solicitado pelo software. Defina o tamanho da região vizinha. Verifique as propriedades de coleta da região vizinha e colete propriedades das caixas de células. Clique em OK. No Propósito de Registrar a janela intensidade celular, indique que tipo de imagem deve ser usada para mapeamento de intensidade, o tamanho da região vizinha e se os dados são coletados para células individuais ou ambas as células e suas regiões vizinhas (Figura Suplementar S11).NOTA: Mapear as intensidades dos pixels de uma imagem de contraste de fase permite a detecção de eventos de divisão celular. Mapear intensidades de imagem fluorescentes permitirá a detecção de flutuações nas moléculas citoplasmáticas marcadas fluorescentemente. A saída das etapas acima é os valores médios, medianos, de desvio padrão, mínimo e máximo de intensidade de pixel para células individuais. Esses números são inseridos como novas colunas nos arquivos ‘phs/textResults/0001.csv’, ‘phs/textResults/0002.csv’ , etc. Parte 4: Mapeamento das forças e movimento nas célulasNOTA: As entradas manuais para esta etapa incluem identificar o diretório de dados e selecionar propriedades e parâmetros de mapeamento. Os principais arquivos criados anteriormente usados nesta etapa incluem ‘p*/phs/textResults/*.csv’, ‘p*/velocity/*_vel.dat’, ‘p*/displacement/*_disp.dat’, ‘p*/traction/*_trac.dat’, ‘p*/prestress/*_prestress.dat’, e ‘p*/phs/bwImages/*.tif’. Nenhum novo arquivo é criado durante esta etapa. Em vez disso, as novas informações (propriedades de força celular e movimento) são adicionadas aos arquivos ‘p*/phs/textResults/*.csv ‘. Consulte a Figura 12 para a descrição visual das etapas para avaliar as forças e o movimento na região englobadas por células individuais e sua região vizinha e defini-las como propriedades das células. Escolha entre o mapa do menu suspenso do MSM em células – Dados de movimento/força (Figura Suplementar S12). Em seguida, siga os passos listados na etapa 2.4.3.NOTA: Novas colunas são adicionadas aos arquivos ‘phs/textResults/0001.csv’, ‘phs/textResults/0002.csv’, etc. e incluem o desvio médio, mediano e padrão de velocidade, a orientação da velocidade, tensão citoesqueleta média, anisotropia de tensão, energia de tensão no hidrogel, orientação de maior tensão e magnitude da tração célula-ECM (Figura Suplementar S13). Visualização de resultados Parte 1: Rastreamento das identidades celulares através do experimentoNOTA: As entradas manuais para esta etapa incluem identificar o diretório de dados e selecionar propriedades mapeadas para visualizar. Os principais arquivos criados anteriormente usados nesta etapa incluem ‘p*/phs/textResults/*.csv’. Os principais arquivos produzidos durante esta etapa incluem ‘p*/phs/textResults/cellTimeTrace_*.csv’, que contém um rastreamento de tempo dos dados celulares. Consulte a Figura 13 para obter a descrição visual das seguintes etapas para rastrear as propriedades de células individuais durante toda a duração do experimento. Inicie o software Fiji e, a partir do menu suspenso do MSM , selecione Resultados – Rastrear Dados. Usando a caixa de diálogo do navegador de arquivo, selecione o diretório de posição ‘análise/p0’, ‘análise/p1’, etc., contendo propriedades celulares a serem rastreadas. Quando terminar clique em Selecionar. Na janela Escolher ponto de partida para rastreamento , escolha o quadro de partida para monitoramento e o número de quadros rastreados simultaneamente (Figura Suplementar S14). Comece sempre a partir do quadro número 2, pois a velocidade não pode ser determinada para o quadro número 1. Quando terminar, clique em OK. Na janela Verificar as Variáveis para Fazer Trilhas , escolha as variáveis digitando os nomes de variável ou selecionando os termos das caixas de seleção (Figura Suplementar S15). Em seguida, clique em OK.NOTA: O rastreamento gera arquivos ‘phs/textResults/cellTimeTrace_*.csv’ com cada coluna contendo um número de celular único e cada linha sucessiva representando a instância temporal consecutiva. Parte 2: Geração de faixas temporidas das propriedades celulares avaliadasNOTA: As entradas manuais para esta etapa incluem identificar o diretório de dados e selecionar propriedades mapeadas para visualizar. Os principais arquivos criados anteriormente usados nesta etapa incluem ‘p*/phs/textResults/cellTimeTrace_*.csv’. Os principais arquivos produzidos durante esta etapa incluem ‘p*/phs/trackedDataPlots/*.tif’, que contêm plots de faixa de tempo e ‘p*/phs/trackedDataPlots/*.csv’, que contêm dados de plot. Consulte a Figura 14 para obter a descrição visual das seguintes etapas para gerar faixas de tempo das propriedades celulares avaliadas. Inicie o software Fiji e, a partir do menu suspenso do MSM , selecione Resultados – plot. Usando a caixa de diálogo do navegador de arquivos, selecione o diretório de posição ‘análise/p0’, ‘análise/p1’, etc., contendo propriedades celulares rastreadas a serem plotadas. Escolha se deve limitar a plotagem a células com faixas ininterruptas clicando no botão Sim ou Não .NOTA: Esta opção ignora as células, que não puderam ser detectadas em uma ou mais instâncias de tempo. Escolha o número de variáveis a serem plotadas simultaneamente e clique em OK.NOTA: Atualmente, o AnViM permite que um máximo de três variáveis sejam exibidas no mesmo lote. Escolha variáveis individuais para plotar usando um menu suspenso.NOTA: Essas etapas criam um arquivo TIFF (Image file format, formato de arquivo de imagem marcado) e um arquivo de dados separado por círia na pasta ‘phs/trackedDaDataPlots/’. O nome do arquivo é composto de nomes de variáveis separados por um sublinhado e termina com um número de celular. Parte 3: Geração de mapas de calor das propriedades celulares avaliadasNOTA: As entradas manuais nesta etapa incluem identificar o diretório de dados e selecionar propriedades mapeadas para visualizar. Os principais arquivos criados anteriormente usados nesta etapa incluem ‘p*/phs/textResults/cellTimeTrace_*.csv’. Os principais novos arquivos gerados nesta etapa incluem ‘p*/phs/segmentedImages/cellPropMaps/*.tif’, que são os mapas de calor das propriedades celulares. Consulte a Figura 15 para obter a descrição visual das etapas para gerar mapas de calor das propriedades celulares avaliadas. Escolha entre os resultados do menu suspenso do MSM – Imagem. Siga os passos descritos na etapa 2.5.2.NOTA: A saída é armazenada como arquivos TIFF na pasta ‘phs/segmentedImages/cellPropMaps/’. Os nomes dos arquivos são o número da instância de tempo e o nome variável separados por um sublinhado.