細胞信号を解析する統合ツールキット:力、運動、形態、蛍光

メモ:iTACSプラットフォームを使用して調べたサンプルは、ソフト基板に接着されたセルです。機械的および化学的信号を評価するためのプロトコルは、集録およびトレーニングモジュール(AcTrM)と分析および可視化モジュール(AnViM)の2つの連続した部分に分かれています。 1. 取得・トレーニングモジュール(AcTrM) 注: AcTrM は、データ収集とユーザーのセルフトレーニングのプロセスを自動化します。データ取得の前に、細胞が発揮する力を定量化するために必要な情報を提供できるソフト基材を用意してください。 ヒドロゲル調製物注:ここでの目標は、1,250 Paせん断弾性率、約100 μmの厚さ、および直径22mmのポリアクリルアミド(PAA)ヒドロゲルを準備することです。 Yeung et al. の方法に従ってポリアクリルアミド溶液を調製し、トレパトらら 14,15 で説明したステップに従ってヒドロゲルをキャストする。この手順の例外の 1 つは、細胞のすぐ下に埋め込まれたビーズの直径が 0.5 μm で、黄色の蛍光を発することです。 表示領域に大きな無細胞領域があると予想される場合は、カバーグラスに2μmビーズを取り付ける手順をスキップします。注: ヒドロゲル調製プロトコルは、field16 でかなり確立されました。その後の説明を通して、0.5 μmビーズは「トップビーズ」と呼ばれ、2 μmビーズは「ボトムビーズ」と呼ばれます。ただし、下のビーズは、イメージ領域に大きな無細胞領域が含まれている場合はオプションです。このような無細胞領域からのトップビーズパターンは、ボトムビーズパターンの目的を果たします。 埋め込み蛍光ビーズを用いたヒドロゲルを顕微鏡ステージに取り付けます。 プレートの温度が定常状態になるのに15~20分を許します。注:プレートの表面は細胞外マトリックスタンパク質で機能していますが、細胞はまだヒドロゲルに播種されていません。 参照画像取得 パート 1: 職位リストの作成注: このステップの手動入力には、最適なビード分布の場所を選択する AcTrM プロンプトに従う必要があります。この手順では、以前に作成されたファイルは使用されません。このステップで生成される主要な新しいフォルダには、’t0imgs’、’tnimgs’、および’textfiles’フォルダがあり、生成されるファイルにはポジションリストファイルが含まれています。AcTrM を使用したポジションリストの作成をガイドする以下の手順の視覚的な説明については、 図 2 を参照してください。デモの例では、20倍の倍率でデータを取得します。 μManager 2.0 – ベータ版を起動します。 IMBL リソース ウィンドウの AcTrM.bsh ボタンをクリックして AcTrM を実行します。 「 取得プロパティを定義」というタイトルのウィンドウで、適切な目的、横方向位置(すなわち、XY)回復の精度に対する許容値、ラフおよび精製再焦点のステップサイズ(すなわち、z)の動作、およびフォーカス回復のための許容可能な画像相関係数の値を選択します。注: 横位置の回復に対する許容度が高いほど位置の回復は遅くなりますが、データ分析中に位置を補正する必要があり、フォーカス回復が困難になる可能性があります。ステップサイズを小さくすると再焦点の動作が遅くなりますが、ステップサイズが非常に高いと、フォーカスを逃す機会を持つ急速な動きが発生する可能性があります。 「AcTrM – ステップ 0」ウィンドウで「新規取得」を選択してポジション・リストを作成します。注: AcTrM – ステップ 1 というタイトルのウィンドウには、次の主要な手順がすべて一覧表示されます。これらのステップには、ステージの移動、フォーカスの調整、μManagerのボタンのクリックが含まれます。これらのステップガイドは、データ収集に適したポジションのリストを構築する際に役立つガイドです。 「ライブインマイクロマネージャー」をクリックして、AcTrM – ステップ1ウィンドウに表示される手動調整のサンプルを視覚化します。 このウィンドウに表示されている手順に従います。 今ビーズのイメージを取得します。上部のビーズに適したチャネルを選択します。 下のビーズも確認してください。これを行うには、下部のビーズのチャンネルを選択します。下のビーズのぼやけた画像が見えます。メモ:チャンネルは、μManagerのメインウィンドウのプリセットドロップダウンメニューから切り替えることができます。実験で下のビーズを使用する場合は、選択した位置に存在することを確認します。これらのビーズはぼやけて表示されます。 適切な位置を選択したら、「ステージ位置リスト」ウィンドウで「マーク」をクリックして、位置を保存します。注:最良の位置は、上部表面のすぐ下に埋め込まれた上部ビーズ(すなわち、上のビーズ)とカバーガラス(すなわち、底ビーズ)に取り付けられた少なくとも2つのビーズ(補足図S1)の密で均一な分布によって定義される。底のビーズが大きく、焦点が合っていないリングとして見える場合、フォーカス回復が速くなります。ただし、実験がフォーカスや横位置の回復を必要としない1つの位置で行われる場合は、下部のビーズ画像に関連する指示を無視してください。 図 2 で説明するステップ 6 ~ 9 に従って、追加の位置をリストに含めます。注: 除去のラウンドがプレート上で選択された最良の位置を可能にできるように、いくつかの追加の位置を選択します。 パート2:参照画像の取得注: この手順では、手動入力は行いません。この手順で使用される以前に作成されたキー ファイルには、’textfiles/*.pos’ が含まれます。このステップで生成される重要な新しいファイルとフォルダには、’t0imgs’ フォルダと ‘tnimgs’ フォルダ内のものが含まれます。AcTrM を使用した参照イメージの取得をガイドする次の手順の視覚的な説明については、 図 3 および 補助図 S2 を参照してください。 AcTrM – ステップ 2 ウィンドウには、すべての主要なステップも表示されます。 AcTrM – ステップ 2 ウィンドウに表示される手順に従って、多次元取得ウィンドウで選択を行います。たとえば、長時間経過するには、撮影する画像の数を指定し、最初のチャンネルをフェーズチャネルとして選択し、次に上のビーズとそれ以降の次のビーズを選択します。[多次元集録]ウィンドウで[閉じる]をクリックし、[ActrM – ステップ2]ウィンドウで[OK]をクリックします。 [AcTrM – ステップ 3]ウィンドウで、参照画像ベースの XYZ 位置回復を行うことを選択します。選択は一般的にイエスです。ただし、フォーカスやステージドリフトの余地のない1つの位置で画像が取得された場合、AcTrM – ステップ3ウィンドウでの選択はNoになります。 [ AcTrM – XYZ リカバリ オプション] ウィンドウで、XYZ リカバリの調整、リージョン、および調整された XYZ 回復の方向、および再フォーカスの開始方向を実行する場合の、大まかな XYZ リカバリのチャネルを設定します(補助図 S4)。完了すると、AcTrMは参照画像を取得します。注: チャネルの典型的な選択肢は、下部のビーズ チャネルです。XYZ リカバリは、現在の実装で完全なイメージを使用して実行する場合に最適です。参考画像には、通常、ヒドロゲルの透過光画像、上部ビーズの蛍光像、およびボトムビーズの蛍光画像が含まれる。各画像セットの内容は、[ 多次元取得 ]ウィンドウでの選択によって異なる場合があります。それでも、ソフトウェアは 図2で決定された各位置で設定された参照画像を取得します。このステップの最後に、選択したディレクトリに「t0imgs」「tnimgs」「テキストファイル」という3つのフォルダが作成されます。’t0imgs’ フォルダには、μManager によって認識され、後続のステップで使用される形式の参照イメージが含まれています。’tnimgs’ フォルダには、ファイル名 ‘c0_p0_t0.tif’ や “c1_p0_t0.tif” などの別々の TIFF イメージが含まれています。ここで’c’はチャンネルを表し、’p’はポジションを表し、’t’は時間を表します。これらの文字の後には、それぞれチャネル番号、位置番号、およびフレーム番号が続きます。フォルダ’textfiles’には、画像取得と位置回復のためのXML形式の位置リストとユーザー選択が含まれています。 細胞の播種と増殖注:iTACSプラットフォームは、まばらな細胞、完全に合流単層、ネットワーク形成アッセイ、穴や大きなギャップを持つ単層を含む、接着細胞の機械的挙動の一般的な in vitro評価で 使用されるサンプル調製プロトコルに対応する柔軟性を備えています。 フラスコで合流させる培養ラット肺微小血管内皮細胞17,18. トリプシンを使用してセルを取り外します。10%のウシ胎児血清を含む培地中の細胞を1 x 106 細胞/mL濃度に再懸濁させる。 再懸濁した細胞の液滴を部分的に乾燥したヒドロゲル表面に置き、細胞培養インキュベーターに入れる。注:10%のウシ胎児血清を含む培養培地中で2日後、その液滴中の細胞は細胞1の混雑した島を形成する。 残りの実験のための自動画像取得注: このステップの手動入力には、画像取得を再開するための AcTrM プロンプトに従う必要があります。このステップで以前に作成されたファイルには、’textfiles/*.pos’ とフォルダ ‘t0imgs’ の下のビードイメージファイルがあります。このステップで生成される重要な新しいファイルには、更新された位置リストファイルとイメージ ‘tnimgs/*_t*.tif’ が含まれます。 顕微鏡環境制御システムが安定した組織培養条件に達することを確認します。 培養細胞を含むプレートを顕微鏡ステージにそっと取り付けます。 温度と湿度が安定するまで15〜20分かかります。注: AcTrM を使用した残りの実験のイメージの取得をガイドする次の手順の視覚的な説明については 、図 4 を参照してください。 μManager 2.0 – ベータ版を起動します。 IMBL リソース ウィンドウの AcTrM.bsh ボタンをクリックして AcTrM を実行します。注: [ 取得プロパティの定義] ウィンドウでの選択は無視しますが、前の手順で行った選択を使用します。 [AcTrM – ステップ 0] ウィンドウで、[一時停止された取得を続行] を選択します。 前の手順で、データフォルダ(‘t0imags’、’tnimgs’、および’textfiles’)が保存された「 多次元取得 」ウィンドウで識別される倍率とディレクトリを選択します。注: ウィンドウのタイトルは、ユーザーが適切なディレクトリを選択するようにガイドします。 「 プレートの位置変更 」ウィンドウで、プレートの位置変更に使用するチャネルと一緒にプレートの位置を変更するオプション(3つの非線形位置)を選択します。注:保存した画像はカメラに表示されます。重なり合う画像が赤、緑、黒のカラーイメージとして表示される場合は、手動調整を行います。 [同意する] をクリックして、取得を続行します。注:このステップは、プレートが顕微鏡ステージに再マウントされたときのプレートの位置合わせの再現性からのわずかなシフトを克服します。赤で表示される参照画像(通常は下のビーズ)と現在緑色で示された目的を通して観察されている画像の合成画像を表示することにより、AcTrMプロンプトに従って3つの位置のそれぞれで整列を促進します。緑を赤に十分近づけることは、ソフトウェアの作業が少なくなります。オーバーラップが完全な場合、合成画像は黄色と黒で表示されます。通常、同じ下のビーズが赤と緑の両方の画像に表示され、対応する赤と緑の焦点外のリングが互いに接触している場合は、十分に近い値になります。プレートの位置変更が完了すると、AcTrMは選択した各位置にステージを取り、カメラを通して現在見られるものと基準画像を一致させることによってXYZ位置を回復します。最初の横 (XY) 位置が一致し、次にフォーカス (Z) が一致します。大まかな回復は位置および焦点の洗練された回復によって続く。実験の現在の状態の更新は、 補助図S3に示す4つの部分のウィンドウを通して画面に表示されます。取得した画像は、イメージセットの時間カウントを示す’*_t1.tif’、”*_t2.tif’の後の「tnimgs」フォルダに保存されます。XYZリカバリで更新されたポジションが識別されると、新しいポジションリストが生成され、’textfiles’フォルダに保存されます。 2. 分析・可視化モジュール(AnViM) 自動データ分析の設定注: このステップでの手動入力には、’tnimgs’ フォルダの場所を特定する必要があります。このステップで以前に作成されたファイルには、”tnimgs/*.tif’ があります。このステップで生成される重要な新しいファイルとフォルダには、’tnimgs’ と同じ親フォルダの ‘analysis’ フォルダと、各位置 ‘analysis/p*’ のフォルダが含まれます。各 ‘分析/p*’ 内で、この手順は ‘phs’ と ‘tny’ フォルダ内に新しい ‘*.tif’ イメージ ファイルを作成します。これらの画像は、細胞とトップビーズのトリミングされ、漂流解除された画像です。作成されるその他のファイルには、分析の選択肢をリストする「analysis/analysisChoices.txt」、有意な既存のドリフトのために分析がスキップされたインスタンスを一覧表示する「分析/p*/skipAnalysis.txt」、推定ドリフト値をリストする「分析/p*/part_shift_values_pixel_degree.dat」などがあります。AnViM は’tnimgs’ フォルダ内の生データを変更しません。AnViM を使用した自動データ分析の設定をガイドする次の手順の視覚的な説明については 、図 5 を参照してください。 フィジーソフトウェアを起動し、 MSM のドロップダウンメニューで[ MSM – 前処理]というラベルの付いた最初のオプションを選択します。 ファイルブラウザダイアログを使用して、分析されたデータを含む’tnimgs’フォルダを含むフォルダを選択します。 画像のチャンネルを定義します。 補助図S5のガイドラインに従って、細胞の透過光画像(細胞の位相コントラスト画像)、下部ビーズ画像および上ビーズ画像のチャネル番号を特定する。次の 3 つのチェックボックス(「ファイルを位置フォルダに移動する」「リジッド モーションの補正を行う」、および「データを切り取って位置フォルダに保存する」)は、通常オンになります。最後に、大きくドリフトしたデータ、ピクセル サイズ、およびセルが交差する画像の側面を拒否するための許容値を定義します。 下のビーズのイメージの明るさとコントラストを高めるプロンプトに応答して、ビーズが目立つようにします。メニューのスライダーバーを使用して調整し、[OK] をクリックします。 位置補正を実行して、シフトがあれば、シフトを取り除きます。完了すると、分析フォルダーが作成されます。注: 通常、コントラストの強化は必要ありませんが、この規定はレーザーへの露出を最小限に抑える必要がある実験で使用できます。その選択の後、AnViMは’tnimgs’フォルダから’分析’フォルダにファイルをコピーします。各位置に対応するファイルは、フォルダ’分析/p0、分析/p1’などに保存されます。これらの各位置フォルダ内で、AnViMはオリジナルの透過光画像、上部ビーズ画像、およびボトムビーズ画像を含む’cels’、’defs’、および’refs’フォルダをそれぞれ作成します(補助図S6)。AnViMは、下部ビーズの画像の剛性運動を分析し、セルの修正された送信光画像と更新されたトップビーズ画像を含む「tny」フォルダを含む「phs」フォルダを作成します。最後に、チャネル、操作、許容値、ピクセル サイズ、および境界交差のユーザー選択は’analysisChoices.txt ファイルに保存されます (補助図 S6)。 ヒドロゲルと単層の変形の定量化注: 一連の画像からの移動の定量化は、急速に進化する field19 であることに注意してください。この技術は、速度、精度、生画像内の特定の特徴、特定の変形パターンなどの機能に対して常に最適化されています。したがって、一部のユーザーはここで示したものとは異なる変形定量方法を使用する可能性があります。 パート1:ヒドロゲル変形の定量化注: このステップでの手動入力には、データディレクトリの識別とグリッド解像度の選択が含まれます。この手順で以前に作成されたファイルには、’p*/tny/*.tif’ があります。この中で生成される主要な新しいファイルには、ヒドロゲルの上面の変位ベクトルをリストする「p*/ディスプレイスメント/*_disp.dat」が含まれます。図 6 を参照して、AnViM を介して 、上部のビーズ 画像20上のパーティクル画像 Velocimetry 解析を行う次の手順の視覚的な説明を参照してください。 フィジーソフトウェアを起動し、 MSM ドロップダウンメニューから[ MSM – ゲル変形]を選択します。 ここで、実験に適したオプションを選択します。 ファイルブラウザダイアログを使用して、分析されたデータを含む’analysis’フォルダの親ディレクトリを選択します。 [ ゲル変形計算パラメータ]ウィンドウで 、適切な相互相関ウィンドウサイズ、ノイズレベル、およびしきい値(補足図S7)20を選択します。注: 結果は、各位置フォルダ ‘分析/p0、分析/p1’内に新しく作成された’変位’ディレクトリに保存されます。これは、すべての出力ファイルが格納される場所です。 パート2:単層変形の定量化注: この手順での手動入力には、データ ディレクトリの識別とグリッド解像度の選択が含まれます。この手順で以前に作成されたファイルには、’p*/tny/*.tif’ があります。この中で生成される主要な新しいファイルには、セルの動きベクトルをリストする「p*/velocity/*_vel.dat」が含まれます。上部のビーズ画像20上の粒子画像Velocmetry解析をAnViMを介して関与するステップの視覚的な説明については、図7を参照してください。手順は、ハイドロゲルの変形を定量化するために続くものと同様であり、MSMドロップダウンメニューからMSM – セルラーモーションを選択します。結果は、各位置フォルダ’分析/p0’、’分析/p1’内に新しく作成された’velocity’ディレクトリに保存されます。 細胞-ECMおよび細胞-細胞力の定量化注: このステップの手動入力には、データディレクトリの識別、ヒドロゲルの剛性の示し、セルラークラスタセグメンテーションプロンプトへの応答が含まれ、無細胞領域からセルを検出します。この手順で以前に作成されたファイルには、「p*/ディスプレイスメント/*_disp.dat」があります。このステップで生成される主要な新しいファイルには、ヒドロゲル上の細胞によって加えられる力をリストする「p*/トラクション/*_trac.dat」が含まれます。セルを含むグリッドポイントの位置をリストする「p*/トラクション/*_domain.dat」。このステップのユーザー選択を記録する入力ファイル 「p*/トラクション.in、p*/clusterInput.txt および ‘p*/prestress.in’細胞-ECMおよび細胞-細胞力の最初の定量的評価に続いて、この技術に対するいくつかのバリエーションが開発された1,15。このバリエーションは、基質、細胞、実験条件、または数値ツールの特定のケースに焦点を当てています7,8,21,22。図 8 を参照して、アンヴィム、フーリエ変換トラクション顕微鏡、およびハイドロゲル変形データに関する単層応力顕微鏡解析を介して関与する視覚的説明 1,2,15 を参照してください。 フィジーソフトウェアを起動し、 MSM ドロップダウンメニューから[ MSM – セル-ECMおよびセルセル力 ]を選択します(ドロップダウンメニューの3番目のオプション)。 ファイルブラウザダイアログを使用して、分析されたデータを含む「tnimgs」と「分析」フォルダを含む’分析’フォルダの親ディレクトリを選択します。[選択]をクリック します。 [ セルラー フォース計算パラメータ] ウィンドウで、せん断係数、ハイドロゲルの厚さ、予想されるノイズ レベルを入力します。[ OK] を選択します。これにより、MATLAB 関数を 介して トラクションを実行できます。注: これらの入力に従って、AnViM はセル ECM 力を計算します。 その後、単層がコンフルエントであるかどうかを示す。セル全体の画像がセルで覆われている場合、答えは 「はい」です。その場合、セルの力はフレーム全体にわたって計算されます。一方、画像の一部にセルがない場合、答えは No です。その場合は、AnViM のプロンプトに従って、セルを含むイメージ領域のセグメンテーションを容易にします。 答えが「いいえ」の場合は、ソフトウェアでプロンプトが表示されたときにセル以外のオブジェクトの周囲にポリゴンを手動で描画し、セグメンテーションに適した方法を選択します。ソフトウェアは、セルの色(黒または白)を求めます。 ソフトウェアの [スポットを自動的に埋める ]オプションをオンにし、[ OK]をクリックします。注: 非コンフルエント単一層をセグメント化する手順は、’セクション 2.4 の最初の部分で説明します。セル-ECMフォースは、各位置フォルダ内の新しく作成されたディレクトリ’トラクション’に’*_trac.dat’ファイルに格納され、セルECM力計算ソフトウェアへの入力はファイル’traction.in’に保存されます(補足図S8)。セルセルの力は、各ポジションフォルダ内の新しく作成されたディレクトリ’prestress’の’*_prestress.dat’ファイルに格納され、セルセル力計算ソフトウェアへの入力はファイル’prestress.in’に保存されます(補足図S9)。 個々のセルのグリッドポイント値のマッピング注: iTACS の現在の焦点の 1 つは、現場で測定された機械的信号を解釈する簡単なアプローチを導入することです。このアプローチは、クラスターの隣接する細胞間の機械的相互作用を調べるのに役立ちます18.全体として、これまで定量化されたプロパティは、セルラー クラスター全体に定期的に配置されたグリッド ポイントにあります。このデータは、個々の細胞の形態学的境界内で選択されたプロパティの中央値、平均値、標準偏差を識別し、それらを細胞の物理的特性/信号として割り当てます。これらのことから、標準偏差は変動性を示すために使用され、平均と中央値の差は分布の性質を示すために使用され、中央値は選択されたプロパティの細胞の全体的な状態を示すために使用されます。パート 1: セルを含むイメージ領域のセグメンテーション注: このステップへの手動入力には、データディレクトリの識別と、無細胞領域からのセルを検出するためのセグメンテーションプロンプトへの応答が含まれます。この手順で以前に作成されたファイルには、’p*/phs/*.tif’ があります。このステップで生成される主な新しいファイルには、セル領域を非細胞領域から分離するバイナリ画像である「p*/phs/bwImages/*.tif」、各インスタンスのセルでカバーされるパーセント画像領域をリストする「p*/phs/textResults/frameNum_percentHealed.txt」、AcTrMインターフェースに入力されたユーザーの選択を記録する「p*/clusterInput.txt」などがあります。セルを含むイメージ領域をセグメント化する次の手順の視覚的な説明については、 図 9 を参照してください。セルの力を計算する前に、この部分を完了する必要があります。その場合、これらのステップを繰り返す必要はありません。また、セルの力の計算の前にこれらの手順を実行した場合、これらのステップは、力の計算の開始時に要求されません。 フィジー ソフトウェアを起動し、 MSM ドロップダウン メニューから [セグメンテーション – セルラー クラスター] を選択します。 ファイルブラウザダイアログを使用して、定期的に間隔を置いたグリッドポイントで定量化されたプロパティを含む位置ディレクトリ’analysis/p0’、’analysis/p1’などを選択します。 単層がコンフルエントであるかどうかを示します。注: 以下の手順は、単層がコンフルエントでない場合にのみ呼び出されます。AnViM プロンプトに従って、セルを含むイメージ領域を識別する新しい多面的アプローチを適用します。このプロセスには、4つの方法が含まれています – それぞれが異なる方法でセグメンテーションに近づいています。これらの方法の1つまたは複数を組み合わせて使用すると、細胞の多種多様な画像をカバーする。したがって、データに最適な組み合わせを見つけるために、さまざまな方法を試してください。 最適なセグメンテーションを得るために、「ドメイン接続係数」と「スミア係数」を調整します。注: 「スミアファクター」を使用すると、セルを含む領域が大きくなります。 バイナリ イメージ内のセルが黒か白かを示します。 [ 境界イメージをクリーニングする方向 ]ウィンドウで、イメージを自動的にクリーニングするか手動でクリーニングするかを選択します。注:画像の不要な特徴は、セルが占めるピクセル上の黒い斑点と、分析対象のセルクラスタから切断されたピクセル上の白い斑点です。解析は、接続されているリージョンでのみ実行できます。したがって、複数の切断されたリージョンを個別に分析する必要があります。 パート2:画像内の個々のセルのセグメンテーション注: この手順への手動入力には、データ ディレクトリの識別と、イメージ内の個々のセルを検出するためのセグメンテーション プロンプトへの応答が含まれます。このステップで以前に作成されたファイルには、’p*/phs/*.tif’と’p*/phs/bwImages/*.tif’があります。生産された主な新しいファイルには、細胞形態学的特性を含む「p*/phs/textResults/*.csv」が含まれます。単層の個々のセルをセグメント化する次の手順の視覚的な説明については 、図 10 を参照してください。 フィジーソフトウェアを起動し、 MSM ドロップダウンメニューから セグメンテーション – 個々のセルを選択します。 ファイルブラウザダイアログを使用して、定期的に間隔を置いたグリッドポイントで定量化されたプロパティを含む位置ディレクトリ’analysis/p0’、’analysis/p1’などを選択します。 [ 入力パラメータの選択] ウィンドウで、最大アスペクト比、セルの中心がセル境界と比べてどの程度目立っているか、およびセルの検出を導く 2 つのぼかしパラメータを指定します(補助図 S10)。 各位置のイメージ スタックで、最小の法線セルにポリゴンを描画します。面積の計算に使用されます。これより小さいものは、ソフトウェアによってセルとして考慮されません。 次に、最大の法線セルの周囲にポリゴンを描画し、セルの中心またはセルのインタフェースが明るいかどうかを示します。注: AnViM は、そのフレーム内のセルに関する情報を含む各フレームに対して、”phs/textResults/0001.csv’、’phs/textResults/0002.csv’ などのファイルを作成します。この段階では、このファイルは、領域、中心、周長、向き、円形度、アスペクト比、丸み、固さ、非細胞領域からの距離を含む細胞に関する形態学的情報を含む。これらのプロパティの長さの単位はピクセルで、角度は度単位です。最後に、このファイルは、後続の手順でセルラーピクセルの強度、モーション、および力を含む更新されます。 パート 3: セルのピクセル強度のマッピング注: この手順での手動入力には、データ ディレクトリの識別とマッピング プロパティとパラメータの選択が含まれます。このステップで以前に作成されたファイルには、「p*/phs/*.tif」(または’p*/fluo/*.tif ‘)と’p*/phs/bwImages/*.tif’があります。このステップで生成される主要な新しいファイルには、細胞形態学的特性をリストする「p*/phs/textResults/*.csv」が含まれます。個々のセルとその隣接領域に包含される領域のピクセルの強度を評価し、それらをセルのプロパティとして定義する次の手順の視覚的な説明については 、図 11 を参照してください。 フィジー ソフトウェアを起動し、 MSM ドロップダウン メニューから [セルのマップ – 強度] を選択します。 ファイルブラウザダイアログを使用して、定期的に間隔を置いたグリッドポイントで定量化されたプロパティを含む位置ディレクトリ’analysis/p0’、’analysis/p1’などを選択します。 ソフトウェアのプロンプトで「細胞分裂を検出」または「細胞蛍光を定量化」を選択します。隣接する領域のサイズを定義します。[隣接領域のプロパティを収集] と [セルのプロパティを収集] の両方をオンにします。 [OK] をクリックします。 [細胞強度の記録の目的] ウィンドウで、強度マッピングに使用する画像の種類、隣接領域のサイズ、および個々のセルまたは両方のセルとそれらの隣接領域についてデータが収集されるかどうかを示します (補助図 S11)。注: 位相コントラスト画像のピクセル強度をマッピングすると、細胞分割イベントを検出できます。蛍光画像強度をマッピングすることで、蛍光タグ付き細胞質分子の変動を検出できます。上記のステップの出力は、個々のセルの平均値、中央値、標準偏差、最小、最大ピクセル強度の値です。これらの数値は、ファイル ‘phs/textResults/0001’ .csv’、 ‘phs/textResults/0002.csv に新しい列として入力されます。 パート4:細胞の力と運動のマッピング注: このステップへの手動入力には、データディレクトリの識別とマッピングのプロパティとパラメータの選択が含まれます。このステップで使用される主なファイルには、「p*/phs/textResults/*.csv」、「p*/velocity/*_vel.dat」、「p*/ずれ/_disp.dat」、「p*/トラクション/*_trac.dat」、「p*/プリストレス/*_prestress.dat」、および「p*/phs/bwImages/.tif」が含まれます。この手順では、新しいファイルは作成されません。代わりに、新しい情報(セルラー力と動きのプロパティ)がファイル’p*/phs/textResults/*.csv’に追加されます。個々のセルとその隣接領域に含まれる領域の力と動きを評価し、それらをセルのプロパティとして定義する手順の視覚的な説明については、 図 12 を参照してください。 [MSM] ドロップダウン メニューの [セルのマップ – モーション/フォース データ(補助図 S12)] から選択します。 次に、ステップ 2.4.3 に示されている手順に従います。注:新しい列は、ファイル’phs/textResults/0001.csv’、’phs/textResults/0002.csv’などに追加され、平均値、中央値、速度の標準偏差、速度の向き、平均細胞骨格張り、緊張異方性、ヒドロゲル内のひずみエネルギー、高い張力の向き、セルECM-図S13の大きさが含まれます。 結果の可視化 パート 1: 実験全体での細胞のアイデンティティの追跡注: この手順への手動入力には、データ ディレクトリの識別と、視覚化するマップされたプロパティの選択が含まれます。この手順で以前に作成されたファイルには、’p*/phs/textResults/*.csv’ があります。このステップで生成される主な新しいファイルには、携帯電話のデータの時間トレースを含む「p*/phs/textResults/cellTimeTrace_*.csv」が含まれます。実験の全期間にわたって個々のセルのプロパティを追跡する次の手順の視覚的な説明については 、図 13 を参照してください。 フィジーソフトウェアを起動し、 MSM ドロップダウンメニューから [結果 – データの追跡]を選択します。 ファイルブラウザダイアログを使用して、追跡するセルラープロパティを含む位置ディレクトリ’analysis/p0’、’analysis/p1’などを選択します。完了したら、 選択をクリックします。 [ トラッキングの開始点を選択 ]ウィンドウで、監視する開始フレームと同時に追跡されるフレーム数を選択します(補助図S14)。フレーム番号 1 では速度を決定できないため、フレーム番号 2 から常に開始します。完了したら、[OK] をクリックします。 「 トラックを作成する変数を確認」 ウィンドウで、変数名を入力するか、またはチェックボックスから項を選択して変数を選択します (補足図 S15)。次に、[OK] をクリック します。注: 追跡は、一意のセル番号と連続した時間インスタンスを表す各行を含む各列を含む「phs/textResults/cellTimeTrace_*.csv」ファイルを生成します。 パート2:評価された細胞特性のタイムトラックの生成注: この手順への手動入力には、データ ディレクトリの識別と、視覚化するマップされたプロパティの選択が含まれます。この手順で以前に作成されたファイルには、’p*/phs/textResults/cellTimeTrace_*.csv’ があります。このステップで生成された主な新しいファイルには、タイムトラックプロットを含む「p*/phs/trackedDataPlot/*.tif」とプロットデータを含む「p*/phs/trackedDataPlots/*.csv」があります。評価されたセルラー プロパティのタイム トラックを生成する次の手順の視覚的な説明については、 図 14 を参照してください。 フィジーソフトウェアを起動し、 MSM ドロップダウンメニューから [結果 – プロット]を選択します。 ファイルブラウザダイアログを使用して、プロットする追跡されたセルラープロパティを含む位置ディレクトリ’analysis/p0’、’analysis/p1’などを選択します。 [ はい ]または[ いいえ ]ボタンをクリックして、トラックが切れなくなったセルにプロットを制限するかどうかを選択します。注: このオプションは、1 つ以上の時間インスタンスで検出できなかったセルを無視します。 同時にプロットする変数の数を選択し、[ OK]をクリックします。注: 現在、AnViM では、最大 3 つの変数を同じプロットに表示できます。 ドロップダウン メニューを使用して、プロットする個々の変数を選択します。注: これらの手順では、タグ付きイメージ ファイル形式 (TIFF) ファイルとコンマ区切りのデータ ファイルを作成する、phs/trackedDataPlots/’ フォルダー内。ファイル名は、アンダースコアで区切られた変数名で構成され、セル番号で終わります。 パート3:評価された細胞特性のヒートマップの生成注: このステップでの手動入力には、データディレクトリの識別と、視覚化するマップされたプロパティの選択が含まれます。この手順で以前に作成されたファイルには、’p*/phs/textResults/cellTimeTrace_*.csv’ があります。このステップで生成される主な新しいファイルには、セルラープロパティのヒートマップである「p*/phs/segmentedImages/cellPropMaps/*.tif」が含まれます。評価されたセルラー プロパティのヒート マップを生成する手順の視覚的な説明については 、図 15 を参照してください。 MSM ドロップダウン メニューの結果 – 画像から選択します。 ステップ 2.5.2 で説明されている手順に従います。注: 出力は、TIFF ファイル ファイルとして ‘phs/セグメントイメージ/セルプロップマップ/’ フォルダーに格納されます。ファイル名は、時間インスタンス番号と変数名をアンダースコアで区切ったものです。