مجموعة أدوات تكاملية لتحليل الإشارات الخلوية: القوى والحركة والمورفولوجيا والفلورسينس
1Biomedical Sciences, Pat Capps Covey College of Allied Health Professions,University of South Alabama, 2Department of Physiology and Cell Biology, College of Medicine,University of South Alabama, 3Center for Lung Biology, College of Medicine,University of South Alabama, 4William B. Burnsed Jr. Mechanical, Aerospace, and Biomedical Engineering Department, College of Engineering,University of South Alabama, 5Mitchell Cancer Institute, College of Medicine,University of South Alabama, 6Department of Chemical and Biomedical Engineering,West Virginia University, 7Department of Pharmacology, College of Medicine,University of South Alabama, 8Department of Physiology & Pharmacology, College of Osteopathic Medicine,Sam Houston State University
Summary
تعمل منصة مجموعة الأدوات التكاملية لتحليل الإشارات الخلوية (iTACS) على أتمتة عملية قياس مجموعة واسعة من الإشارات الكيميائية والميكايكية في الخلايا الملتصقة في وقت واحد. تم تصميم iTACS لتسهيل التنمية التي يقودها المجتمع وتمكين الباحثين من استخدام جميع ميزات المنصة بغض النظر عن خلفيتهم التعليمية.
Abstract
تقدم التقييم الكمي للقوى الخلوية والحركة بشكل كبير على مدى العقود الأربعة الماضية. ووفرت هذه التطورات الإطار لدراسة عمليات الإشارات الميكانيكية الثاقبة في نظم زراعة الخلايا. ومع ذلك، يواجه المجال حاليا ثلاث مشاكل: عدم وجود توحيد جودة للبيانات المكتسبة، وأخطاء تقنية في تحليل البيانات والتصور، وربما الأهم من ذلك، أن التكنولوجيا لا تزال بعيدة المنال إلى حد كبير بالنسبة لمختبرات بيولوجيا الخلايا المشتركة. للتغلب على هذه القيود، قمنا بتطوير منصة تجريبية جديدة – مجموعة أدوات تكاملية لتحليل الإشارات الخلوية (iTACS). iTACS يتكون من عنصرين: اقتناء والتدريب وحدة (AcTrM) وتحليل والتصور وحدة (AnViM). ويستند AcTrM على μManager — وهو برنامج التحكم في المجهر NIH – ImageJ القائم — ويسهل المستخدم التدريب الذاتي والتشغيل الآلي لبروتوكولات اقتناء الصور المشتركة. تقوم AnViM على NIH-ImageJ وتيسر التشغيل الآلي سهل الاستخدام لتحليل البيانات والتصور الثاقب للنتائج. وتشمل هذه التجارب زراعة الخلايا الملتصقة على الهيدروجيل، وعلامات التصوير الكهودولوجية المضمنة في الهيدروجيل، وأخيرا استخراج توصيف ميكانيكي شامل للخلايا من هذه الصور. حاليا، iTACS تمكن المستخدم لتحليل وتتبع مجموعة واسعة من الخصائص، بما في ذلك مورفولوجيا، والحركة، والقوى الهيكل الخلوي، وفلورسينس من الخلايا الفردية والمنطقة المجاورة لها. تمت معالجة مشكلة توحيد الجودة في AcTrM باستخدام تقنية إعادة التركيز المرجعية الموجهة بالصور. تم تناول القضايا التقنية في تحليل البيانات في AnViM مع إجراء تجزئة الصور متعددة الجوانب ، ونهج سهل الاستخدام لتحديد ظروف الحدود ، وتصور جديد للبيانات المستندة إلى الخصائص الخلوية. تم تصميم AcTrM لتسهيل التحول المباشر للمجاهر الفلورية الأساسية إلى منصات ميكانيكا الخلايا التجريبية ، وتم تجهيز AnViM لتمكين المستخدمين من قياس الإشارات الميكانيكية الخلوية دون الحاجة إلى خلفية هندسية. وسوف تكون iTACS متاحة لمجتمع البحوث كجناح مفتوح المصدر مع قدرات التنمية التي يقودها المجتمع.
Introduction
تستخدم أدوات التصوير البصري وتحليل البيانات الشائعة الاستخدام تقنيات الأجهزة والبرامج التي تكاد تكون عتيقة. إن التأخر في ترجمة وتنفيذ التقدم في الأجهزة الإلكترونية والنهج الحاسوبية والتحليل الرياضي في أدوات بيولوجيا الخلايا التجريبية المشتركة هو قيد رئيسي على وتيرة النمو في معرفتنا بعلم وظائف الأعضاء الخلوية. حاليا، يجد الباحثون في بيولوجيا الخلايا أدوات البيولوجيا الجزيئية في متناول اليد، ولكن الأدوات القائمة على المبادئ الهندسية لتكون بعيدة المنال. ومن هذه الأدوات القائمة على المبادئ الهندسية المجهر الإجهاد أحادي الطبقة (MSM)1,2. وفي حين تم تكييف MSM ودراسة في مختبرات مختلفة في جميع أنحاء العالم، يقتصر استخدامه في المقام الأول على مختبرات ذات خبرة هندسية3,4,5,6,7,8,9.
NIH-ImageJ هي واحدة من الأدوات المفتوحة المصدر الأكثر شعبية بين الباحثين بيولوجيا الخلية10. وكانت التطورات المجتمعية التي يحركها مجتمع المستخدمين أساسية لشعبيته11,12. يحتوي ImageJ على ميزات تسمح للمستخدمين بتطوير التطبيقات بمزيج من لغة برمجة متقدمة ونهج برمجة مبسطة. تسهل هذه الميزات على المستخدمين الذين لديهم معرفة برمجية أساسية تنفيذ أي مساهمة جديدة في البرنامج وتكييفها وتقديمها. بناء على هذه الصفات من NIH-ImageJ، قمنا بتطوير مجموعة أدوات تكاملية لتحليل الإشارات الخلوية (iTACS)، والتي تمكن من التكامل منخفض التكلفة من الأجهزة والأدوات البرمجية المطلوبة لأتمتة قياس مجموعة واسعة من الإشارات الكيميائية والميكايكية عبر الخلايا الملتصقة11،12.
iTACS يتكون من عنصرين : اقتناء والتدريب وحدة (AcTrM) والتحليل والتصور وحدة (AnViM). تم بناء AcTrM على μManager – وهو تطبيق الحصول على الصور المستندة إلى NIH-ImageJ – لتمكين المستخدمين من إعداد قياسات الفاصل الزمني للخصائص البصرية التقليدية ومجموعة متنوعة من الخصائص الفيزيائية للخلايا الملتصقة في عينات متعددة12. AcTrM يسهل تدريب المستخدم من خلال توجيهات موجزة المدرجة في واجهة رسومية. وبالإضافة إلى ذلك، لديها ميزة جديدة من التركيز التلقائي القائم على الصورة المرجعية التي تهدف إلى تسهيل القياسات في الوقت الحقيقي للقوى المادية وتمكين توحيد جودة البيانات المكتسبة.
تم بناء AnViM على الإضافات ImageJ ، والبرمجيات المعجلة ، ومخطوطات التعامل مع الملفات التي تمكن المستخدمين من تقييم أكثر من 50 خاصية كميا ، بما في ذلك الشكل الخلوي والحجم والتوجه والسرعة واتجاه الحركة ، والجر المبذول على المصفوفة خارج الخلية (ECM) ، وعلى الخلايا المجاورة ، لحظات الانكماش والقص لكل من الخلايا الفردية الملتصقة والمنطقة المجاورة لها. يسهل AnViM المستخدمين لتحديد الخصائص الفيزيائية الخلوية دون إتقان الخلفية التقنية الأساسية11. وعلاوة على ذلك، فإنه يتيح تحليل البيانات في وضع معالجة تفاعلية أو دفعية. فهو يولد خرائط حرارية تكشف عن الاختلاف المكاني والرسوم البيانية التي تبين الاختلاف الزمني لخصائص الخلايا الفردية.
في تجربة نموذجية ، يقوم المستخدم بزراعة الخلايا على هيدروجيل مرن مع بروتينات مصفوفة خارج الخلية المناسبة على السطح العلوي ونوعين من علامات الفلورسنت المضمنة. أساسا، صور هذه العلامات الفلورية قبل وبعد زراعة الخلايا كافية لتحديد القوى داخل وحول الخلايا الفردية2،13. تقوم AnViM بتعيين هذه النتائج على خلايا فردية من الكتلة المنضمة وتولد صورا ورسوما بيانية ثاقبة.
Protocol
ملاحظة: العينات التي تم فحصها باستخدام النظام الأساسي iTACS هي خلايا ملتصقة بركيزة ناعمة. وينقسم بروتوكول تقييم الإشارات الميكانيكية والكيميائية إلى جزأين متتابعين: وحدة الاقتناء والتدريب (AcTrM) ووحدة التحليل والتصور (AnViM). 1. اقتناء والتدريب وحدة (AcTrM) ملاحظة: يقوم AcTrM بأتمتة عملية الحصول على البيانات والتدريب الذاتي للمستخدم. قبل أي الحصول على البيانات، وإعداد ركيزة لينة قادرة على توفير المعلومات اللازمة لتحديد القوى التي تمارس الخلايا على ذلك. إعداد هيدروجيلملاحظة: الهدف هنا هو إعداد معامل القص 1,250 السلطة الفلسطينية, سمك 100 ميكرومتر تقريبا, وقطرها 22 مم البولي أكريلاميد (PAA) هيدروجيل. إعداد محلول البولي أكريلاميد باتباع طريقة يونغ وآخرون ويلقي hydrogels التالية الخطوات التي وصفها تريبات وآخرون.14,15. استثناء واحد لهذا الإجراء هو أن الخرز جزءا لا يتجزأ مباشرة تحت الخلايا هي 0.5 ميكرومتر في القطر وتنبعث منها مضان أصفر. تخطي خطوة إرفاق حبات 2 ميكرومتر إلى coverglass إذا كان من المتوقع أن منطقة العرض أن يكون منطقة خالية من الخلايا كبيرة.ملاحظة: بروتوكول إعداد هيدروجيل هو الآن راسخة إلى حد ما في الميدان16. في جميع أنحاء الوصف اللاحق ، يشار إلى حبات 0.5 ميكرومتر باسم “الخرز العلوي” ، ويشار إلى حبات 2 ميكرومتر باسم “الخرز السفلي”. ومع ذلك، الخرز السفلي اختياري حيث تحتوي المنطقة المصورة على منطقة كبيرة خالية من الخلايا. نمط حبة العلوي من مثل هذه المنطقة الخالية من الخلايا سوف تخدم الغرض من نمط حبة أسفل. جبل الهيدروجيل مع حبات الفلورسنت جزءا لا يتجزأ على مرحلة المجهر. السماح 15-20 دقيقة لدرجة حرارة لوحة لتحقيق حالة ثابتة.ملاحظة: يعمل السطح العلوي للوح ببروتينات مصفوفة خارج الخلية، ولكن الخلايا لم تزرع بعد على الهيدروجيل. اكتساب صورة مرجعية الجزء الأول: إنشاء قائمة مواقعملاحظة: يتضمن الإدخال اليدوي في هذه الخطوة التالية مطالبات AcTrM لاختيار المواقع مع توزيع أفضل حبة. لا توجد ملفات تم إنشاؤها مسبقا مستخدمة في هذه الخطوة. تتضمن المجلدات الجديدة الرئيسية التي تم إنتاجها في هذه الخطوة مجلدات ‘t0imgs’ و ‘tnimgs’ و ‘textfiles’، ويتضمن الملف المنتج ملف قائمة المواضع. راجع الشكل 2 للحصول على الوصف المرئي للخطوات التالية التي توجه إنشاء قائمة موضع باستخدام AcTrM. المثال المعروض يكتسب البيانات عند تكبير 20x. بدء μManager 2.0 — بيتا. تشغيل AcTrM بالنقر فوق الزر AcTrM.bsh في إطار موارد IMBL . في النافذة بعنوان تعريف خصائص الاستحواذ ، حدد الهدف المناسب ، والتسامح مع دقة الموقف الجانبي (أي XY) الاسترداد ، وحجم خطوة من الخام والمكرر إعادة التركيز (أي ض) العملية ، وقيمة مقبولة معامل ارتباط الصورة لاستعادة التركيز.ملاحظة: التسامح الدقيق لاسترداد الموضع الجانبي سيؤدي إلى إبطاء استرداد الموضع، ولكن التسامح الكبير سيحتاج إلى تصحيح الموضع أثناء تحليل البيانات وقد يسبب صعوبة في استرداد التركيز. وهناك خطوة أصغر حجم إبطاء عملية إعادة التركيز، ولكن حجم خطوة عالية جدا قد يسبب حركة سريعة مع فرص لتفويت التركيز. في إطار AcTrM – الخطوة 0 ، حدد اكتساب جديد لإنشاء قائمة موضع.ملاحظة: الإطار بعنوان AcTrM – الخطوة 1 يسرد كافة الخطوات التالية الرئيسية. تتضمن هذه الخطوات تحريك المرحلة وضبط التركيز والنقر على الأزرار الموجودة في μManager. هذه الخطوات دليل في بناء قائمة من المواقف المناسبة للحصول على البيانات. انقر على لايف في Micromanager لتصور عينات للتعديلات اليدوية المدرجة في إطار AcTrM — الخطوة 1 . اتبع الخطوات المذكورة في هذه النافذة. الآن الحصول على صورة الخرز. حدد القناة المناسبة للخرزات العلوية. تأكد من إلقاء نظرة على الخرز السفلي كذلك. للقيام بذلك، حدد قنوات الخرز السفلي. وينظر إلى صورة ضبابية من الخرز السفلي.ملاحظة: يمكن تبديل القنوات من القائمة المنسدلة المعينة مسبقا على النافذة الرئيسية μManager. إذا تم استخدام الخرز السفلي في التجربة، فتأكد من وجودها في الموضع المحدد. هذه الخرزات سوف تبدو ضبابية. عند اختيار الموضع المناسب، انقر على علامة في إطار قائمة موضع المرحلة لحفظ الموضع.ملاحظة: يتم تعريف أفضل موضع بتوزيع كثيف وموحد للخرزات العلوية المضمنة مباشرة تحت السطح العلوي (أي الخرز العلوي) وخرزتين على الأقل متصلتين بزجاج الغطاء (أي الخرز السفلي) (الشكل التكميلي S1). يكون استرداد التركيز أسرع إذا ظهرت الخرز السفلي كحلقات كبيرة خارج التركيز. ومع ذلك، إذا تم إجراء التجارب في موضع واحد دون الحاجة إلى التركيز أو استرداد الموضع الجانبي، تجاهل الإرشادات المتعلقة بصورة الخرز السفلي. اتبع الخطوات 6-9 الموضحة في الشكل 2 لتضمين وظائف إضافية في القائمة.ملاحظة: اختر بعض المواضع الإضافية بحيث يمكن لجولة من الاستبعاد أن تسمح بأفضل المواضع المختارة على اللوحة. الجزء الثاني: اقتناء الصور المرجعيةملاحظة: لا تتضمن هذه الخطوة أي إدخال يدوي. تتضمن الملفات الرئيسية التي تم إنشاؤها مسبقا المستخدمة في هذه الخطوة ‘textfiles/*.pos’. تتضمن الملفات والمجلدات الجديدة الرئيسية التي تم إنتاجها في هذه الخطوة تلك الموجودة ضمن مجلدات ‘t0imgs’ و ‘tnimgs’. انظر الشكل 3 والشكل التكميلي S2 للاطلاع على الوصف المرئي للخطوات التالية التي توجه اقتناء الصور المرجعية باستخدام AcTrM. إطار AcTrM – الخطوة 2 يسرد أيضا كافة الخطوات الرئيسية. اتباع الخطوات المذكورة في إطار AcTrM – الخطوة 2 ، قم بإجراء الخيارات في إطار “اكتساب متعدد الأبعاد “. على سبيل المثال، لتنفيذ الفاصل الزمني الطويل، تشير إلى عدد من الصور التي سيتم التقاطها، حدد القناة الأولى كقناة المرحلة، ثم حدد التالي للخرزات العلوية والآخر بعد ذلك هو للخرزات السفلية. انقر على إغلاق في إطار اكتساب متعدد الأبعاد ، ومن ثم انقر فوق موافق في إطار ActrM – الخطوة 2 . في إطار AcTrM – الخطوة 3، اختر إشراك استرداد موضع XYZ المستند إلى صورة مرجعية. الخيار هو نعم عموما. ومع ذلك ، إذا تم الحصول على الصور في موقف واحد مع عدم وجود مجال للتركيز أو الانجراف المرحلة ، فإن الخيار في AcTrM — الخطوة 3 النافذة لا. في نافذة خيارات الاسترداد AcTrM – XYZ ، قم بتعيين القناة لاسترداد XYZ الخام ، سواء لأداء استرداد XYZ المكرر ، والمنطقة ، والقناة لاسترداد XYZ المكرر والاتجاه لبدء إعادة التركيز (الشكل التكميلي S4). عند الانتهاء، سوف AcTrM الحصول على الصور المرجعية.ملاحظة: ستكون الخيارات النموذجية للقناة قناة الخرز السفلي. XYZ الانتعاش يعمل بشكل أفضل عندما نفذت مع الصورة الكاملة في التنفيذ الحالي. عادة ما تتضمن الصور المرجعية صورة ضوئية مرسلة للهيدرجيل ، وصورة فلورية للخرزات العلوية ، وصورة فلورية للخرزات السفلية. قد يختلف محتوى كل مجموعة صور استنادا إلى الخيارات التي تم إجراؤها في إطار “اكتساب متعدد الأبعاد “. ومع ذلك، سوف يكتسب البرنامج مجموعة الصور المرجعية في كل موضع محدد في الشكل 2. في نهاية هذه الخطوة، يتم إنشاء ثلاثة مجلدات في الدليل المختار: ‘t0imgs’، ‘tnimgs’، و ‘textfiles’. يحتوي المجلد ‘t0imgs’ على صور مرجعية بالتنسيق الذي تم التعرف عليه بواسطة μManager واستخدامه في الخطوات اللاحقة؛ يحتوي مجلد ‘tnimgs’ على صور TIFF منفصلة مع أسماء ملفات ‘c0_p0_t0.tif’، و’c1_p0_t0.tif’، إلخ. هنا ، ‘ج’ لتقف على القناة ، ‘ع’ لتقف على الموقف ، و ‘ر’ تقف على الوقت. تتبع هذه الأحرف رقم القناة ورقم الموضع ورقم الإطار على التوالي. يحتوي المجلد ‘textfiles’ على قائمة المواضع بتنسيق XML وخيارات المستخدم لاكتساب الصورة واستعادة الموضع. زرع الخلايا ونموهاملاحظة: منصة iTACS لديها المرونة لاستيعاب بروتوكولات إعداد العينة المستخدمة في التقييم المختبري المشترك للسلوك الميكانيكي للخلايا الملتصقة ، بما في ذلك الخلايا المتفرقة ، الطبقة الأحادية الملتخمة بالكامل ، وتقيس تكوين الشبكة ، والخلايا الأحادية ذات الثقوب أو الفجوات الكبيرة. ثقافة الفئران الخلايا البطانية الأوعية الدموية الدقيقة الرئوية إلى التقاء في قارورة17،18. فصل الخلايا باستخدام التريبسين. إعادة ضغط الخلايا في وسط الثقافة التي تحتوي على 10٪ مصل البقر الجنين إلى تركيز 1 × 106 خلايا / مل. ضع قطرة 5 ميكرولتر من الخلايا المبنة على سطح هيدروجيل جاف جزئيا ووضعها في حاضنة ثقافة الخلية.ملاحظة: بعد يومين في وسط الثقافة التي تحتوي على مصل البقر الجنيني 10٪، تشكل الخلايا في تلك القطيرة جزيرة مزدحمة من الخلايا1. اكتساب تلقائي للصورة للتجربة المتبقيةملاحظة: يتضمن الإدخال اليدوي لهذه الخطوة التالية مطالبات AcTrM لاستئناف الحصول على الصورة. تتضمن الملفات التي تم إنشاؤها مسبقا والمستخدمة من قبل هذه الخطوة ملفات نصية/*.pos وملفات صور حبة أسفل في المجلد ‘t0imgs’. تتضمن الملفات الجديدة الرئيسية التي تم إنتاجها في هذه الخطوة ملفات قائمة المواضع المحدثة والصور “tnimgs/*_t*.tif”. تأكد من أن نظام التحكم البيئي المجهر يصل إلى ظروف مستقرة زراعة الأنسجة. قم بتركيب اللوحة التي تحتوي على خلايا مثقفة برفق على مرحلة المجهر. السماح 15-20 دقيقة لدرجة الحرارة والرطوبة لتحقيق الاستقرار.ملاحظة: راجع الشكل 4 للحصول على الوصف المرئي للخطوات التالية التي توجه الحصول على الصور للتجربة المتبقية باستخدام AcTrM. بدء μManager 2.0 — بيتا. تشغيل AcTrM بالنقر فوق الزر AcTrM.bsh في إطار موارد IMBL .ملاحظة: تجاهل الخيارات التي تم إجراؤها في إطار تعريف خصائص Acquisition ولكن استخدم الخيارات التي تم إجراؤها في الخطوة السابقة. في إطار AcTrM – الخطوة 0 ، حدد متابعة الحصول على متوقف مؤقتا. حدد التكبير والدليل المحدد في إطار “اكتساب متعدد الأبعاد” في الخطوة السابقة حيث تم حفظ مجلدات البيانات (‘t0imags’، ‘tnimgs’، و ‘textfiles’).ملاحظة: عنوان الإطار يرشد المستخدم لاختيار الدليل المناسب. في إطار تغيير موضع اللوحة ، حدد خيارات لإعادة وضع اللوحة (ثلاثة أوضاع غير كولينية) مع القناة المستخدمة لإعادة الموضع.ملاحظة: سيتم مشاهدة الصور المحفوظة في الكاميرا. إذا كانت الصور المتداخلة تعرض كصورة لون أحمر وأخضر وأسود، فاجري تعديلا يدويا. انقر على قبول للشروع في عملية الاستحواذ.ملاحظة: تتغلب هذه الخطوة على التحولات الطفيفة من عدم قابلية محاذاة اللوحة للإلغاء عند إعادة تركيب اللوحة على مرحلة المجهر. اتبع مطالبات AcTrM لتسريع المحاذاة في كل من المواضع الثلاثة من خلال عرض صورة مركبة للصورة المرجعية الموضحة باللون الأحمر (عادة من الخرز السفلي) والصورة التي يتم ملاحظتها حاليا من خلال الهدف الموضح باللون الأخضر. الحصول على الأخضر قريبة بما فيه الكفاية إلى الأحمر يترك أقل العمل للبرنامج. عندما يكون التداخل مثاليا، تظهر الصورة المركبة باللونين الأصفر والأسود. إغلاق بما فيه الكفاية هو عادة عندما تكون نفس الخرز السفلي مرئية في كل من الصور الحمراء والخضراء، وحلقات حمراء وخضراء المقابلة خارج التركيز تلمس بعضها البعض. بعد اكتمال إعادة وضع اللوحة ، يأخذ AcTrM المسرح إلى كل موضع محدد ويستعيد موضع XYZ من خلال مطابقة الصورة المرجعية مع ما يتم رؤيته حاليا من خلال الكاميرا. تتم مطابقة الموضع الجانبي الأول (XY) ثم يتم مطابقة التركيز (Z). ويتبع الانتعاش الخام من قبل الانتعاش المكرر من الموقف والتركيز. يتم عرض تحديثات الحالة الحالية للتجربة على الشاشة من خلال نافذة من أربعة أجزاء موضحة في الشكل التكميلي S3. يتم حفظ الصور المكتسبة في مجلد ‘tnimgs’ بعد ‘*_t1.tif’، ‘*_t2.tif’، مما يشير إلى عدد الوقت لمجموعة الصور. إذا كان استرداد XYZ يعرف موضع محدث، يتم إنشاء قائمة موضع جديد وحفظها في مجلد “textfiles”. 2. وحدة التحليل والتصور (AnViM) إعداد تحليل البيانات التلقائيملاحظة: يتضمن الإدخال اليدوي في هذه الخطوة تحديد موقع المجلد ‘tnimgs’. تتضمن الملفات الرئيسية التي تم إنشاؤها مسبقا المستخدمة في هذه الخطوة ‘tnimgs/*.tif’. تتضمن الملفات والمجلدات الجديدة الرئيسية التي تم إنتاجها في هذه الخطوة مجلد “التحليل” في نفس المجلد الأصل مثل ‘tnimgs’ والمجلدات لكل موضع ‘تحليل/p*’. ضمن كل “تحليل / ع *” ، وهذه الخطوة يخلق جديدة ‘* .tif’ ملفات الصور داخل ‘phs’ و ‘tny’ المجلدات. يتم اقتصاص هذه الصور وإزالة الانجراف صور الخلايا والخرز العلوي. وتشمل الملفات الأخرى التي تم إنشاؤها “تحليل / تحليلخيارات.txt” الذي يسرد خيارات التحليل، “تحليل / ع * / skipAnalysis.txt”، الذي يسرد الحالات التي يتم تخطي التحليل بسبب الانجراف موجودة من قبل كبيرة، و “تحليل / ع * / part_shift_values_pixel_degree.dat” الذي يسرد قيم الانجراف المقدرة. لا يغير AnViM البيانات الأولية في المجلد ‘tnimgs’. راجع الشكل 5 للحصول على الوصف المرئي للخطوات التالية التي توجه إعداد تحليل البيانات التلقائي باستخدام AnViM. بدء تشغيل برنامج فيجي وحدد الخيار الأول في القائمة المنسدلة MSM المسمى MSM – المعالجة المسبقة. باستخدام مربع حوار مستعرض الملف، حدد المجلد الذي يحتوي على مجلد ‘tnimgs’، الذي يحتوي على البيانات التي تم تحليلها. حدد القناة للصور. باتباع الإرشادات الواردة من الشكل التكميلي S5، حدد أرقام قنوات الصورة الضوئية المرسلة للخلايا (صورة تباين المرحلة للخلايا)، وصورة الخرز السفلي وصورة الخرز العلوي. عادة ما يتم التحقق من خانات الاختيار الثلاثة التالية (‘نقل الملفات إلى مجلد الموضع’، و’إجراء تصحيح إضافي للحركة الصارمة’، و’قص البيانات وحفظها في مجلد الموضع’). وأخيرا، حدد التسامح لرفض البيانات المنجرفة بشكل كبير وحجم البكسل وجوانب الصورة التي تعبرها الخلايا. الاستجابة للمطالبة لتعزيز سطوع وعلى النقيض من الصور حبة أسفل حتى الخرز تظهر بشكل بارز. ضبط هذا باستخدام شريط التمرير في القائمة وانقر على موافق. الآن إجراء تصحيح الموقف للتخلص من التحولات، إن وجدت. بمجرد الانتهاء، يتم إنشاء مجلد تحليل.ملاحظة: لا يحتاج تحسين التباين عادة، ولكن هذا الحكم متاح للتجارب حيث يجب تقليل التعرض لأشعة الليزر. بعد هذا الاختيار، AnViM نسخ الملفات من المجلد ‘tnimgs’ إلى مجلد ‘تحليل’. يتم حفظ الملفات المقابلة لكل موقف في المجلدات ‘تحليل / p0 ، تحليل / p1 ‘ ، الخ. داخل كل من هذه المجلدات موقف، AnViM يجعل ‘cels’، ‘defs’، و ‘المرجع’ المجلدات التي تحتوي على صورة الضوء المرسلة الأصلي، صور الخرز العلوي، والصور الخرز السفلي، على التوالي (الشكل التكميلي S6). ثم يقوم AnViM بتحليل الحركة الجامدة في صور الخرز السفلي ويخلق مجلدا “phs” يحتوي على صورة ضوء مصححة من الخلايا ومجلد “tny” يحتوي على صور حبات علوية محدثة. وأخيرا، يتم حفظ خيارات المستخدم للقنوات والعمليات والتسامح وحجم البكسل وعبور الحدود في ملف “analysisChoices.txt” (الشكل التكميلي S6). القياس الكمي لتشوه الهيدروجيل والموحدملاحظة: من المهم ملاحظة أن التحديد الكمي للحركة من سلسلة من الصور هو حقل سريع التطور19. يتم تحسين التكنولوجيا باستمرار للميزات ، بما في ذلك السرعة والدقة والميزات المحددة داخل الصور الخام ، وأنماط تشوه محددة. ومن ثم، فمن المرجح أن بعض المستخدمين قد يستخدمون نهجا مختلفا عن النهج المعروض هنا. الجزء الأول: تحديد كمية تشوه الهيدروجيلملاحظة: تتضمن الإدخالات اليدوية في هذه الخطوة تحديد دليل البيانات وتحديد دقة الشبكة. تتضمن الملفات التي تم إنشاؤها مسبقا في هذه الخطوة “p*/tny/*.tif”. وتشمل الملفات الجديدة الرئيسية المنتجة في هذا ‘ع * / النزوح / * _disp.dat’ الذي يسرد ناقلات التشريد من السطح العلوي للhyd hydrogel. انظر الشكل 6 للحصول على الوصف المرئي للخطوات التالية للمشاركة ، عبر AnViM ، وتحليل قياس الجسيمات صورة Velocimetry على الصور الخرز العلوي20. بدء تشغيل برنامج فيجي ومن القائمة المنسدلة MSM حدد MSM – تشوه الجيل. من هنا، حدد الخيار المناسب للتجربة. باستخدام مربع الحوار مستعرض الملف، حدد الدليل الأصل للمجلد ‘تحليل’ التي تحتوي على البيانات التي تم تحليلها. في إطار معلمات حساب تشوه الجيل ، حدد حجم الإطار المناسب عبر الارتباط ومستوى الضجيج والعتبة (الشكل التكميلي S7)20.ملاحظة: يتم حفظ النتائج في دليل “إزاحة” تم إنشاؤه حديثا داخل كل مجلد موضع “تحليل/p0، تحليل/p1″، إلخ. هذا هو المكان الذي يتم تخزين كافة ملفات الإخراج. الجزء 2: تحديد كمي لتشوه الطبقة الأحاديةملاحظة: تتضمن الإدخالات اليدوية في هذه الخطوة تحديد دليل البيانات وتحديد دقة الشبكة. تتضمن الملفات التي تم إنشاؤها مسبقا في هذه الخطوة “p*/tny/*.tif”. وتشمل الملفات الجديدة الرئيسية المنتجة في هذا ‘ع * / السرعة / * _vel.dat’ الذي يسرد ناقلات الحركة من الخلايا. انظر الشكل 7 للحصول على الوصف المرئي لخطوات المشاركة ، عبر AnViM ، وتحليل قياس الجسيمات صورة Velocimetry على الصور الخرز الأعلى20. الإجراء مشابه للإجراء المتبع لقياس تشوه الهيدروجيل ويختار MSM – الحركة الخلوية من القائمة المنسدلة MSM . يتم حفظ النتائج في دليل “السرعة” الذي تم إنشاؤه حديثا داخل كل مجلد موضعي “تحليل / p0” و “تحليل / p1” ، إلخ. تحديد كمي لخلايا ECM وخلايا الخلاياملاحظة: يتضمن الإدخال اليدوي في هذه الخطوة تحديد دليل البيانات، مما يشير إلى صلابة الهيدروجيل، والاستجابة لمطالبات تجزئة الكتلة الخلوية للكشف عن الخلايا من منطقة عدم وجود خلية. تتضمن الملفات الرئيسية التي تم إنشاؤها مسبقا المستخدمة في هذه الخطوة ‘p*/displacement/*_disp.dat’. وتشمل الملفات الجديدة الرئيسية المنتجة في هذه الخطوة: “ع */الجر/*_trac.dat”، الذي يسرد القوى التي تمارسها الخلايا على الهيدروجيل؛ و”p*/traction/*_trac.dat”، الذي يسرد القوى التي تمارسها الخلايا على الهيدروجيل؛ و “p*/traction/*_trac.dat”، الذي يسرد القوى التي تمارسها الخلايا على الهيدروجيل. ‘ع */الجر/*_domain.dat’، الذي يسرد موقع نقاط الشبكة التي تحتوي على خلايا؛ وإدخال الملفات ‘ع * / traction.in ، ع * / clusterInput .txt’ و ‘ع * / prestress.in’ أن تسجيل خيارات المستخدم لهذه الخطوة. وبعد التقييم الكمي الأول لقوى الخلية ECM وخلايا الخلية، تم تطوير عدة اختلافات في هذه التقنية 1,15. وتركز الاختلافات على حالات معينة من الركائز أو الخلايا أو الحالات التجريبية أو الأدوات العددية7,8,21,22. انظر الشكل 8 للحصول على الوصف البصري للمشاركة عبر AnViM ، ومجهر فورييه تحويل الجر ، وتحليل المجهر الإجهاد أحادي الطبقة على بيانات تشوه الهيدروجيل1،2،15. بدء تشغيل برنامج فيجي ومن القائمة المنسدلة MSM حدد MSM – الخلية ECM و الخلية-الخلية القوى (الخيار الثالث في القائمة المنسدلة). باستخدام مربع حوار مستعرض الملف، حدد الدليل الأصل لمجلد “التحليل” الذي يحتوي على مجلدي ‘tnimgs’ و’analysis’ اللتي تحتويان على بيانات محللة. انقر على تحديد. في إطار معلمات لحساب القوى الخلوية ، أدخل معامل القص، وسمك الهيدروجيل ومستوى الضوضاء المتوقع. حدد موافق. وهذا يتيح لها تنفيذ الجر عبر وظيفة MATLAB.ملاحظة: بعد هذه الإدخالات، AnViM يحسب قوات ECM الخلية. بعد ذلك، حدد ما إذا كانت الطبقة الأحادية التقاء. إذا كانت صورة الخلية بأكملها مغطاة بالخلايا، فإن الإجابة هي نعم. في هذه الحالة، سيتم حساب قوى الخلية عبر الإطار بأكمله. من ناحية أخرى، إذا كان جزء من الصورة لا تحتوي على خلايا، ثم الجواب هو لا. في هذه الحالة، اتبع مطالبات AnViM لتسهيل تجزئة منطقة الصورة التي تحتوي على خلايا. إذا كان الجواب لا، يدويا رسم مضلع حول الكائن غير الخلية عندما يطالب البرنامج للقيام بذلك، ومن ثم حدد أسلوب (طرق) مناسبة للتجزئة. سيطلب البرنامج لون (أسود أو أبيض) من الخلايا. تحقق من خيار ملء البقع تلقائيا في البرنامج وانقر على موافق.ملاحظة: سيتم تغطية الخطوات لتقسيم طبقة أحادية غير التقاء في الجزء الأول من ‘القسم 2.4. يتم تخزين قوات الخلية ECM في ملفات ‘*_trac.dat’ في دليل تم إنشاؤه حديثا ‘الجر’ داخل كل مجلد موقف، ويتم حفظ الإدخال إلى برنامج حساب قوة الخلية ECM في ملف ‘traction.in’ (الشكل التكميلي S8). يتم تخزين قوات الخلية في ملفات ‘*_prestress.dat’ في دليل تم إنشاؤه حديثا ‘prestress’ داخل كل مجلد موضع، ويتم حفظ الإدخال إلى برنامج حساب قوة الخلية في الملف ‘prestress.in’ (الشكل التكميلي S9). تعيين قيم نقطة الشبكة على خلايا فرديةملاحظة: من المحاور الحالية ل iTACS إدخال نهج مباشر لتفسير الإشارات الميكانيكية المقاسة في الميدان. هذا النهج مفيد لدراسة التفاعلات الميكانيكية بين الخلايا المجاورة للكتلة18. وبشكل عام، فإن الخصائص التي تم قياسها كميا حتى الآن موجودة على نقاط الشبكة المتباعدة بانتظام عبر الكتلة الخلوية. تحدد هذه البيانات الانحراف المتوسط والمتوسط والمعياري لخصائص مختارة داخل الحدود المورفولوجية للخلايا الفردية وتحدد تلك الخصائص أو الإشارات كخصائص/إشارات فيزيائية خلوية. من هذه، يتم استخدام الانحراف المعياري للإشارة إلى التباين، ويتم استخدام الفرق بين الوسط والوسيط للإشارة إلى طبيعة التوزيع، ويتم استخدام القيمة الوسيطة للإشارة إلى الحالة الإجمالية للخلايا للخصائص المحددة.الجزء الأول: تقسيم منطقة الصورة التي تحتوي على خلاياملاحظة: يتضمن الإدخال اليدوي إلى هذه الخطوة تعريف دليل البيانات والاستجابة إلى مطالبات التجزئة للكشف عن الخلايا من منطقة لا توجد خلية. تتضمن الملفات الرئيسية التي تم إنشاؤها مسبقا المستخدمة في هذه الخطوة “p*/phs/*.tif”. تتضمن الملفات الجديدة الرئيسية التي تم إنتاجها في هذه الخطوة “p*/phs/bwImages/*.tif” وهي صور ثنائية تفصل مناطق الخلايا عن المناطق غير الخلية، و”p*/phs/textResults/frameNum_percentHealed.txt”، والتي تسرد مساحة الصورة المئوية التي تغطيها الخلايا في كل حالة، و”p*/clusterInput.txt”، والتي تسجل خيارات المستخدمين التي تم إدخالها في واجهة AcTrM. راجع الشكل 9 للحصول على الوصف المرئي للخطوات التالية لتقسيم منطقة الصورة التي تحتوي على خلايا. يجب إكمال هذا الجزء قبل حساب قوات الخلية الخلية. وفي هذه الحالة، لا يلزم تكرار هذه الخطوات. أيضا، إذا تم إجراء هذه الخطوات قبل حسابات قوة الخلية الخلية، لا يتم طلبها في بداية حسابات القوة. بدء تشغيل برنامج فيجي ومن القائمة المنسدلة MSM حدد تجزئة – الكتلة الخلوية. باستخدام مربع حوار مستعرض الملف، حدد دليل الموضع “تحليل/p0″، و”تحليل/p1″، وما إلى ذلك، الذي يحتوي على خصائص محددة كميا على نقاط الشبكة المتباعدة بانتظام. الإشارة إلى ما إذا كان أحادي الطبقة التقاء.ملاحظة: يتم استدعاء الخطوات أدناه فقط عندما لا يكون أحادي الطبقة التقاء. اتبع مطالبات AnViM لتطبيق نهج متعدد الجوانب الجديد لتحديد مناطق الصور التي تحتوي على خلايا. وتنطوي العملية على أربع طرق – كل منها يقترب من التقسيم بطريقة مختلفة. واحد أو عدة من هذه الأساليب المستخدمة في تركيبة تغطي مجموعة واسعة من الصور من الخلايا. لذلك، حاول أساليب مختلفة للعثور على التركيبة التي تعمل بشكل أفضل لبياناتها. ضبط ‘عامل اتصال المجال’ و ‘عامل تشويه’ للحصول على تجزئة الأمثل.ملاحظة: يجعل ‘عامل Smear’ المناطق التي تحتوي على خلايا أكبر. الإشارة إلى ما إذا كانت الخلايا تظهر باللون الأسود أو الأبيض في الصورة الثنائية. في الاتجاهات لتنظيف إطار صورة الحدود ، اختر ما إذا كنت تريد تنظيف الصورة تلقائيا أو يدويا.ملاحظة: الميزات غير المرغوب فيها من الصور هي بقع سوداء على بكسل المحتلة من قبل الخلايا والبقع البيضاء على بكسل قطع اتصال من كتلة الخلية ليتم تحليلها. ولا يمكن إجراء التحليل إلا في المناطق المتصلة. لذلك يجب تحليل مناطق متعددة منفصلة. الجزء الثاني: تجزئة الخلايا الفردية في الصورملاحظة: تتضمن الإدخالات اليدوية لهذه الخطوة تحديد دليل البيانات والاستجابة لمطالبات التجزئة للكشف عن الخلايا الفردية داخل الصورة. تتضمن الملفات الرئيسية التي تم إنشاؤها مسبقا والمستخدمة في هذه الخطوة “p*/phs/*.tif” و”p*/phs/bwImages/*.tif”. وتشمل الملفات الجديدة الرئيسية المنتجة ‘ع * / phs / textResults / * .csv’ ، والتي تحتوي على خصائص مورفولوجية الخلوية. راجع الشكل 10 للحصول على الوصف المرئي للخطوات التالية لتقسيم الخلايا الفردية من طبقة أحادية. بدء تشغيل برنامج فيجي ومن القائمة المنسدلة MSM حدد تجزئة – الخلايا الفردية. باستخدام مربع حوار مستعرض الملف، حدد دليل الموضع “تحليل/p0″، و”تحليل/p1″، وما إلى ذلك، الذي يحتوي على خصائص محددة كميا على نقاط الشبكة المتباعدة بانتظام. في إطار اختيار معلمات الإدخال ، قم بالإشارة إلى الحد الأقصى لنسبة العرض إلى الارتفاع، وبروز مقدار ما يبرز مركز الخلية مقارنة بحد الخلية، ومعلمتين غير واضحتين لتوجيه الكشف عن الخلايا (الشكل التكميلي S10). على مكدس الصور لكل موضع، ارسم مضلعا على أصغر خلية عادية. يتم استخدام هذا لحساب المنطقة. أي شيء أصغر من هذا لن يعتبر خلية من قبل البرنامج. رسم مضلع حول أكبر خلية عادية ثم قم بالإشارة إلى ما إذا كان مركز الخلية أو واجهة الخلية أكثر إشراقا.ملاحظة: AnViM ثم بإنشاء ملفات ‘phs/textResults/0001.csv’، ‘phs/textResults/0002.csv’، إلخ، لكل إطار يحتوي على معلومات عن الخلايا داخل هذا الإطار. في هذه المرحلة، يتضمن هذا الملف معلومات مورفولوجية حول الخلايا، بما في ذلك المنطقة، والقنطور، والمحيط، والتوجه، والتعميم، ونسبة الارتفاع، والتقريب، والصلبة، والمسافة من المنطقة بدون خلايا. وحدة الطول في هذه الخصائص هي بكسل، والزاوية بالدرجات. وأخيرا، يتم تحديث هذا الملف لاحتواء كثافة بكسل الخلوية والحركة والقوى في الخطوات اللاحقة. الجزء 3: تعيين كثافة البكسل على الخلاياملاحظة: تتضمن الإدخالات اليدوية في هذه الخطوة تحديد دليل البيانات وتحديد خصائص التعيين والمعلمات. تتضمن الملفات الرئيسية التي تم إنشاؤها مسبقا والمستخدمة في هذه الخطوة “p*/phs/*.tif” (أو “p*/fluo/*.tif”) و”p*/phs/bwImages/*.tif”. تتضمن الملفات الجديدة الرئيسية المنتجة في هذه الخطوة “p*/phs/textResults/*.csv”، والتي تسرد الخصائص المورفولوجية الخلوية. راجع الشكل 11 للحصول على الوصف المرئي للخطوات التالية لتقييم كثافة البكسل في المنطقة التي تشملها الخلايا الفردية والمنطقة المجاورة لها وتعريفها كخصائص للخلايا. بدء تشغيل برنامج فيجي ومن القائمة المنسدلة MSM حدد خريطة على خلايا – Intensities. باستخدام مربع حوار مستعرض الملف، حدد دليل الموضع “تحليل/p0″، و”تحليل/p1″، وما إلى ذلك، الذي يحتوي على خصائص محددة كميا على نقاط الشبكة المتباعدة بانتظام. حدد الكشف عن انقسام الخلية أو تحديد الفلورسينس الخلوي عندما يطلب منه البرنامج. تحديد حجم المنطقة المجاورة. تحقق من كل من تجميع خصائص المنطقة المجاورة و تجميع خصائص مربعات الخلايا. انقر على موافق. في إطار الغرض من تسجيل الكثافة الخلوية، حدد نوع الصورة التي سيتم استخدامها لرسم خرائط الكثافة، وحجم المنطقة المجاورة، وما إذا كان يتم جمع البيانات للخلايا الفردية أو كل من الخلايا والمناطق المجاورة لها (الشكل التكميلي S11).ملاحظة: تعيين كثافة بكسل صورة التباين المرحلي يسمح الكشف عن أحداث تقسيم الخلية. رسم خرائط كثافة الصورة الفلورية سيمكن من الكشف عن التقلبات في جزيئات السيتوبلازمية الموسومة بالفلورسنت. إخراج الخطوات أعلاه هو متوسط متوسط، متوسط الانحراف المعياري، الحد الأدنى، والحد الأقصى لقيم كثافة بكسل للخلايا الفردية. يتم إدخال هذه الأرقام كأعمدة جديدة في الملفات ‘phs/textResults/0001.csv’، ‘phs/textResults/0002.csv’، إلخ. الجزء 4: رسم خرائط للقوى والحركة على الخلاياملاحظة: تتضمن الإدخالات اليدوية لهذه الخطوة تحديد دليل البيانات وتحديد خصائص التعيين والمعلمات. تتضمن الملفات الرئيسية التي تم إنشاؤها مسبقا والمستخدمة في هذه الخطوة “p*/phs/textResults/*.csv”، و”p*/velocity/*_vel.dat”، و”p*/displacement/*_disp.dat”، و”p*/traction/*_trac.dat”، و”p*/prestress/*_prestress.dat”، و”p*/phs/bwImages/*.tif”.” يتم إنشاء أية ملفات جديدة أثناء هذه الخطوة. بدلا من ذلك، يتم إضافة المعلومات الجديدة (قوة الخلوية وخصائص الحركة) إلى الملفات ‘ع * / phs / textResults / * .csv ‘. انظر الشكل 12 للاطلاع على الوصف البصري للخطوات اللازمة لتقييم القوى والحركة في المنطقة التي تشملها الخلايا الفردية والمنطقة المجاورة لها وتعريفها على أنها خصائص الخلايا. اختر من القائمة المنسدلة MSM خريطة على الخلايا – الحركة / قوة البيانات (الشكل التكميلي S12). ثم اتبع الخطوات المذكورة في الخطوة 2.4.3.ملاحظة: يتم إضافة أعمدة جديدة إلى الملفات ‘phs/textResults/0001.csv’, ‘phs/textResults/0002.csv’، وما إلى ذلك، وتشمل متوسط ومتوسط الانحراف المعياري للسرعة، واتجاه السرعة، ومتوسط التوتر الهيكل الخلوي، وتوتر أنيسوتروبي، والطاقة الإجهادية في الهيدروجيل، واتجاه أعلى توتر، وحجم الجر الخلوي ECM (الشكل التكميلي S13). تصور النتائج الجزء الأول: تتبع الهويات الخلوية عبر التجربةملاحظة: تتضمن الإدخالات اليدوية لهذه الخطوة تحديد دليل البيانات وتحديد الخصائص المعينة لتصور. تتضمن الملفات الرئيسية التي تم إنشاؤها مسبقا المستخدمة في هذه الخطوة ‘p*/phs/textResults/*.csv’. تتضمن الملفات الجديدة الرئيسية التي تم إنتاجها خلال هذه الخطوة “p*/phs/textResults/cellTimeTrace_*.csv”، والتي تحتوي على تتبع زمني للبيانات الخلوية. راجع الشكل 13 للحصول على الوصف المرئي للخطوات التالية لتعقب خصائص الخلايا الفردية طوال مدة التجربة. بدء تشغيل برنامج فيجي ومن القائمة المنسدلة MSM حدد النتائج – تعقب البيانات. باستخدام مربع حوار مستعرض الملف، حدد دليل الموضع “تحليل/p0″، و”تحليل/p1″، وما إلى ذلك، يحتوي على خصائص خلوية ليتم تعقبها. عند الانتهاء انقر على حدد. في إطار اختيار نقطة البداية للتتبع ، اختر إطار البدء للرصد، وعدد الإطارات التي يتم تعقبها في نفس الوقت (الشكل التكميلي S14). ابدأ دائما من الإطار رقم 2 حيث لا يمكن تحديد السرعة للإطار رقم 1. عند الانتهاء، انقر فوق موافق. في إطار التحقق من المتغيرات إلى جعل المسارات اختر المتغيرات إما بكتابة أسماء المتغيرات أو تحديد الشروط من خانات الاختيار (الشكل التكميلي S15). ثم انقر فوق موافق.ملاحظة: تعقب بإنشاء ملفات ‘phs/textResults/cellTimeTrace_*.csv’ مع كل عمود يحتوي على رقم خلية فريدة وكل صف متتالي يمثل مثيل الوقت المتتالية. الجزء 2: توليد المسارات الزمنية للخصائص الخلوية التي تم تقييمهاملاحظة: تتضمن الإدخالات اليدوية لهذه الخطوة تحديد دليل البيانات وتحديد الخصائص المعينة لتصور. تتضمن الملفات الرئيسية التي تم إنشاؤها مسبقا المستخدمة في هذه الخطوة ‘p*/phs/textResults/cellTimeTrace_*.csv’. وتشمل الملفات الجديدة الرئيسية التي تم إنتاجها خلال هذه الخطوة “p*/phs/trackedDataPlots/*.tif”، والتي تحتوي على مؤامرات المسار الزمني و “p*/phs/trackedDataPlots/*.csv”، والتي تحتوي على بيانات الرسم. انظر الشكل 14 للاطلاع على الوصف المرئي للخطوات التالية لإنشاء مسارات زمنية للخصائص الخلوية التي تم تقييمها. بدء تشغيل برنامج فيجي ومن القائمة المنسدلة MSM حدد النتائج – رسم. باستخدام مربع حوار مستعرض الملف، حدد دليل الموضع “تحليل/p0″، و”تحليل/p1″، وما إلى ذلك، يحتوي على خصائص خلوية متعقبة ليتم رسمها. اختر ما إذا كنت تريد قصر الرسم على الخلايا ذات المسارات غير المنقطعة بالنقر فوق الزر نعم أو لا .ملاحظة: يتجاهل هذا الخيار الخلايا التي تعذر الكشف عنها في مثيل أو أكثر من الوقت. اختر عدد المتغيرات التي سيتم رسمها في وقت واحد وانقر على موافق.ملاحظة: حاليا، يسمح AnViM بحد أقصى ثلاثة متغيرات ليتم عرضها في نفس المخطط. اختر متغيرات فردية للتآمر باستخدام قائمة منسدلة.ملاحظة: هذه الخطوات إنشاء ملف تنسيق ملف صورة المعلمة (TIFF) وملف بيانات مفصولة بفاصلة داخل المجلد ‘phs/trackedDataPlots/’. يتكون اسم الملف من أسماء المتغيرات مفصولة بتسطير أسفل السطر وتنتهي برقم خلية. الجزء 3: توليد خرائط حرارية للخصائص الخلوية التي تم تقييمهاملاحظة: تتضمن الإدخالات اليدوية في هذه الخطوة تحديد دليل البيانات وتحديد الخصائص المعينة لتصور. تتضمن الملفات الرئيسية التي تم إنشاؤها مسبقا المستخدمة في هذه الخطوة ‘p*/phs/textResults/cellTimeTrace_*.csv’. تتضمن الملفات الجديدة الرئيسية التي تم إنشاؤها في هذه الخطوة “p*/phs/segmentedImages/cellPropMaps/*.tif”، وهي خرائط الحرارة للخصائص الخلوية. انظر الشكل 15 للاطلاع على الوصف البصري للخطوات اللازمة لتوليد خرائط حرارية للخصائص الخلوية التي تم تقييمها. اختر من القائمة المنسدلة MSM Results – صورة. اتبع الخطوات الموضحة في الخطوة 2.5.2.ملاحظة: يتم تخزين الإخراج كملفات TIFF في المجلد ‘phs/segmentedImages/cellPropMaps/’. أسماء الملفات هي رقم مثيل الوقت واسم المتغير مفصولة بتسطير أسفل السطر.
Representative Results
ونعرض هنا اثنين من النواتج الرئيسية للمثال الواضح. الإخراج الأول هو تتبع الوقت للسرعة الخلوية والتوتر الهيكل الخلوي للخلية رقم 1 (الشكل 16). يتم عرض الخصائص على محور عمودي مشترك لتسهيل الاقتران المرئي بين الخصائص، ويشير المحور الأفقي إلى رقم مثيل الوقت. في هذه التجربة، تم الحصول على إطارات متتالية على فاصل زمني 15 دقيقة. الإخراج الثاني هو مجموعة من الخرائط الحرارية 1 ساعة في التجربة (الشكل 17). وتشمل الخصائص المبينة هنا منطقة الانتشار، والتوجه، والتعميم، والسرعة، واتجاه الحركة، والتوجه الأقصى للتوتر، والتوتر الهيكل الخلوي، والجر الركيزة، وانزدروب التوتر للخلايا الفردية. الشكل 1: هيكل مجموعة الأدوات التكاملية لتحليل الإشارات الخلوية (iTACS). عنصرين رئيسيين من iTACS هي اقتناء والتدريب وحدة (AcTrM) وتحليل والتصور وحدة (AnViM). AcTrM يمكن استخدام تقنيات إعداد الهيدروجيل المختلفة الموجودة حاليا لإعداد الهيدروجيلات التي يمكن أن تعقد بحزم على مرحلة المجهر، أي بذر الخلايا، وبروتوكول النمو الذي يحتفظ الخلايا في مستوى واحد التنسيق. يمكن أن تستخدم AnViM تقنيات مختلفة لتحديد تشوه الهيدروجيل والحاد ، وقوات ECM الخلية ، وقوات خلايا الخلية. ويمكن استيعاب جميع هذه المكونات المفضلة لدى المستعملين في بروتوكول قياسات القوة في نظام iTACS، وقد تم تحديدها بصناديق متقطعة. المكونات المحددة مع صناديق صلبة هي مساهمات جديدة لتكنولوجيا قياس القوة الخلوية. التصور في AnViM يركز على القيمة المتوسطة وتقلب الخصائص عبر الخلايا الفردية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 2: الحصول على صورة مرجعية – الجزء 1. خطوات لإنشاء قائمة موضع باستخدام AcTrM. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 3: اقتناء الصور المرجعية – الجزء 2. خطوات للحصول على الصور المرجعية باستخدام AcTrM. وترد الآراء التفصيلية للخطوات 2 و4 و6 في الأرقام التكميلية S2 وS3 وS4 على التوالي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 4: اكتساب تلقائي للصورة للتجربة المتبقية. خطوات لاستئناف اكتساب الصورة لتقييم السلوك الخلوي باستخدام AcTrM. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 5: إعداد تحليل تلقائي للبيانات. خطوات لبدء تحليل الصور التلقائي باستخدام AnViM. يتعرف البرنامج على تنسيق الصورة المستخدمة من قبل AcTrM. 10 – وترد رؤية تفصيلية للفريقين في الخطوتين 3 و5 في الشكلين التكميليين S5 والشكل التكميلي S6 على التوالي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 6: تحديد كمية تشوه الهيدروجيل والحصان الأحادي – الجزء 1. خطوات لإشراك، عبر AnViM، وتنفيذ Velocimetry صورة الجسيمات من تسنغ، Q. وآخرون، PNAS (2012)20 لتحديد تشوه السطح العلوي من الهيدروجيل. يمكن للمستخدمين أيضا تنفيذ نهج أخرى داخل AnViM لقياس تشوه الهيدروجيل. 10 – وترد في الشكل التكميلي S7 رؤية تفصيلية للخطوة 3. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 7: تحديد كمية تشوه الهيدروجيل والحصان الأحادي – الجزء 2. خطوات للمشاركة، عبر AnViM، وتنفيذ Velocimetry صورة الجسيمات من تسنغ، Q. وآخرون، PNAS (2012)20 لتحديد الحركة المحلية للخلايا الفردية. يمكن للمستخدمين أيضا تنفيذ نهج أخرى ضمن AnViM لقياس الحركة الخلوية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 8: تحديد حجم الخلايا -ECM وخلايا الخلية. خطوات لإجراء تحليل الصورة للمشاركة، عن طريق AnViM، وتنفيذ المجهر فورييه تحويل الجر من تريبات وآخرون، فيزياء الطبيعة (2009)15 لتحديد القوى التي تمارسها الخلايا على الهيدروجيل، وتنفيذ المجهر الإجهاد أحادي الطبقة من تامبي وآخرون، مواد الطبيعة (2011)1 لتحديد القوى داخل الخلايا الفردية وبين الخلايا المجاورة. يمكن للمستخدمين أيضا تنفيذ نهج أخرى ضمن AnViM لتحديد حجم الخلية ECM وقوات خلايا الخلية. 10- وترد رؤية تفصيلية للخطوة 6 في الشكل التكميلي S8 والشكل التكميلي S9. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 9: تعيين قيم نقاط الشبكة على الخلايا الفردية – الجزء 1. خطوات لتقسيم مناطق الصورة التي تحتوي على خلايا باستخدام نهج جديد متعدد الجوانب. يمكن استخدام هذا النهج لتقسيم التباين المرحلي أو برايتفيلد أو الصور الفلورية للخلايا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 10: تعيين قيم نقاط الشبكة على الخلايا الفردية – الجزء 2. خطوات لتقسيم الخلايا الفردية من طبقة واحدة باستخدام نهج جديد متعدد الجوانب وضعت في AnViM. يمكن استخدام هذا النهج لتقسيم التباين المرحلي أو برايتفيلد أو الصور الفلورية للخلايا. 10 – وترد رؤية تفصيلية للخطوة 2 في الشكل التكميلي S10. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 11: تعيين قيم نقاط الشبكة على الخلايا الفردية – الجزء 3. خطوات لتقييم كثافة البكسل في المنطقة داخل الخلايا الفردية وداخل المنطقة المجاورة للخلايا الفردية باستخدام AnViM. وتشمل الكثافات التي تم تقييمها كثافة الضوء المنقول وشدة الفلورسينس. يرسم هذا الجزء خريطة للقيمة الوسيطة والانحراف المعياري لكثافة البكسل داخل الخلايا الفردية وداخل منطقة مجاورة من الخلايا الفردية. 10- وترد في الشكل التكميلي S11 رؤية تفصيلية للخطوة 2. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 12: تعيين قيم نقاط الشبكة على الخلايا الفردية – الجزء 4. خطوات لتقييم القوى وخصائص الحركة لنقاط الشبكة داخل الخلايا الفردية وداخل المنطقة المجاورة من الخلايا الفردية باستخدام AnViM. يرسم هذا الجزء خريطة للقيمة الوسيطة والانحراف المعياري للخصائص داخل الخلايا الفردية وداخل منطقة مجاورة من الخلايا الفردية. 10 – وترد رؤية تفصيلية للخطوتين 2 و 3 في الشكل التكميلي S12 والشكل التكميلي S13. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 13: تصور النتائج – الجزء 1. خطوات لتتبع خصائص الخلايا الفردية على مدى كامل مدة التجربة باستخدام AnViM. وترد رؤية تفصيلية للخطوتين 2 و3 في الشكل التكميلي S14 والشكل التكميلي S15. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 14: تصور النتائج – الجزء 2. خطوات لإنشاء آثار الوقت من الخصائص التي تم تقييمها باستخدام AnViM. لدى المستخدم خيار رسم ما يصل إلى ثلاثة خصائص في رسم بياني واحد. يتم إنشاء آثار الوقت إما لجميع الخلايا أو فقط لتلك الخلايا التي كان تتبع ناجحة عبر التجربة بأكملها. 10 – وترد رؤية تفصيلية للخطوة 5 في الشكل التكميلي S16 والشكل التكميلي S17. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 15: تصور النتائج – الجزء 3. خطوات لتوليد خرائط الحرارة من الخصائص التي تم تقييمها باستخدام AnViM. يتم إنشاء خرائط الحرارة لجميع الإطارات التالية لإطار البداية وجميع الخصائص المحددة. وترد رؤية تفصيلية للخطوة 3 في الشكل التكميلي S18. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 16: آثار الوقت لمعرف الخلية 1. اثنين من الخصائص المعروضة هي التوتر الخلوي الخلوي (“avgtenMedian”) والسرعة الخلوية (“speedMedian”). يتم قياس كل من التوتر الخلوي الخلوي والسرعة الخلوية كمتوسط القيمة عبر نقاط الشبكة داخل الخلايا. يتم رسم الخصائص اثنين على نفس المحور مع وحدات إجبارية لتصور العلاقات بين الخصائص التي تم تقييمها. يتم سرد أسماء متغيرات إضافية في الجدول التكميلي S1. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 17: خرائط الحرارة لخصائص الخلايا الفردية عبر طبقة أحادية تحليلها. يتم تلوين كل خلية مع القيمة الوسيطة للخاصية المشار إليها في اللوحة. وهكذا، يشير اللون الأحمر العميق إلى القيمة الخلوية القصوى في طيف الألوان، ويشير اللون الأزرق العميق إلى الحد الأدنى للقيمة الخلوية عبر الطبقة الأحادية التي تم تحليلها. وكما هو موضح في تامبي وآخرون، PLoS One (2013)2، فإن الخلايا الواقعة بالقرب من الحدود لها قوى ميكانيكية تتأثر بخصائص غير معروفة للخلايا خارج الصورة. ومن ثم يتم إنشاء خريطة الحرارة للخلايا البعيدة عن الحدود. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل S1: عينة من الصور من حبة الفلورسنت العلوي والسفلي. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف. الشكل S2: عرض تفصيلي للخطوة 2 من الشكل 3. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف. الشكل S3: عرض تفصيلي للخطوة 4 من الشكل 3. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف. الشكل S4 A: عرض تفصيلي للخطوة 6 من الشكل 3. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف. الشكل S5: عرض تفصيلي للخطوة 3 من الشكل 5. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف. الشكل S6: عرض تفصيلي للخطوة 5 من الشكل 5. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف. الشكل S7: عرض تفصيلي للخطوة 3 من الشكل 6. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف. الشكل S8: عرض تفصيلي لإخراج قوة الخلية -ECM للخطوة 6 من الشكل 8. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف. الشكل S9: عرض تفصيلي لإخراج قوة الخلية من الخطوة 6 من الشكل 8. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف. الشكل S10: عرض تفصيلي للخطوة 2 من الشكل 10. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف. الشكل S11: عرض تفصيلي للخطوة 2 من الشكل 11. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف. الشكل S12: عرض تفصيلي للخطوة 2 من الشكل 12. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف. الشكل S13: عرض تفصيلي لإخراج الخطوة 3 من الشكل 12. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف. الشكل S14: عرض تفصيلي للخطوة 2 في الشكل 13. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف. الشكل S15: عرض تفصيلي للخطوة 3 من الشكل 13. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف. الشكل S16: عرض تفصيلي لملفات البيانات التي تم إنشاؤها في الخطوة 5 من الشكل 14. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف. الشكل S17: عرض تفصيلي لمؤامرة تم إنشاؤها في الخطوة 5 من الشكل 14. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف. الشكل S18: عرض تفصيلي لخريطة الحرارة والملف الذي يحتوي على نطاق طيف الألوان المتولد في الخطوة 4 من الشكل 15. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف. الجدول S1: قائمة بخصائص مختارة تم تحديدها كميا بواسطة iTACS. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.
Discussion
تستخدم الخلايا الملتصقة إشارات ميكانيكية وكيميائية على حد سواء للبقاء والنمو والوظيفة. تعمل مجموعة واسعة من برامج المجهر على تحسين تجربة المستخدم في تقييم الإشارات الكيميائية من خلال التصوير القائم على الفلورسينس. ومع ذلك، ينطوي تقييم الإشارات الميكانيكية على قدرات غير متوفرة في برنامج المجهر القياسي. وعلاوة على ذلك، فإن تقييم الإشارات الميكانيكية يكون أكثر فعالية عندما يتم دمج الحصول على البيانات مع تحليل البيانات. كان عدم وجود منصة موحدة تلبي الاحتياجات الفريدة لتقييم الإشارات الميكانيكية فجوة تكنولوجية كبيرة في بيولوجيا الخلايا التجريبية. تم تصميم مجموعة الأدوات التكاملية لتحليل الإشارات الخلوية (iTACS) لسد هذه الفجوة. يزود المكونان من iTACS و AnViM و AcTrM المستخدمين بالقدرات اللازمة لتحديد الخصائص الخلوية لأربع فئات واسعة: القوى والحركة ومورفولوجيا والفلورسينس / السطوع. عبر هذه الفئات، iTACS قادرة حاليا على الكشف عن أكثر من 50 جوانب فريدة من الخلايا الملتصقة الفردية. وتشمل هذه الجوانب خصائص محددة لكل فئة واسعة، بما في ذلك قيمتها التمثيلية وتنوعها عبر الخلية (الجدول التكميلي S1). على سبيل المثال، داخل القوات، هناك قوى الشد عبر الهيكل الخلوي، anisotropy من هذا التوتر، واتجاه التوتر الأقصى، والإجهاد القص عبر واجهة الخلية-ECM التي لها تأثير عميق على سلوك الخلايا الملتصقة1،3،6.
نهج جديد لدراسة السلوك الميكانيكي للخلايا الفردية من طبقة واحدة
وتشارك الخلايا الفردية من monolayer في تبادل الإشارات ذات الطبيعة الكيميائية والميكاميكانية3. يتم إرسال هذين النوعين من الإشارات عبر الطبقة الأحادية الخلوية بطريقة مختلفة23. ومع ذلك، فإن المعرفة الميكانيكية لنقل الإشارات متخلفة عن معرفة انتقال الإشارات الكيميائية. وتتزامن هذه الفجوة المعرفية مع النقص المستمر في النهج البسيطة والبديهية لتقييم الإشارات الميكانيكية الخلوية. وقد تم تجهيز نهج رسم خرائط البيانات الجديد الموصوف هنا لسد هذه الفجوة. يكشف مثل هذا الرسم الخرائطي أن تقلب التوتر الخلوي الجوهري في المنطقة المجاورة للخلية بمثابة إشارات استرخاء وسوائل وترسيخ تنظم التغيرات في الشكل الخلوي والحجم وسرعة الخلية18. تظهر خرائط خصائص المناطق المجاورة أنماط “التقسيم الفرعي متعدد الخلايا” حيث تتعرض الخلايا داخل التقسيم الفرعي لبيئة دقيقة موحدة نسبيا وتتعرض الخلايا عند حدود التقسيم الفرعي لبيئة صغيرة غير متوافقة بشكل ملحوظ18.
إمكانية الوصول إلى تكنولوجيا قياس القوة
توجد مجموعة متنوعة من البروتوكولات لجعل هيدروجيلس PAA، وتحليل تشوه الهيدروجيل والحركة الخلوية، وتحديد كمية الخلية ECM وقوات الخلية1،2،7،8،9،13،14،15،18،20،21،24،25،26،27 28,29,30,31,32. ومع ذلك، لا تزال هذه التطورات بعيدة عن متناول مختبرات بيولوجيا الخلايا المشتركة وتقتصر على مختبرات ذات خبرة هندسية. ومن خلال أتمتة الجوانب التقنية لهذه النهج ودمجها في إطار منصة موحدة وسهلة الاستخدام، فإن الهدف من نظام iTACS هو جعل تقييم الإشارات الميكانيكية نشاطا روتينيا في البحوث التجريبية لبيولوجيا الخلايا والتعليم.
يسمح ImageJ للمستخدمين بتطوير التطبيقات باستخدام نهج تتطلب القليل من التدريب أو لا تتطلب أي تدريب على حده11. تم بناء iTACS إلى حد كبير باستخدام نهج البرمجة النصية البسيطة لتسهيل التنمية المستمرة التي تحركها المجتمعات المحلية. تتم برمجة الجزء الأكبر من AcTrM باستخدام نصوص BeanShell ، ويتم برمجة الجزء الأكبر من AnViM باستخدام وحدات ماكرو ImageJ. هذه البرامج النصية والتوجيهات لتنفيذ هذه القدرات على المجهر المستخدم متاحة من خلال GitHub (https://github.com/IntegrativeMechanobiologyLaboratory/iTACS).
توحيد جودة الصور المكتسبة
وعلى الرغم من أن التقنيات القائمة على الركيزة المرنة لقياس القوى الفيزيائية في الخلايا الملتصقة قد تم تطويرها وتنفيذها في مختبرات مختلفة، فإن البروتوكول لا يزال يفتقر إلى التوحيد القياسي. أحد المجالات التي تحتاج إلى توحيد أكثر هو نوعية الصور الخرز الأعلى المكتسبة (الشكل التكميلي S1). وتنشأ قضايا هامة من الانجراف في التركيز طوال التجربة. إن نهجنا الجديد القائم على إعادة التركيز القائم على المراجع يجعل مثل هذه العملية الموضوعية مركزة. تفرض المعلمات المحددة في الخطوة الأولى من AcTrM حدود الجودة الموضوعية الضرورية. ويمكن برمجة تدابير توحيد أخرى في الإصدارات المقبلة من نظام التحكم في المقاييس.
قابلية تطبيق iTACS على نطاق واسع
بالإضافة إلى تحديد جوانب عديدة من الخلايا الملتصقة، يسهل هيكل iTACS استخدامه لمختلف البروتوكولات والاحتياجات التجريبية. يسمح AcTrM بالتدريب الذاتي للمستخدم الموجه للبرامج. التصوير عالي السرعة المطلوب من قبل، على سبيل المثال، التقييم المتزامن لتقلبات الكالسيوم السيتوبلازمية محدود حاليا بسبب سرعة إعادة وضع وإعادة تركيز الأجهزة ويتم على أفضل وجه في موقع واحد في كل مرة. ومع ذلك ، فإن التنفيذ الحالي مجهز بشكل جيد للتصوير على المدى الطويل ، والتصوير المتقطع ، حيث لا يمكن الاحتفاظ بالعينة على مرحلة المجهر طوال مدة التجربة. وبما أن الصور المرجعية يتم الحصول عليها في بداية التجربة، فإن نظام iTACS يتيح التصوير في الوقت الحقيقي للإشارات الميكانيكية، مما يفتح آفاقا جديدة في تطبيقات فحص الأدوية. تسمح AnViM للمستخدمين بتقديم معلومات تقنية للغاية وفقا لشروط شخص عادي. وتشكل القدرة على تحديد مجموعة واسعة من الخصائص الخلوية وتتبعها طوال التجربة قدرات حاسمة مطلوبة لاكتشاف آليات اتصال جديدة بين الخلايا.
من أجل تطوير iTACS في المستقبل ، حددنا أربعة مجالات تركيز: (1) تعزيز سرعة الحصول على البيانات وتحليل البيانات ، (2) تنفيذ نهج لتقييم الإشارات الخلوية الجديدة13 ، (3) تطوير ورش العمل ووحدات التعليم حول تقييم الإشارات الخلوية المستندة إلى iTACS ، (4) تطوير حلول التشغيل الآلي منخفضة التكلفة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D.T.T. أشكر الموظفين التابعين لمركز بيولوجيا الرئة في جامعة جنوب ألاباما لتحفيز المناقشات حول احتياجات البحوث بيولوجيا الخلايا التجريبية. وكانت هذه المناقشات حاسمة في الشروع في تطوير نظام iTACS.
وقد دعم هذا العمل جزئيا بمنح من المعهد الوطني للصحة/المعهد الوطني لدم الرئة القلبية، P01 HL66299 وR37 HL60024 (ستيفنز)، R01-HL118334 (ألفاريز)، F32-HL144040-01 (شو)، ومن جامعة جنوب ألاباما من خلال صندوق أبراهام ميتشل لأبحاث السرطان (سينغ، بالانكي، تامبي)، منحة البحث والتطوير العلمي (تامبي)، كلية الشرف، وزميل أبحاث الصيف الجامعي (نغوين).
Materials
| Reagents and components used in prepare glass surface for hydrogel coating | |||
| (3-Aminopropyl)trimethoxysilane, 97% | Aldrich chemistry | 13822565 | |
| 2% Bis Solution | Bio-rad | 1610142 | |
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate,98% | Acros organics | 2530850 | |
| 40% Acrylamide Solution | Bio-rad | 1610140 | |
| Glass bottom 35 mm dish/ 6 or 12 or 24 well plates | MatTek or CellVis | ||
| Glutaraldehyde, EM Grade, 25% | Polysciences | 1909100 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-aldrich | 1002074706 | |
| Reagents and components used in preparing suitable hydrogel | |||
| 2% Bis Solution | Bio-rad | 1610142 | |
| 40% Acrylamide Solution | Bio-rad | 1610140 | |
| Ammonium Persulfate | Bio-rad | 1610700 | |
| Cover Slips | Electron Microscopy Sciences | 7222301 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (1M) | Gibco | 14190136 | |
| FluoSpheres carboxylate 0.2 um, yellow-green(505/515) | Invitrogen | F8811 | |
| FluoSpheres carboxylate 0.5 um, red(580/605) | Invitrogen | F8812 | |
| FluoSpheres carboxylate 2.0 um, red(580/605) | Invitrogen | F8826 | |
| Rain-X | |||
| TEMED | Bio-rad | 1610801 | |
| Reagents used in coating extracellular matrix on the hydrogel | |||
| Collagen Type I Rat Tail | Corning | 354236 | |
| HEPES(1M) | Gibco | 15630080 | |
| Phosphate Buffered Saline (1M) | Gibco | 10010023 | |
| Sulfo-SANPAH | CovaChem | 102568434 | |
| Microscope hardware used in the current study | |||
| Camera | Hamamatsu Flash 4.0 LT sCMOS Camera | C11440-42U | |
| H117 ProScanTM Stages | Prior Scientific | ||
| Light source- Lambda DG4 and Lambda DG5 | Sutter instrument company | ||
| Microscope | Nikon eclipse TE2000-S | 550372 | |
| ProScan III Universal Microscope Automation Controller | Prior Scientific | ||
| Stagetop incubator | ibidi | 11922 | |
| Stepper Motor Focus Drive | Prior Scientific |
References
- Tambe, D. T., et al. Collective cell guidance by cooperative intercellular forces. Nature Materials. 10 (6), 469-475 (2011).
- Tambe, D. T., et al. Monolayer stress microscopy: limitations, artifacts, and accuracy of recovered intercellular stresses. PloS One. 8 (2), 55172 (2013).
- Das, T., et al. A molecular mechanotransduction pathway regulates collective migration of epithelial cells. Nature Cell Biology. 17 (3), 276-287 (2015).
- Vedula, S. R., et al. Mechanics of epithelial closure over non-adherent environments. Nature Communications. 6, 6111 (2015).
- Lamason, R. L., et al. Rickettsia Sca4 reduces vinculin-mediated intercellular tension to promote spread. Cell. 167 (3), 670-683 (2016).
- Sunyer, R., et al. Collective cell durotaxis emerges from long-range intercellular force transmission. Science. 353 (6304), 1157-1161 (2016).
- Dong, L., Oberai, A. A. Recovery of cellular traction in three-dimensional nonlinear hyperelastic matrices. Computer Methods in Applied Mechanics and Engineering. 314, 296-313 (2017).
- Nier, V., et al. Kalman inversion stress microscopy. Biophysical Journal. 115 (9), 1808-1816 (2018).
- Serrano, R., et al. Three-dimensional Monolayer Stress Microscopy. Biophysical Journal. 117 (1), 111-128 (2019).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of Image Analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji – an Open Source platform for biological image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. Computer control of microscopes using microManager. Current Protocols in Molecular Biology. , 20 (2010).
- Patel, N. G., et al. Unleashing shear: Role of intercellular traction and cellular moments in collective cell migration. Biochemical and Biophysical Research Communications. 522 (2), 279-285 (2020).
- Yeung, T., et al. Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion. Cell Motility and the Cytoskeleton. 60 (1), 24-34 (2005).
- Trepat, X., et al. Physical forces during collective cell migration. Nature Physics. 5, 426-430 (2009).
- Aratyn-Schaus, Y., Oakes, P. W., Stricker, J., Winter, S. P., Gardel, M. L. Preparation of complaint matrices for quantifying cellular contraction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (46), (2010).
- King, J., et al. Structural and functional characteristics of lung macro- and microvascular endothelial cell phenotypes. Microvascular Research. 67 (2), 139-151 (2004).
- Patel, G., et al. Mechanical signaling in a pulmonary microvascular endothelial cell monolayer. Biochemical and Biophysical Research Communications. 519 (2), 337-343 (2019).
- Kähler, C. J., et al. Main results of the 4th International PIV Challenge. Experiments in Fluids. 57 (6), 97 (2016).
- Tseng, Q., et al. Spatial organization of the extracellular matrix regulates cell-cell junction positioning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (5), 1506-1511 (2012).
- Alvarez-Gonzalez, B., et al. Two-layer elastographic 3-D traction force microscopy. Scientific Reports. 7, 39315 (2017).
- Makarchuk, S., Beyer, N., Gaiddon, C., Grange, W., Hebraud, P. Holographic traction force microscopy. Scientific Reports. 8 (1), 3038 (2018).
- Janmey, P. A., Miller, R. T. Mechanisms of mechanical signaling in development and disease. Journal of Cell Science. 124 (1), 9-18 (2011).
- Dembo, M., Oliver, T., Ishihara, A., Jacobson, K. Imaging the traction stresses exerted by locomoting cells with the elastic substratum method. Biophysical Journal. 70 (4), 2008-2022 (1996).
- Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).
- Butler, J. P., Tolic-Norrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology: Cell Physiology. 282 (3), 595-605 (2002).
- Saez, A., et al. Traction forces exerted by epithelial cell sheets. Journal of Physics. Condensed Matter. 22 (19), 194119 (2010).
- Deforet, M., et al. Automated velocity mapping of migrating cell populations (AVeMap). Nature Methods. 9 (11), 1081-1083 (2012).
- Polio, S. R., Smith, M. L. Patterned hydrogels for simplified measurement of cell traction forces. Methods in Cell Biology. 121, 17-31 (2014).
- Toyjanova, J., et al. 3D Viscoelastic traction force microscopy. Soft Matter. 10 (40), 8095-8106 (2014).
- Serra-Picamal, X., Conte, V., Sunyer, R., Munoz, J. J., Trepat, X. Mapping forces and kinematics during collective cell migration. Methods in Cell Biology. 125, 309-330 (2015).
- Charrier, E. E., et al. A novel method to make viscoelastic polyacrylamide gels for cell culture and traction force microscopy. APL Bioengineering. 4 (3), 036104 (2020).
Cite This Article
Nguyen, A., Battle, K., Paudel, S. S., Xu, N., Bell, J., Ayers, L., Chapman, C., Singh, A. P., Palanki, S., Rich, T., Alvarez, D. F., Stevens, T., Tambe, D. T. Integrative Toolkit to Analyze Cellular Signals: Forces, Motion, Morphology, and Fluorescence. J. Vis. Exp. (181), e63095, doi:10.3791/63095 (2022).