Primer Nöronlarda Mitokondriyal Glutatyon Redoksu Durumunun Oranmetrik Gösterge Kullanılarak Canlı Görüntülenmesi
Summary
Bu makalede, konfokal canlı mikroskopi kullanılarak primer hipokampal ve kortikal nöronlarda bazal redoks durumundaki farklılıkları ve akut pertürbasyonlara redoks yanıtlarını belirlemek için bir protokol açıklanmaktadır. Protokol, diğer hücre tiplerine ve mikroskoplara minimum değişiklikle uygulanabilir.
Abstract
Mitokondriyal redoks homeostaz nöronal canlılık ve fonksiyon için önemlidir. Mitokondri birkaç redoks sistemi içermese de, oldukça bol miktarda tiyol-disülfid redoks tampon glutatyon antioksidan savunmada merkezi bir oyuncu olarak kabul edilir. Bu nedenle, mitokondriyal glutatyon redoks potansiyelinin ölçülmesi mitokondriyal redoks durumu ve oksidatif stres hakkında yararlı bilgiler sağlar. Glutaredoxin1-roGFP2 (Grx1-roGFP2), 400 nm ve 490 nm’de tek emisyon zirvesi olan iki redoks durumuna duyarlı uyarlama zirvesine sahip glutatyon redoks potansiyelinin genetik olarak kodlanmış, yeşil floresan protein (GFP) bazlı bir oransal göstergesidir. Bu makalede primer hipokampal ve kortikal nöronlarda mitokondri hedefli Grx1-roGFP2 konfokal canlı mikroskopinin nasıl gerçekleştirilği açıklanmaktadır. Sabit durum mitokondriyal glutatyon redoks potansiyelinin (örneğin, hastalık durumlarını veya uzun süreli tedavileri karşılaştırmak için) nasıl değerlendirileceğini ve akut tedavilerde redoks değişikliklerinin nasıl ölçüleceğini (örnek olarak ekssostoksik ilaç N-metil-D-aspartat (NMDA) kullanılarak) açıklar. Buna ek olarak, makale Grx1-roGFP2 ve mitokondriyal membran potansiyel göstergesi, tetrametrikrhodamin, etil ester (TMRE), Grx1-roGPF2’nin çok boyutlu analizler için ek göstergelerle nasıl çok sayıdan olabileceğini göstermek için ortak görüntüleme sunar. Bu protokol, (i) konfokal lazer tarama mikroskop ayarlarının nasıl optimize edilmesi, (ii) uyarılma için ilaçların nasıl uygulanacağı ve ardından diamid ve dithiothreitol ile sensör kalibrasyonunun nasıl uygulanacağı ve (iii) ImageJ/FIJI ile verilerin nasıl analiz edilmesi gerektiği hakkında ayrıntılı bir açıklama sağlar.
Introduction
Birkaç önemli mitokondriyal enzim ve sinyal molekülü tiol redoks regülasyonuna tabidir1. Ayrıca, mitokondri reaktif oksijen türlerinin önemli bir hücresel kaynağıdır ve oksidatif hasara karşı seçici olarak savunmasızdır2. Buna göre, mitokondriyal redoks potansiyeli biyoenergetikleri, hücre sinyallerini, mitokondriyal fonksiyonu ve nihayetinde hücre canlılığını doğrudan etkiler3,4. Mitokondriyal matris, redoks homeostazını korumak ve antioksidan savunmaları monte etmek için yüksek miktarlarda (1-15 mM) tiyol-disülfid redoks tampon glutatyon (GSH) içerir5,6. GSH, redoks durumlarını ve aktivitelerini kontrol etmek için hedef proteinlere (S-glutatyonilasyon) birlikte bağlanabilir ve oksitlenmiş proteinleri azaltan bir dizi detoksifiye edici enzim tarafından kullanılır. Bu nedenle, mitokondriyal glutatyon redoks potansiyeli, mitokondriyal fonksiyon ve patofizyoloji incelerken oldukça bilgilendirici bir parametredir.
roGFP2, yapay bir dithiol-disülfid çifti oluşturan yüzeye maruz kalan iki sisteinin eklenmesiyle redoks duyarlı hale getirilmiş bir GFP çeşididir7,8. ~510 nm’de tek bir emisyon zirvesine ve ~400 nm ve 490 nm’de iki heyecan zirvesine sahiptir. Daha da önemlisi, iki ekscitasyon zirvesinin bağıl genlikleri roGFP2’nin redoks durumuna bağlıdır (Şekil 1), bu proteini oranmetrik bir sensör haline getirir. Grx1-roGFP2 sensöründe, insan glutaredoxin-1 (Grx1) roGFP29,10’un N-terminusu ile kaynaşmıştır. Grx1 enziminin roGFP2’ye katan bağlanması sensörün iki önemli iyileştirmesini sağlar: sensör yanıtını GSH/GSSG glutatyon redoks çiftine özgü hale getirir (Şekil 1) ve GSSG ile roGFP2 arasındaki dengeyi en az 100.0009 kat hızlandırır. Bu nedenle, Grx1-roGFP2 hücresel glutatyon redoks potansiyelinin spesifik ve dinamik görüntülenmesini sağlar.
GRX1-roGFP2 görüntüleme, geniş alan floresan mikroskopları, dönen disk konfokal mikroskopları ve lazer tarama konfokal mikroskopları dahil olmak üzere çok çeşitli mikroskoplarda yapılabilir. Birincil nöronlarda sensörün ekspresyonu lipofeksiyon11, DNA/kalsiyum-fosfat koprecipitation12, virüs aracılı gen transferi veya transgenik hayvanların hücre kaynağı olarak kullanılması gibi çeşitli yöntemlerle elde edilebilir (Şekil 2). Bu makaledeki deneyler için 1:1 AAV1 oranı ve AAV2 kapsid proteinleri 13,14 içeren sözde rekombinant adeno ilişkili virüsler (rAAV) kullanılmıştır. Bu vektör ile maksimal sensör ekspresyonuna genellikle enfeksiyondan 4-5 gün sonra ulaşılır ve en az iki hafta stabil kalır. Grx1-roGFP2’yi fare ve sıçanlardan birincil hipokampal ve kortikal nöronlarda başarıyla kullandık.
Bu makalede, primer sıçan hipokampal ve kortikal nöronlarda mitokondri hedefli Grx1-roGFP2’nin rAAV aracılı ekspresyonu bazal mitokondriyal glutatyon redoks durumunu ve akut pertürbasyonunu değerlendirmek için kullanılır. (i) lazer tarama konfokal mikroskop ayarlarının nasıl optimizeılacağı, (ii) canlı görüntüleme deneyinin nasıl çalıştırılacağı ve (iii) FIJI ile verilerin nasıl analizılacağına ilişkin ayrıntılı talimatlar içeren konfokal canlı görüntüleme için bir protokol sağlanır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mitokondriyal redoks durumunun nicel ve dinamik ölçümleri mitokondriyal ve hücresel fizyoloji hakkında önemli bilgiler sağlar. Reaktif oksijen türlerini, “redoks stres” veya “oksidatif stresi” tespit eden çeşitli florojenik kimyasal problar mevcuttur. Bununla birlikte, ikinci terimler iyi tanımlanmamıştır ve genellikle özgüllüklerden yoksundur9,17,18. Kimyasal boyalarla karşılaştırıldığında, Grx1-roGFP2 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Deutsche Forschungsgemeinschaft (BA 3679/5-1; 2289 İÇİN: BA 3679/4-2). A.K. ERASMUS+ bursu ile desteklenmektedir. Birincil nöronların hazırlanması için Iris Bünzli-Ehret, Rita Rosner ve Andrea Schlicksupp’a teşekkür ederiz. PLPCX-mito-Grx1-roGFP2 sağladığı için Dr. Tobias Dick’e teşekkür ederiz. Şekil 4’te gösterilen deneyler Heidelberg Üniversitesi Nikon Görüntüleme Merkezi’nde gerçekleştirildi. Şekil 2 BioRender.com ile hazırlanmıştır.
Materials
| reagents | |||
| Calcium chloride (CaCl2·2H2O) | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Diamide (DA) | Sigma-Aldrich | D3648 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Carl Roth GmbH | 6908.1 | |
| Glucose (2.5 M stock solution) | Sigma-Aldrich | G8769 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Glycine | neoFroxx GmbH | LC-4522.2 | |
| HEPES (1 M stock solution) | Sigma-Aldrich | 15630-080 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Magnesium chloride (MgCl2·6H2O) | Sigma-Aldrich | 442611-M | |
| N-methyl-D-aspartate (NMDA) | Sigma-Aldrich | M3262 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Sodium chloride (NaCl) | neoFroxx GmbH | LC-5932.1 | |
| Sodium pyruvate (0.1 M stock solution) | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P8574 | |
| Sucrose | Carl Roth GmbH | 4621.1 | |
| Tetramethylrhodamine ethyl ester perchlorate (TMRE) | Sigma-Aldrich | 87917 | |
| equipment | |||
| imaging chamber | Life Imaging Services (Basel, Switzerland) | 10920 | Ludin Chamber Type 3 for Ø12mm coverslips |
| laser scanning confocal microscope, microscope | Leica | DMI6000 | |
| laser scanning confocal microscope, scanning unit | Leica | SP8 | |
| peristaltic pump | VWR | PP1080 181-4001 | |
| spinning disc confocal microscope, camera | Hamamatsu | C9100-02 EMCCD | |
| spinning disc confocal microscope, incubationsystem | TokaiHit | INU-ZILCF-F1 | |
| spinning disc confocal microscope, microscope | Nikon | Ti microscope | |
| spinning disc confocal microscope, scanning unit | Yokagawa | CSU-X1 | |
| software | |||
| FIJI | https://fiji.sc | ||
| StackReg plugin | https://github.com/fiji-BIG/StackReg/blob/master/src/main/java/StackReg_.java | ||
| TurboReg plugin | https://github.com/fiji-BIG/TurboReg/blob/master/src/main/java/TurboReg_.java |
References
- Roede, J. R., Go, Y. M., Jones, D. P. Redox equivalents and mitochondrial bioenergetics. Methods in Molecular Biology. 810, 249-280 (2012).
- Turrens, J. F. Mitochondrial formation of reactive oxygen species. Journal of Physiology. 552, 335-344 (2003).
- Lin, M. T., Beal, M. F. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases. Nature. 443 (7113), 787-795 (2006).
- Manfredi, G., Beal, M. F. The role of mitochondria in the pathogenesis of neurodegenerative diseases. Brain Pathology. 10 (3), 462-472 (2000).
- Mari, M., Morales, A., Colell, A., Garcia-Ruiz, C., Fernandez-Checa, J. C. Mitochondrial glutathione, a key survival antioxidant. Antioxidants & Redox Signaling. 11 (11), 2685-2700 (2009).
- Murphy, M. P. Mitochondrial thiols in antioxidant protection and redox signaling: distinct roles for glutathionylation and other thiol modifications. Antioxidants & Redox Signaling. 16 (6), 476-495 (2012).
- Dooley, C. T., et al. Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators. Journal of Biological Chemistry. 279 (21), 22284-22293 (2004).
- Hanson, G. T., et al. Investigating mitochondrial redox potential with redox-sensitive green fluorescent protein indicators. Journal of Biological Chemistry. 279 (13), 13044-13053 (2004).
- Gutscher, M., et al. Real-time imaging of the intracellular glutathione redox potential. Nature Methods. 5 (6), 553-559 (2008).
- Morgan, B., Sobotta, M. C., Dick, T. P. Measuring E(GSH) and H2O2 with roGFP2-based redox probes. Free Radical Biology & Medicine. 51 (11), 1943-1951 (2011).
- Marwick, K. F. M., Hardingham, G. E. Transfection in primary cultured neuronal cells. Methods in Molecular Biology. 1677, 137-144 (2017).
- Kohrmann, M., et al. convenient, and effective method to transiently transfect primary hippocampal neurons. Journal of Neuroscience Research. 58 (6), 831-835 (1999).
- Depp, C., Bas-Orth, C., Schroeder, L., Hellwig, A., Bading, H. Synaptic activity protects neurons against calcium-mediated oxidation and contraction of mitochondria during excitotoxicity. Antioxidants & Redox Signaling. 29 (12), 1109-1124 (2018).
- Hauck, B., Chen, L., Xiao, W. Generation and characterization of chimeric recombinant AAV vectors. Molecular Therapy. 7 (3), 419-425 (2003).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
- Zhang, S. J., et al. Nuclear calcium signaling controls expression of a large gene pool: identification of a gene program for acquired neuroprotection induced by synaptic activity. PLoS Genetics. 5 (8), 1000604 (2009).
- Winterbourn, C. C. The challenges of using fluorescent probes to detect and quantify specific reactive oxygen species in living cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (2), 730-738 (2014).
- Sies, H. Oxidative stress: a concept in redox biology and medicine. Redox Biology. 4, 180-183 (2015).
- Lukyanov, K. A., Belousov, V. V. Genetically encoded fluorescent redox sensors. Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (2), 745-756 (2014).
- Nietzel, T., et al. Redox-mediated kick-start of mitochondrial energy metabolism drives resource-efficient seed germination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 741-751 (2020).
- Albrecht, S. C., et al. Redesign of genetically encoded biosensors for monitoring mitochondrial redox status in a broad range of model eukaryotes. Journal of Biomolecular Screening. 19 (3), 379-386 (2014).
- Albrecht, S. C., Barata, A. G., Grosshans, J., Teleman, A. A., Dick, T. P. In vivo mapping of hydrogen peroxide and oxidized glutathione reveals chemical and regional specificity of redox homeostasis. Cell Metabolism. 14 (6), 819-829 (2011).
- Breckwoldt, M. O., et al. Multiparametric optical analysis of mitochondrial redox signals during neuronal physiology and pathology in vivo. Nature Medicine. 20 (5), 555-560 (2014).
- Ricke, K. M., et al. Mitochondrial dysfunction combined with high calcium load leads to impaired antioxidant defense underlying the selective loss of nigral dopaminergic neurons. Journal of Neuroscience. 40 (9), 1975-1986 (2020).
- Bjornberg, O., Ostergaard, H., Winther, J. R. Mechanistic insight provided by glutaredoxin within a fusion to redox-sensitive yellow fluorescent protein. Biochemistry. 45 (7), 2362-2371 (2006).
- Shokhina, A. G., et al. Red fluorescent redox-sensitive biosensor Grx1-roCherry. Redox Biology. 21, 101071 (2019).
