Imaging dal vivo dello stato redox del glutatione mitocondriale nei neuroni primari utilizzando un indicatore raziometrico

Diversi importanti enzimi mitocondriali e molecole di segnalazione sono soggetti alla regolazione redox del ^tiolo1. Inoltre, i mitocondri sono una delle principali fonti cellulari di specie reattive dell’ossigeno e sono selettivamente vulnerabili al danno ^ossidativo2. Di conseguenza, il potenziale redox mitocondriale influenza direttamente la bioenergetica, la segnalazione cellulare, la funzione mitocondriale e, infine, la vitalità ^cellulare3,4. La matrice mitocondriale contiene elevate quantità (1-15 mM) del glutatione tampone redox tiolo-disolfuro (GSH) per mantenere l’omeostasi redox e montare difese ^{antiossidanti5,6}. Il GSH può essere attaccato covalentemente alle proteine bersaglio (S-glutationilazione) per controllarne lo stato redox e l’attività ed è utilizzato da una serie di enzimi disintossicanti che riducono le proteine ossidate. Pertanto, il potenziale redox del glutatione mitocondriale è un parametro altamente informativo quando si studia la funzione mitocondriale e la fisiopatologia.

roGFP2 è una variante della GFP che è stata resa redox-sensibile dall’aggiunta di due ciste esposte in superficie che formano una coppia artificiale ditiolo-disolfuro7,8. Ha un singolo picco di emissione a ~ 510 nm e due picchi di eccitazione a ~ 400 nm e 490 nm. È importante sottolineare che le ampiezze relative dei due picchi di eccitazione dipendono dallo stato redox di roGFP2 (Figura 1), rendendo questa proteina un sensore raziometrico. Nel sensore Grx1-roGFP2, la glutaredossina-1 umana (Grx1) è stata fusa al N-terminus di roGFP29,10. L’attacco covalente dell’enzima Grx1 a roGFP2 offre due importanti miglioramenti del sensore: rende la risposta del sensore specifica per la coppia GSH/GSSG glutatione redox (Figura 1) e accelera l’equilibrio tra GSSG e roGFP2 di un fattore di almeno 100.0009. Pertanto, Grx1-roGFP2 consente l’imaging specifico e dinamico del potenziale redox del glutatione cellulare.

L’imaging Grx1-roGFP2 può essere eseguito su una vasta gamma di microscopi, tra cui microscopi a fluorescenza a campo largo, microscopi confocali a disco rotante e microscopi confocali a scansione laser. L’espressione del sensore nei neuroni primari può essere ottenuta con vari metodi che includono la lipofezione11, la coprecipitazione DNA/calcio-fosfato12, il trasferimento genico mediato da virus o l’uso di animali transgenici come fonte cellulare (Figura 2). Per gli esperimenti in questo articolo sono stati utilizzati virus adeno-associati ricombinanti pseudotipizzati (rAAV) contenenti un rapporto 1:1 delle proteine del capside ^AAV1 e AAV2 ^13,14. Con questo vettore, l’espressione massima del sensore viene in genere raggiunta 4-5 giorni dopo l’infezione e rimane stabile per almeno due settimane. Abbiamo utilizzato con successo Grx1-roGFP2 nei neuroni primari dell’ippocampo e corticale di topi e ratti.

In questo articolo, l’espressione mediata da rAAV di Grx1-roGFP2 mirato ai mitocondri nei neuroni primari dell’ippocampo e corticale del ratto viene utilizzata per valutare lo stato redox del glutatione mitocondriale basale e la sua perturbazione acuta. Viene fornito un protocollo per l’imaging confocale dal vivo con istruzioni dettagliate su come (i) ottimizzare le impostazioni del microscopio confocale a scansione laser, (ii) eseguire un esperimento di imaging dal vivo e (iii) analizzare i dati con FIJI.