Живая визуализация окислительно-восстановительного состояния митохондриального глутатиона в первичных нейронах с использованием ратиометрического индикатора
Summary
В этой статье описывается протокол для определения различий в базальном окислительно-восстановительном состоянии и окислительно-восстановительных реакциях на острые возмущения в первичных нейронах гиппокампа и коры с помощью конфокальной живой микроскопии. Протокол может быть применен к другим типам клеток и микроскопам с минимальными модификациями.
Abstract
Митохондриальный окислительно-восстановительный гомеостаз важен для жизнеспособности и функции нейронов. Хотя митохондрии содержат несколько окислительно-восстановительных систем, тиолдисульфидный окислительно-восстановительный буферный глутатион считается центральным игроком в антиоксидантной защите. Таким образом, измерение окислительно-восстановительного потенциала митохондрий глутатиона дает полезную информацию о митохондриальном окислительно-восстановительном статусе и окислительном стрессе. Glutaredoxin1-roGFP2 (Grx1-roGFP2) представляет собой генетически закодированный, основанный на зеленом флуоресцентном белке (GFP) ратиометрический индикатор окислительно-восстановительного потенциала глутатиона, который имеет два пика возбуждения, чувствительных к окислительно-восстановительному состоянию, при 400 нм и 490 нм с одним пиком излучения при 510 нм. В этой статье описывается, как выполнить конфокальную живую микроскопию митохондрий, нацеленных на Grx1-roGFP2 в первичных нейронах гиппокампа и коры. В нем описывается, как оценить устойчивый окислительно-восстановительный потенциал митохондриального глутатиона (например, для сравнения болезненных состояний или длительного лечения) и как измерить окислительно-восстановительные изменения при остром лечении (используя экситотоксический препарат N-метил-D-аспартат (NMDA) в качестве примера). Кроме того, в статье представлена совместная визуализация Grx1-roGFP2 и индикатора потенциала митохондриальной мембраны, тетраметилродамина, этилового эфира (TMRE), чтобы продемонстрировать, как Grx1-roGPF2 может быть мультиплексирован с дополнительными показателями для многопараметрического анализа. Этот протокол предоставляет подробное описание того, как (i) оптимизировать настройки конфокального лазерного сканирующего микроскопа, (ii) применять препараты для стимуляции с последующей калибровкой датчиков с диамидом и дитиотрейтолом и (iii) анализировать данные с помощью ImageJ / FIJI.
Introduction
Несколько важных митохондриальных ферментов и сигнальных молекул подвержены окислительно-восстановительной регуляции тиола1. Кроме того, митохондрии являются основным клеточным источником активных форм кислорода и избирательно уязвимы к окислительному повреждению2. Соответственно, митохондриальный окислительно-восстановительный потенциал напрямую влияет на биоэнергетику, клеточную сигнализацию, митохондриальную функцию и, в конечном счете, жизнеспособность клеток3,4. Митохондриальный матрикс содержит большое количество (1-15 мМ) тиолдисульфидного окислительно-восстановительного буфера глутатиона (GSH) для поддержания окислительно-восстановительного гомеостаза и повышения антиоксидантной защиты5,6. GSH может быть ковалентно присоединен к целевым белкам (S-глутатионилирование) для контроля их окислительно-восстановительного статуса и активности и используется рядом детоксикационных ферментов, которые уменьшают окисленные белки. Поэтому окислительно-восстановительный потенциал митохондрийного глутатиона является высокоинформативным параметром при изучении митохондриальной функции и патофизиологии.
roGFP2 является вариантом GFP, который был сделан окислительно-чувствительным путем добавления двух поверхностно-открытых цистеинов, которые образуют искусственную пару дитиол-дисульфид7,8. Он имеет один пик излучения при ~ 510 нм и два пика возбуждения при ~ 400 нм и 490 нм. Важно отметить, что относительные амплитуды двух пиков возбуждения зависят от окислительно-восстановительного состояния roGFP2 (рисунок 1), что делает этот белок ратиометрическим датчиком. В датчике Grx1-roGFP2 человеческий глутаредоксин-1 (Grx1) был сплавлен с N-концом roGFP29,10. Ковалентное присоединение фермента Grx1 к roGFP2 обеспечивает два основных улучшения датчика: он делает отклик датчика специфичным для окислительно-восстановительной пары глутатиона GSH / GSSG (рисунок 1) и ускоряет эквивалентность между GSSG и roGFP2 в 100 0009 раз. Таким образом, Grx1-roGFP2 обеспечивает специфическую и динамическую визуализацию окислительно-восстановительного потенциала клеточного глутатиона.
Визуализация Grx1-roGFP2 может быть выполнена на широком спектре микроскопов, включая широкоугольные флуоресцентные микроскопы, вращающиеся дисковые конфокальные микроскопы и лазерные сканирующие конфокальные микроскопы. Экспрессия датчика в первичных нейронах может быть достигнута различными методами, которые включают липофекцию11, сопреципитацию ДНК/кальций-фосфат12, опосредованный вирусом перенос генов или использование трансгенных животных в качестве источника клеток (рисунок 2). Псевдотипизированные рекомбинантные аденоассоциированные вирусы (rAAV), содержащие соотношение 1:1 AAV1 и AAV2 капсидных белков 13,14, были использованы для экспериментов в этой статье. При этом векторе максимальная экспрессия датчиков обычно достигается через 4-5 дней после заражения и остается стабильной в течение не менее двух недель. Мы успешно использовали Grx1-roGFP2 в первичных нейронах гиппокампа и коры мышей и крыс.
В этой статье rAAV-опосредованная экспрессия митохондрий-таргетного Grx1-roGFP2 в первичных нейронах гиппокампа и коры крыс используется для оценки базального митохондриального окислительно-восстановительного состояния глутатиона и его острого возмущения. Для конфокальной визуализации в реальном времени предоставляется протокол с подробными инструкциями о том, как (i) оптимизировать настройки лазерного сканирования конфокального микроскопа, (ii) провести эксперимент по визуализации в реальном времени и (iii) проанализировать данные с помощью FIJI.
Protocol
Representative Results
Discussion
Количественные и динамические измерения окислительно-восстановительного состояния митохондрий дают важную информацию о митохондриальной и клеточной физиологии. Доступно несколько фторогенных химических зондов, которые обнаруживают активные формы кислорода, «окислительно-восстан…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Deutsche Forschungsgemeinschaft (BA 3679/5-1; ДЛЯ 2289: БА 3679/4-2). A.K. поддерживается стипендией ERASMUS+. Мы благодарим Айрис Бюнцли-Эрет, Риту Рознер и Андреа Шликсупп за подготовку первичных нейронов. Мы благодарим д-ра Тобиаса Дика за предоставление pLPCX-mito-Grx1-roGFP2. Эксперименты, показанные на рисунке 4 , были проведены в Центре визуализации Nikon Гейдельбергского университета. Рисунок 2 был подготовлен вместе с BioRender.com.
Materials
| reagents | |||
| Calcium chloride (CaCl2·2H2O) | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Diamide (DA) | Sigma-Aldrich | D3648 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Carl Roth GmbH | 6908.1 | |
| Glucose (2.5 M stock solution) | Sigma-Aldrich | G8769 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Glycine | neoFroxx GmbH | LC-4522.2 | |
| HEPES (1 M stock solution) | Sigma-Aldrich | 15630-080 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Magnesium chloride (MgCl2·6H2O) | Sigma-Aldrich | 442611-M | |
| N-methyl-D-aspartate (NMDA) | Sigma-Aldrich | M3262 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Sodium chloride (NaCl) | neoFroxx GmbH | LC-5932.1 | |
| Sodium pyruvate (0.1 M stock solution) | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P8574 | |
| Sucrose | Carl Roth GmbH | 4621.1 | |
| Tetramethylrhodamine ethyl ester perchlorate (TMRE) | Sigma-Aldrich | 87917 | |
| equipment | |||
| imaging chamber | Life Imaging Services (Basel, Switzerland) | 10920 | Ludin Chamber Type 3 for Ø12mm coverslips |
| laser scanning confocal microscope, microscope | Leica | DMI6000 | |
| laser scanning confocal microscope, scanning unit | Leica | SP8 | |
| peristaltic pump | VWR | PP1080 181-4001 | |
| spinning disc confocal microscope, camera | Hamamatsu | C9100-02 EMCCD | |
| spinning disc confocal microscope, incubationsystem | TokaiHit | INU-ZILCF-F1 | |
| spinning disc confocal microscope, microscope | Nikon | Ti microscope | |
| spinning disc confocal microscope, scanning unit | Yokagawa | CSU-X1 | |
| software | |||
| FIJI | https://fiji.sc | ||
| StackReg plugin | https://github.com/fiji-BIG/StackReg/blob/master/src/main/java/StackReg_.java | ||
| TurboReg plugin | https://github.com/fiji-BIG/TurboReg/blob/master/src/main/java/TurboReg_.java |
References
- Roede, J. R., Go, Y. M., Jones, D. P. Redox equivalents and mitochondrial bioenergetics. Methods in Molecular Biology. 810, 249-280 (2012).
- Turrens, J. F. Mitochondrial formation of reactive oxygen species. Journal of Physiology. 552, 335-344 (2003).
- Lin, M. T., Beal, M. F. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases. Nature. 443 (7113), 787-795 (2006).
- Manfredi, G., Beal, M. F. The role of mitochondria in the pathogenesis of neurodegenerative diseases. Brain Pathology. 10 (3), 462-472 (2000).
- Mari, M., Morales, A., Colell, A., Garcia-Ruiz, C., Fernandez-Checa, J. C. Mitochondrial glutathione, a key survival antioxidant. Antioxidants & Redox Signaling. 11 (11), 2685-2700 (2009).
- Murphy, M. P. Mitochondrial thiols in antioxidant protection and redox signaling: distinct roles for glutathionylation and other thiol modifications. Antioxidants & Redox Signaling. 16 (6), 476-495 (2012).
- Dooley, C. T., et al. Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators. Journal of Biological Chemistry. 279 (21), 22284-22293 (2004).
- Hanson, G. T., et al. Investigating mitochondrial redox potential with redox-sensitive green fluorescent protein indicators. Journal of Biological Chemistry. 279 (13), 13044-13053 (2004).
- Gutscher, M., et al. Real-time imaging of the intracellular glutathione redox potential. Nature Methods. 5 (6), 553-559 (2008).
- Morgan, B., Sobotta, M. C., Dick, T. P. Measuring E(GSH) and H2O2 with roGFP2-based redox probes. Free Radical Biology & Medicine. 51 (11), 1943-1951 (2011).
- Marwick, K. F. M., Hardingham, G. E. Transfection in primary cultured neuronal cells. Methods in Molecular Biology. 1677, 137-144 (2017).
- Kohrmann, M., et al. convenient, and effective method to transiently transfect primary hippocampal neurons. Journal of Neuroscience Research. 58 (6), 831-835 (1999).
- Depp, C., Bas-Orth, C., Schroeder, L., Hellwig, A., Bading, H. Synaptic activity protects neurons against calcium-mediated oxidation and contraction of mitochondria during excitotoxicity. Antioxidants & Redox Signaling. 29 (12), 1109-1124 (2018).
- Hauck, B., Chen, L., Xiao, W. Generation and characterization of chimeric recombinant AAV vectors. Molecular Therapy. 7 (3), 419-425 (2003).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
- Zhang, S. J., et al. Nuclear calcium signaling controls expression of a large gene pool: identification of a gene program for acquired neuroprotection induced by synaptic activity. PLoS Genetics. 5 (8), 1000604 (2009).
- Winterbourn, C. C. The challenges of using fluorescent probes to detect and quantify specific reactive oxygen species in living cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (2), 730-738 (2014).
- Sies, H. Oxidative stress: a concept in redox biology and medicine. Redox Biology. 4, 180-183 (2015).
- Lukyanov, K. A., Belousov, V. V. Genetically encoded fluorescent redox sensors. Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (2), 745-756 (2014).
- Nietzel, T., et al. Redox-mediated kick-start of mitochondrial energy metabolism drives resource-efficient seed germination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 741-751 (2020).
- Albrecht, S. C., et al. Redesign of genetically encoded biosensors for monitoring mitochondrial redox status in a broad range of model eukaryotes. Journal of Biomolecular Screening. 19 (3), 379-386 (2014).
- Albrecht, S. C., Barata, A. G., Grosshans, J., Teleman, A. A., Dick, T. P. In vivo mapping of hydrogen peroxide and oxidized glutathione reveals chemical and regional specificity of redox homeostasis. Cell Metabolism. 14 (6), 819-829 (2011).
- Breckwoldt, M. O., et al. Multiparametric optical analysis of mitochondrial redox signals during neuronal physiology and pathology in vivo. Nature Medicine. 20 (5), 555-560 (2014).
- Ricke, K. M., et al. Mitochondrial dysfunction combined with high calcium load leads to impaired antioxidant defense underlying the selective loss of nigral dopaminergic neurons. Journal of Neuroscience. 40 (9), 1975-1986 (2020).
- Bjornberg, O., Ostergaard, H., Winther, J. R. Mechanistic insight provided by glutaredoxin within a fusion to redox-sensitive yellow fluorescent protein. Biochemistry. 45 (7), 2362-2371 (2006).
- Shokhina, A. G., et al. Red fluorescent redox-sensitive biosensor Grx1-roCherry. Redox Biology. 21, 101071 (2019).
