レシオメトリック指標を用いた一次ニューロンにおけるミトコンドリアグルタチオンレドックス状態の生画像化

いくつかの重要なミトコンドリア酵素およびシグナル伝達分子は、チオール酸化還元調節¹の対象となります。さらに、ミトコンドリアは活性酸素種の主要な細胞源であり、酸化的損傷に対して選択的に脆弱である²。したがって、ミトコンドリア酸化還元電位は、バイオエネルギー、細胞シグナル伝達、ミトコンドリア機能、および最終的に細胞生存率^3,4に直接影響を及ぼす。ミトコンドリアマトリックスには、酸化還元恒常性を維持し、抗酸化防御剤^を搭載するチオールジスルフィドレドックスバッファーグルタチオン(GSH)の量(1-15 mM)が多く含^{まれています。}GSHは、標的タンパク質に共有結合(S-グルタチオン化)を使用して酸化還元の状態と活性を制御し、酸化タンパク質を減少させる解毒酵素の範囲で使用されます。したがって、ミトコンドリアグルタチオン酸化還元電位は、ミトコンドリア機能および病態生理学を研究する際の非常に有益なパラメータである。

roGFP2は、人工ジチオールジスルフィドペア^7,8を形成する2つの表面露出システインを添加することによって酸化還元感受性にされたGFPの変異体である。それは〜510 nmで1つの放出ピークを有し、〜400 nmおよび490 nmで2つの励起ピークを有する。重要なことに、2つの励起ピークの相対振幅はroGFP2の酸化還元状態に依存し(図1)、このタンパク質をレシオメトリックセンサーにします。Grx1-roGFP2センサーでは、ヒトグルタレドキシン-1(Grx1)がroGFP29,10のN末語に融合されています。RoGFP2へのGrx1酵素の共有結合は、センサーの2つの大きな改善を提供する:それはGSH / GSSGグルタチオンレドックス対(図1)に特異的なセンサー応答を作り、少なくとも100,0009の倍によってGSSGとroGFP2の間の平衡化を加速する。従って、Grx1-roGFP2は細胞グルタチオン酸化還元電位の特異的かつ動的なイメージングを可能にする。

Grx1-roGFP2イメージングは、広視野蛍光顕微鏡、回転ディスク共焦点顕微鏡、レーザー走査型共焦点顕微鏡など、幅広い顕微鏡で行うことができます。一次ニューロンにおけるセンサの発現は、リポフェクション¹¹、DNA/リン酸カルシウム共沈¹²、ウイルス媒介遺伝子導入、または細胞源としてのトランスジェニック動物の使用を含む様々な方法によって達成することができる(図2)。この記事では、AAV1およびAAV2キャプシドタンパク質1^:1比を含む擬似型組換えアデノ関連ウイルス(rAAV)を^{使用した。}このベクターを使用すると、最大センサ発現は、通常、感染後4〜5日に達し、少なくとも2週間安定した状態を保ちます。マウスやラットの一次海馬および皮質ニューロンでGrx1-roGFP2を使用しました。

本稿では、一次ラット海馬および皮質ニューロンにおけるミトコンドリア標的Grx1-roGFP2のrAAV媒介発現を用いて、基底ミトコンドリアグルタチオンレドックスの状態とその急性摂動を評価する。(i)レーザースキャン共焦点顕微鏡の設定を最適化する方法、(ii)ライブイメージング実験を実行し、(iii)FIJIを使用してデータを分析する方法についての詳細な手順を備えた共焦点ライブイメージング用のプロトコルが提供されています。