التصوير الحي لحالة الميتوكوندريا الجلوتاثيون ريدوكسي في الخلايا العصبية الأولية باستخدام مؤشر قياس النسب
Summary
توضح هذه المقالة بروتوكول لتحديد الاختلافات في حالة الأكسدة القاعدية واستجابات الأكسدة الحمراء للاضطرابات الحادة في الخلايا العصبية الأولية فرس النهر والقشرية باستخدام المجهر الحي confocal. يمكن تطبيق البروتوكول على أنواع الخلايا الأخرى والمجاهر مع الحد الأدنى من التعديلات.
Abstract
الميتوكوندريا الأكسدة التوازن مهم البقاء العصبية وظيفة. على الرغم من أن الميتوكوندريا تحتوي على العديد من أنظمة الأكسدة، يعتبر الجلوتاثيون العازلة للثيول-ديسول-ديسولفيد الوفيرة جدا لاعبا مركزيا في الدفاعات المضادة للأكسدة. ولذلك، قياس إمكانات أكسدة الجلوتاثيون الميتوكوندريا يوفر معلومات مفيدة حول حالة الأكسدة الميتوكوندريا والإجهاد التأكسدي. Glutaredoxin1-roGFP2 (Grx1-roGFP2) هو مؤشر نسبي مشفر وراثيا والأخضر الفلوري (GFP) لإمكانات أكسدة الجلوتاثيون التي لديها قمتين للإثارة حساسة للأكسدة عند 400 نانومتر و490 نانومتر مع ذروة انبعاث واحدة عند 510 نانومتر. توضح هذه المقالة كيفية إجراء المجهر الحي confocal من الميتوكوندريا المستهدفة Grx1-roGFP2 في الخلايا العصبية فرس النهر والقشرية الأولية. وهو يصف كيفية تقييم حالة ثابتة الميتوكوندريا الجلوتاثيون أكسدة المحتملة (على سبيل المثال، لمقارنة حالات المرض أو العلاجات على المدى الطويل) وكيفية قياس التغيرات الأكسدة على العلاجات الحادة (باستخدام المخدرات excitotoxic N-ميثيل-D-الأسبارتات (NMDA) كمثال). بالإضافة إلى ذلك ، يعرض المقال التصوير المشترك ل Grx1-roGFP2 ومؤشر إمكانات غشاء الميتوكوندريا ، tetramethylrhodamine ، استر الإيثيل (TMRE) ، لإظهار كيف يمكن مضاعفة Grx1-roGPF2 مع مؤشرات إضافية للتحليلات متعددة البارامترية. يوفر هذا البروتوكول وصفا مفصلا لكيفية (1) تحسين إعدادات مجهر المسح بالليزر البؤري ، (2) تطبيق الأدوية للتحفيز تليها معايرة الاستشعار مع دياميد وديثيوثيريتول ، و (3) تحليل البيانات مع ImageJ / FIJI.
Introduction
العديد من الإنزيمات الميتوكوندريا الهامة وجزيئات الإشارات تخضع لتنظيم أكسدة الثيول1. وعلاوة على ذلك، الميتوكوندريا هي مصدر خلوي رئيسي لأنواع الأكسجين التفاعلية وعرضة بشكل انتقائي للتلف التأكسدي2. وبناء على ذلك، فإن إمكانات أكسدة الميتوكوندريا تؤثر بشكل مباشر على الجيوجيات الحيوية، وإشارات الخلايا، ووظيفة الميتوكوندريا، وفي نهاية المطاف صلاحية الخلية3،4. مصفوفة الميتوكوندريا يحتوي على كميات عالية (1-15 mM) من الغلوتاثيون العازلة أكسدة الثيول-ديسوليد (GSH) للحفاظ على التوازن الأكسدة وجبل الدفاعات المضادة للأكسدة5,6. يمكن ربط GSH بشكل مشترك بالبروتينات المستهدفة (S-glutathionylation) للتحكم في حالة الأكسدة ونشاطها ويستخدم من قبل مجموعة من الإنزيمات مزيلة للسموم التي تقلل من البروتينات المؤأكسدة. ولذلك، فإن إمكانات أكسدة الجلوتاثيون الميتوكوندريا هي معلمة غنية بالمعلومات للغاية عند دراسة وظيفة الميتوكوندريا والفيزيولوجيا المرضية.
roGFP2 هو البديل من GFP التي جعلت من حساسية الأكسدة بإضافة اثنين من السيستينات السطحية المكشوفة التي تشكل ثنائي ثنائي هذاول-ديبريتيد الاصطناعية 7,8. لديها ذروة انبعاث واحد في ~ 510 نانومتر وقممتين الإثارة في ~ 400 نانومتر و 490 نانومتر. الأهم من ذلك ، فإن السعة النسبية للقممتين الإثارة تعتمد على حالة الأكسدة من roGFP2 (الشكل 1) ، مما يجعل هذا البروتين جهاز استشعار نسبة. في مستشعر Grx1-roGFP2، تم دمج الجلوتاريدوشين-1 البشري (Grx1) في N-terminus من roGFP29,10. المرفق التكافؤي لانزيم Grx1 إلى roGFP2 يتيح اثنين من التحسينات الرئيسية للاستشعار: فهو يجعل استجابة الاستشعار محددة لزوج GSH / GSSG الجلوتاثيون أكسدة (الشكل 1)، وأنه يسرع التوازن بين GSSG وroGFP2 بعامل لا يقل عن 100،0009. لذلك ، يتيح Grx1-roGFP2 تصويرا محددا وديناميكيا لإمكانات أكسدة الجلوتاثيون الخلوية.
يمكن إجراء التصوير Grx1-roGFP2 على مجموعة واسعة من المجاهر، بما في ذلك المجاهر الفلورية واسعة النطاق، والمجاهر confocal القرص الغزل، والمجاهر confocal المسح بالليزر. يمكن تحقيق التعبير عن المستشعر في الخلايا العصبية الأولية بطرق مختلفة تشمل شفط الدهون11 ، الحمض النووي / الكالسيوم فوسفات coprecipitation12 ، نقل الجينات بوساطة الفيروس ، أو استخدام الحيوانات المعدلة وراثيا كمصدر للخلية (الشكل 2). الزائفة المؤتلفة الفيروسات المرتبطة أدينو (rAAV) التي تحتوي على نسبة 1:1 من AAV1 وAAV2 capsid البروتينات 13,14 استخدمت للتجارب في هذه المقالة. مع هذا المتجه ، عادة ما يتم الوصول إلى أقصى تعبير استشعار بعد 4-5 أيام من العدوى ويبقى مستقرا لمدة أسبوعين على الأقل. لقد استخدمنا بنجاح Grx1-roGFP2 في الخلايا العصبية فرس النهر والقشرية الأولية من الفئران والجرذان.
في هذه المقالة، يتم استخدام التعبير بوساطة rAAV من الميتوكوندريا المستهدفة Grx1-roGFP2 في فرس النهر الفئران الأولية والخلايا العصبية القشرية لتقييم حالة أكسدة الجلوتاثيون الميتوكوندريا القاعدية واضطراباتها الحادة. يتم توفير بروتوكول للتصوير الحي confocal مع تعليمات مفصلة حول كيفية (1) تحسين إعدادات المجهر confocal المسح بالليزر ، (2) تشغيل تجربة التصوير الحي ، و (3) تحليل البيانات مع فيجي.
Protocol
Representative Results
Discussion
توفر القياسات الكمية والديناميكية لحالة أكسدة الميتوكوندريا معلومات مهمة حول الميتوكوندريا وعلم وظائف الأعضاء الخلوي. تتوفر العديد من المسابير الكيميائية الفلورية التي تكشف عن أنواع الأكسجين التفاعلية أو “إجهاد الأكسدة” أو “الإجهاد التأكسدي”. غير أن المصطلحات الأخيرة ليست محددة تحديدا …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل دويتشه فرانشونجسجيمينشافت (BA 3679/5-1؛ 1؛ 1. ل 2289: BA 3679/4-2). يتم دعم A.K. من خلال زمالة ERASMUS+ . نشكر إيريس بونسلي-إهريت وريتا روزنر وأندريا شليكسوب على إعداد الخلايا العصبية الأولية. نشكر الدكتور توبياس ديك على توفير pLPCX-mito-Grx1-roGFP2. أجريت التجارب المبينة في الشكل 4 في مركز نيكون للتصوير، جامعة هايدلبرغ. وقد أعد الشكل 2 BioRender.com.
Materials
| reagents | |||
| Calcium chloride (CaCl2·2H2O) | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Diamide (DA) | Sigma-Aldrich | D3648 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Carl Roth GmbH | 6908.1 | |
| Glucose (2.5 M stock solution) | Sigma-Aldrich | G8769 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Glycine | neoFroxx GmbH | LC-4522.2 | |
| HEPES (1 M stock solution) | Sigma-Aldrich | 15630-080 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Magnesium chloride (MgCl2·6H2O) | Sigma-Aldrich | 442611-M | |
| N-methyl-D-aspartate (NMDA) | Sigma-Aldrich | M3262 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Sodium chloride (NaCl) | neoFroxx GmbH | LC-5932.1 | |
| Sodium pyruvate (0.1 M stock solution) | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P8574 | |
| Sucrose | Carl Roth GmbH | 4621.1 | |
| Tetramethylrhodamine ethyl ester perchlorate (TMRE) | Sigma-Aldrich | 87917 | |
| equipment | |||
| imaging chamber | Life Imaging Services (Basel, Switzerland) | 10920 | Ludin Chamber Type 3 for Ø12mm coverslips |
| laser scanning confocal microscope, microscope | Leica | DMI6000 | |
| laser scanning confocal microscope, scanning unit | Leica | SP8 | |
| peristaltic pump | VWR | PP1080 181-4001 | |
| spinning disc confocal microscope, camera | Hamamatsu | C9100-02 EMCCD | |
| spinning disc confocal microscope, incubationsystem | TokaiHit | INU-ZILCF-F1 | |
| spinning disc confocal microscope, microscope | Nikon | Ti microscope | |
| spinning disc confocal microscope, scanning unit | Yokagawa | CSU-X1 | |
| software | |||
| FIJI | https://fiji.sc | ||
| StackReg plugin | https://github.com/fiji-BIG/StackReg/blob/master/src/main/java/StackReg_.java | ||
| TurboReg plugin | https://github.com/fiji-BIG/TurboReg/blob/master/src/main/java/TurboReg_.java |
References
- Roede, J. R., Go, Y. M., Jones, D. P. Redox equivalents and mitochondrial bioenergetics. Methods in Molecular Biology. 810, 249-280 (2012).
- Turrens, J. F. Mitochondrial formation of reactive oxygen species. Journal of Physiology. 552, 335-344 (2003).
- Lin, M. T., Beal, M. F. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases. Nature. 443 (7113), 787-795 (2006).
- Manfredi, G., Beal, M. F. The role of mitochondria in the pathogenesis of neurodegenerative diseases. Brain Pathology. 10 (3), 462-472 (2000).
- Mari, M., Morales, A., Colell, A., Garcia-Ruiz, C., Fernandez-Checa, J. C. Mitochondrial glutathione, a key survival antioxidant. Antioxidants & Redox Signaling. 11 (11), 2685-2700 (2009).
- Murphy, M. P. Mitochondrial thiols in antioxidant protection and redox signaling: distinct roles for glutathionylation and other thiol modifications. Antioxidants & Redox Signaling. 16 (6), 476-495 (2012).
- Dooley, C. T., et al. Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators. Journal of Biological Chemistry. 279 (21), 22284-22293 (2004).
- Hanson, G. T., et al. Investigating mitochondrial redox potential with redox-sensitive green fluorescent protein indicators. Journal of Biological Chemistry. 279 (13), 13044-13053 (2004).
- Gutscher, M., et al. Real-time imaging of the intracellular glutathione redox potential. Nature Methods. 5 (6), 553-559 (2008).
- Morgan, B., Sobotta, M. C., Dick, T. P. Measuring E(GSH) and H2O2 with roGFP2-based redox probes. Free Radical Biology & Medicine. 51 (11), 1943-1951 (2011).
- Marwick, K. F. M., Hardingham, G. E. Transfection in primary cultured neuronal cells. Methods in Molecular Biology. 1677, 137-144 (2017).
- Kohrmann, M., et al. convenient, and effective method to transiently transfect primary hippocampal neurons. Journal of Neuroscience Research. 58 (6), 831-835 (1999).
- Depp, C., Bas-Orth, C., Schroeder, L., Hellwig, A., Bading, H. Synaptic activity protects neurons against calcium-mediated oxidation and contraction of mitochondria during excitotoxicity. Antioxidants & Redox Signaling. 29 (12), 1109-1124 (2018).
- Hauck, B., Chen, L., Xiao, W. Generation and characterization of chimeric recombinant AAV vectors. Molecular Therapy. 7 (3), 419-425 (2003).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
- Zhang, S. J., et al. Nuclear calcium signaling controls expression of a large gene pool: identification of a gene program for acquired neuroprotection induced by synaptic activity. PLoS Genetics. 5 (8), 1000604 (2009).
- Winterbourn, C. C. The challenges of using fluorescent probes to detect and quantify specific reactive oxygen species in living cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (2), 730-738 (2014).
- Sies, H. Oxidative stress: a concept in redox biology and medicine. Redox Biology. 4, 180-183 (2015).
- Lukyanov, K. A., Belousov, V. V. Genetically encoded fluorescent redox sensors. Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (2), 745-756 (2014).
- Nietzel, T., et al. Redox-mediated kick-start of mitochondrial energy metabolism drives resource-efficient seed germination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 741-751 (2020).
- Albrecht, S. C., et al. Redesign of genetically encoded biosensors for monitoring mitochondrial redox status in a broad range of model eukaryotes. Journal of Biomolecular Screening. 19 (3), 379-386 (2014).
- Albrecht, S. C., Barata, A. G., Grosshans, J., Teleman, A. A., Dick, T. P. In vivo mapping of hydrogen peroxide and oxidized glutathione reveals chemical and regional specificity of redox homeostasis. Cell Metabolism. 14 (6), 819-829 (2011).
- Breckwoldt, M. O., et al. Multiparametric optical analysis of mitochondrial redox signals during neuronal physiology and pathology in vivo. Nature Medicine. 20 (5), 555-560 (2014).
- Ricke, K. M., et al. Mitochondrial dysfunction combined with high calcium load leads to impaired antioxidant defense underlying the selective loss of nigral dopaminergic neurons. Journal of Neuroscience. 40 (9), 1975-1986 (2020).
- Bjornberg, O., Ostergaard, H., Winther, J. R. Mechanistic insight provided by glutaredoxin within a fusion to redox-sensitive yellow fluorescent protein. Biochemistry. 45 (7), 2362-2371 (2006).
- Shokhina, A. G., et al. Red fluorescent redox-sensitive biosensor Grx1-roCherry. Redox Biology. 21, 101071 (2019).
