Summary

Imagem ao vivo do Estado De Glutathione Mitocondrial Redox em Neurônios Primários usando um Indicador Ratiométrico

Published: October 20, 2021
doi:

Summary

Este artigo descreve um protocolo para determinar diferenças no estado basal redox e respostas redox a perturbações agudas em neurônios hipocampais primários e corticais usando microscopia viva confocal. O protocolo pode ser aplicado a outros tipos de células e microscópios com modificações mínimas.

Abstract

A homeostase mitocondrial redox é importante para a viabilidade e a função neuronais. Embora as mitocôndrias contenham vários sistemas redox, a glutothione tampão de tiool-dissulfeto altamente abundante é considerada um jogador central em defesas antioxidantes. Portanto, medir o potencial mitocondrial glutatione redox fornece informações úteis sobre o status de redox mitocondrial e estresse oxidativo. Glutaredoxin1-roGFP2 (Grx1-roGFP2) é um indicador proporção de proporção geneticamente codificado e verde (GFP) do potencial de glutathione redox que tem dois picos de excitação sensíveis ao estado-redox a 400 nm e 490 nm com um único pico de emissão de 510 nm. Este artigo descreve como realizar microscopia ao vivo confocal de Grx1-roGFP2 com destino a mitocôndrias em neurônios hipocampais e corticais primários. Descreve como avaliar o potencial de glutationo mitocondrial de estado estável (por exemplo, comparar estados da doença ou tratamentos de longo prazo) e como medir as alterações de redox em tratamentos agudos (usando a droga excitotóxica N-metil-D-aspartate (NMDA) como exemplo). Além disso, o artigo apresenta co-imagem de Grx1-roGFP2 e o indicador potencial da membrana mitocondrial, tetrametilrhodamina, éster etílico (TMRE), para demonstrar como o Grx1-roGPF2 pode ser multiplexado com indicadores adicionais para análises multiparamétricas. Este protocolo fornece uma descrição detalhada de como (i) otimizar as configurações do microscópio de varredura a laser confocal, (ii) aplicar medicamentos para estimulação seguido de calibração de sensores com diamide e dithiothreitol, e (iii) analisar dados com ImageJ/FIJI.

Introduction

Várias enzimas mitocondriais importantes e moléculas de sinalização estão sujeitas à regulação de thiol redox1. Além disso, as mitocôndrias são uma grande fonte celular de espécies reativas de oxigênio e são seletivamente vulneráveis a danos oxidativos2. Assim, o potencial mitocondrial redox afeta diretamente bioenergésicos, sinalização celular, função mitocondrial e, finalmente, viabilidade celular3,4. A matriz mitocondrial contém altas quantidades (1-15 mM) da glutationa tampão de tampo de tiol-dissulfeto (GSH) para manter a homeostase redox e montar defesas antioxidantes5,6. O GSH pode ser covalentemente ligado a proteínas-alvo (S-glutathionylation) para controlar seu status e atividade redox e é usado por uma gama de enzimas desintoxificantes que reduzem proteínas oxidadas. Portanto, o potencial mitocondrial glutathione redox é um parâmetro altamente informativo ao estudar a função mitocondrial e a fisiopatologia.

roGFP2 é uma variante de GFP que foi tornada sensível ao redox pela adição de dois cisteínas expostas à superfície que formam um par de dithiol-dissulfeto artificial7,8. Tem um único pico de emissão em ~510 nm e dois picos de excitação em ~400 nm e 490 nm. É importante ressaltar que as amplitudes relativas dos dois picos de excitação dependem do estado redox do roGFP2 (Figura 1), tornando esta proteína um sensor ratiométrico. No sensor Grx1-roGFP2, a glutaredoxina humana-1 (Grx1) foi fundida ao N-terminus de roGFP29,10. O acessório covalent da enzima Grx1 ao roGFP2 proporciona duas grandes melhorias do sensor: torna a resposta do sensor específica para o par de glutationa redox GSH/GSSG (Figura 1), e acelera o equilíbrio entre GSSG e roGFP2 por um fator de pelo menos 100.0009. Portanto, o Grx1-roGFP2 permite imagens específicas e dinâmicas do potencial de glutationa celular redox.

As imagens grx1-roGFP2 podem ser realizadas em uma ampla gama de microscópios, incluindo microscópios de fluorescência de campo largo, microscópios confocal de disco giratório e microscópios confocal de varredura a laser. A expressão do sensor nos neurônios primários pode ser alcançada por vários métodos que incluem lipofecção11, coprecipitação de DNA/cálcio-fosfato12, transferência genética mediada por vírus ou uso de animais transgênicos como fonte celular (Figura 2). Vírus adeno associados a adeninantes pseudotipados (rAAV) contendo uma razão de 1:1 de proteínas capsidas AAV1 e AAV2 13,14 foram utilizados para os experimentos neste artigo. Com este vetor, a expressão do sensor máximo é tipicamente atingida de 4 a 5 dias após a infecção e permanece estável por pelo menos duas semanas. Usamos com sucesso Grx1-roGFP2 em neurônios hipocampais e corticais primários de ratos e ratos.

Neste artigo, a expressão mediada por rAAV de Grx1-roGFP2 com metas de mitocôndrias em neurônios hipocampais e corticais de ratos primários é usada para avaliar o estado de glutationa mitocondrial basal e sua perturbação aguda. Um protocolo é fornecido para imagens ao vivo confocal com instruções detalhadas sobre como (i) otimizar as configurações do microscópio confocal de varredura a laser, (ii) executar um experimento de imagem ao vivo e (iii) analisar dados com FIJI.

Protocol

Todos os experimentos em animais se conformaram com as diretrizes nacionais e institucionais, incluindo a Diretiva do Conselho 2010/63/UE do Parlamento Europeu, e tiveram aprovação ética plena do Home Office (Escritório de Bem-Estar Animal da Universidade de Heidelberg e Regierungspraesidium Karlsruhe, licenças T14/21 e T13/21). Os neurônios hipocampais primários e corticais foram preparados a partir de filhotes de camundongos recém-nascidos ou ratos de acordo com os procedimentos padrão e foram mantidos por 12-…

Representative Results

Quantificação das diferenças no estado vermelho mitocondrial de estado estável após a retirada do fator de crescimentoPara demonstrar a quantificação das diferenças de estado estável no estado redox mitocondrial, os neurônios primários cultivados no meio padrão foram comparados aos neurônios cultivados sem fatores de crescimento por 48 horas antes da imagem. A retirada do fator de crescimento resulta em morte celular neuronal apoptóltica após 72 h16. As células…

Discussion

Medições quantitativas e dinâmicas do estado mitocondrial redox fornecem informações importantes sobre fisiologia mitocondrial e celular. Várias sondas químicas fluorogênicas estão disponíveis que detectam espécies reativas de oxigênio, “estresse redox” ou “estresse oxidativo”. No entanto, os últimos termos não são bem definidos e muitas vezes carecem de especificidade9,17,18. Em comparação com os corantes quím…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pela Deutsche Forschungsgemeinschaft (BA 3679/5-1; PARA 2289: BA 3679/4-2). A.K. é apoiada por uma bolsa ERASMUS+. Agradecemos a Iris Bünzli-Ehret, Rita Rosner e Andrea Schlicksupp pela preparação dos neurônios primários. Agradecemos ao Dr. Tobias Dick por fornecer pLPCX-mito-Grx1-roGFP2. Experimentos mostrados na Figura 4 foram realizados no Nikon Imaging Center, Universidade de Heidelberg. A Figura 2 foi preparada com BioRender.com.

Materials

reagents
Calcium chloride (CaCl2·2H2O) Sigma-Aldrich C3306
Diamide (DA) Sigma-Aldrich D3648
Dithiothreitol (DTT) Carl Roth GmbH 6908.1
Glucose (2.5 M stock solution) Sigma-Aldrich G8769
Glucose Sigma-Aldrich G7528
Glycine neoFroxx GmbH LC-4522.2
HEPES (1 M stock solution) Sigma-Aldrich 15630-080
HEPES Sigma-Aldrich H4034
Magnesium chloride (MgCl2·6H2O) Sigma-Aldrich 442611-M
N-methyl-D-aspartate (NMDA) Sigma-Aldrich M3262
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P3911
Sodium chloride (NaCl) neoFroxx GmbH LC-5932.1
Sodium pyruvate (0.1 M stock solution) Sigma-Aldrich S8636
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich P8574
Sucrose Carl Roth GmbH 4621.1
Tetramethylrhodamine ethyl ester perchlorate (TMRE) Sigma-Aldrich 87917
equipment
imaging chamber Life Imaging Services (Basel, Switzerland) 10920 Ludin Chamber Type 3 for Ø12mm coverslips
laser scanning confocal microscope, microscope Leica DMI6000
laser scanning confocal microscope, scanning unit Leica SP8
peristaltic pump VWR PP1080 181-4001
spinning disc confocal microscope, camera Hamamatsu C9100-02 EMCCD
spinning disc confocal microscope, incubationsystem TokaiHit INU-ZILCF-F1
spinning disc confocal microscope, microscope Nikon Ti microscope
spinning disc confocal microscope, scanning unit Yokagawa CSU-X1
software
FIJI https://fiji.sc
StackReg plugin https://github.com/fiji-BIG/StackReg/blob/master/src/main/java/StackReg_.java
TurboReg plugin https://github.com/fiji-BIG/TurboReg/blob/master/src/main/java/TurboReg_.java

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Katsalifis, A., Casaril, A. M., Depp, C., Bas-Orth, C. Live Imaging of the Mitochondrial Glutathione Redox State in Primary Neurons using a Ratiometric Indicator. J. Vis. Exp. (176), e63073, doi:10.3791/63073 (2021).

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