Live imaging van de mitochondriale glutathion redoxtoestand in primaire neuronen met behulp van een ratiometrische indicator
Summary
Dit artikel beschrijft een protocol om verschillen in basale redoxtoestand en redoxresponsen op acute verstoringen in primaire hippocampus- en corticale neuronen te bepalen met behulp van confocale levende microscopie. Het protocol kan met minimale aanpassingen worden toegepast op andere celtypen en microscopen.
Abstract
Mitochondriale redox homeostase is belangrijk voor neuronale levensvatbaarheid en functie. Hoewel mitochondriën verschillende redoxsystemen bevatten, wordt de zeer overvloedige thiol-disulfide redoxbuffer glutathion beschouwd als een centrale speler in de antioxidantafweer. Daarom levert het meten van het mitochondriale glutathion redoxpotentiaal nuttige informatie op over mitochondriale redoxstatus en oxidatieve stress. Glutaredoxine1-roGFP2 (Grx1-roGFP2) is een genetisch gecodeerde, op groen fluorescerend eiwit (GFP) gebaseerde ratiometrische indicator van de glutathion redoxpotentiaal die twee redoxtoestandsgevoelige excitatiepieken heeft bij 400 nm en 490 nm met een enkele emissiepiek bij 510 nm. Dit artikel beschrijft hoe confocale levende microscopie van mitochondria-gerichte Grx1-roGFP2 in primaire hippocampale en corticale neuronen kan worden uitgevoerd. Het beschrijft hoe steady-state mitochondriaal glutathion redoxpotentieel kan worden beoordeeld (bijvoorbeeld om ziektetoestanden of langetermijnbehandelingen te vergelijken) en hoe redoxveranderingen bij acute behandelingen kunnen worden gemeten (met behulp van het excitotoxische medicijn N-methyl-D-aspartaat (NMDA) als voorbeeld). Daarnaast presenteert het artikel co-imaging van Grx1-roGFP2 en de mitochondriale membraanpotentiaalindicator, tetramethylrhodamine, ethylester (TMRE), om aan te tonen hoe Grx1-roGPF2 kan worden gemultiplext met aanvullende indicatoren voor multiparametrische analyses. Dit protocol biedt een gedetailleerde beschrijving van hoe (i) confocale laserscanmicroscoopinstellingen kunnen worden geoptimaliseerd, (ii) geneesmiddelen voor stimulatie kunnen worden toegepast gevolgd door sensorkalibratie met diamide en dithiothreitol, en (iii) gegevens kunnen worden geanalyseerd met ImageJ / FIJI.
Introduction
Verschillende belangrijke mitochondriale enzymen en signaalmoleculen zijn onderhevig aan thiol redox regulatie1. Bovendien zijn mitochondriën een belangrijke cellulaire bron van reactieve zuurstofsoorten en zijn ze selectief kwetsbaar voor oxidatieve schade2. Dienovereenkomstig heeft het mitochondriale redoxpotentiaal direct invloed op bio-energetica, celsignalering, mitochondriale functie en uiteindelijk de levensvatbaarheid van cellen3,4. De mitochondriale matrix bevat grote hoeveelheden (1-15 mM) van de thiol-disulfide redoxbuffer glutathion (GSH) om de redoxhomeostase te behouden en de antioxidantafweer te versterken5,6. GSH kan covalent worden gehecht aan doeleiwitten (S-glutathionylatie) om hun redoxstatus en -activiteit te beheersen en wordt gebruikt door een reeks ontgiftende enzymen die geoxideerde eiwitten verminderen. Daarom is de mitochondriale glutathion redoxpotentiaal een zeer informatieve parameter bij het bestuderen van mitochondriale functie en pathofysiologie.
roGFP2 is een variant van GFP die redoxgevoelig is gemaakt door de toevoeging van twee aan het oppervlak blootgestelde cysteines die een kunstmatig dithiol-disulfidepaar vormen7,8. Het heeft een enkele emissiepiek bij ~ 510 nm en twee excitatiepieken bij ~ 400 nm en 490 nm. Belangrijk is dat de relatieve amplitudes van de twee excitatiepieken afhankelijk zijn van de redoxtoestand van roGFP2 (figuur 1), waardoor dit eiwit een ratiometrische sensor is. In de Grx1-roGFP2-sensor is humaan glutaredoxine-1 (Grx1) gefuseerd met het N-eindpunt van roGFP29,10. Covalente hechting van het Grx1-enzym aan roGFP2 biedt twee belangrijke verbeteringen van de sensor: het maakt de sensorrespons specifiek voor het GSH / GSSG glutathion redoxpaar (figuur 1) en het versnelt de evenwichtsbalans tussen GSSG en roGFP2 met een factor van ten minste 100.0009. Daarom maakt Grx1-roGFP2 specifieke en dynamische beeldvorming van het cellulaire glutathion redoxpotentiaal mogelijk.
Grx1-roGFP2-beeldvorming kan worden uitgevoerd op een breed scala aan microscopen, waaronder widefield fluorescentiemicroscopen, confocale microscopen voor draaiende schijven en confocale microscopen voor laserscanning. Expressie van de sensor in primaire neuronen kan worden bereikt door verschillende methoden, waaronder lipofectie11, DNA / calciumfosfaatcoprecipitatie12, virusgemedieerde genoverdracht of gebruik van transgene dieren als celbron (figuur 2). Pseudotypeerde recombinante adeno-geassocieerde virussen (rAAV) met een 1:1 verhouding van AAV1 en AAV2 capsid eiwitten 13,14 werden gebruikt voor de experimenten in dit artikel. Met deze vector wordt de maximale sensorexpressie meestal 4-5 dagen na infectie bereikt en blijft deze gedurende ten minste twee weken stabiel. We hebben Grx1-roGFP2 met succes gebruikt in primaire hippocampus- en corticale neuronen van muizen en ratten.
In dit artikel wordt rAAV-gemedieerde expressie van mitochondria-gerichte Grx1-roGFP2 in primaire hippocampale en corticale neuronen van ratten gebruikt om de basale mitochondriale glutathion redoxtoestand en de acute verstoring ervan te beoordelen. Er is een protocol voor confocale live beeldvorming met gedetailleerde instructies voor het optimaliseren van (i) het optimaliseren van confocale microscoopinstellingen voor laserscannen, (ii) het uitvoeren van een live beeldvormingsexperiment en (iii) het analyseren van gegevens met FIJI.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kwantitatieve en dynamische metingen van de mitochondriale redoxtoestand leveren belangrijke informatie op over mitochondriale en cellulaire fysiologie. Er zijn verschillende fluorogene chemische sondes beschikbaar die reactieve zuurstofsoorten, “redoxstress” of “oxidatieve stress” detecteren. Deze laatste termen zijn echter niet goed gedefinieerd en missen vaak specificiteit9,17,18. In vergelijking met chemische kleurstoffen bi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (BA 3679/5-1; VOOR 2289: BA 3679/4-2). A.K. wordt ondersteund door een ERASMUS+ beurs. We bedanken Iris Bünzli-Ehret, Rita Rosner en Andrea Schlicksupp voor de voorbereiding van primaire neuronen. Wij danken Dr. Tobias Dick voor het leveren van pLPCX-mito-Grx1-roGFP2. De experimenten in figuur 4 werden uitgevoerd in het Nikon Imaging Center van de Universiteit van Heidelberg. Figuur 2 is opgesteld met BioRender.com.
Materials
| reagents | |||
| Calcium chloride (CaCl2·2H2O) | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Diamide (DA) | Sigma-Aldrich | D3648 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Carl Roth GmbH | 6908.1 | |
| Glucose (2.5 M stock solution) | Sigma-Aldrich | G8769 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Glycine | neoFroxx GmbH | LC-4522.2 | |
| HEPES (1 M stock solution) | Sigma-Aldrich | 15630-080 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Magnesium chloride (MgCl2·6H2O) | Sigma-Aldrich | 442611-M | |
| N-methyl-D-aspartate (NMDA) | Sigma-Aldrich | M3262 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Sodium chloride (NaCl) | neoFroxx GmbH | LC-5932.1 | |
| Sodium pyruvate (0.1 M stock solution) | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P8574 | |
| Sucrose | Carl Roth GmbH | 4621.1 | |
| Tetramethylrhodamine ethyl ester perchlorate (TMRE) | Sigma-Aldrich | 87917 | |
| equipment | |||
| imaging chamber | Life Imaging Services (Basel, Switzerland) | 10920 | Ludin Chamber Type 3 for Ø12mm coverslips |
| laser scanning confocal microscope, microscope | Leica | DMI6000 | |
| laser scanning confocal microscope, scanning unit | Leica | SP8 | |
| peristaltic pump | VWR | PP1080 181-4001 | |
| spinning disc confocal microscope, camera | Hamamatsu | C9100-02 EMCCD | |
| spinning disc confocal microscope, incubationsystem | TokaiHit | INU-ZILCF-F1 | |
| spinning disc confocal microscope, microscope | Nikon | Ti microscope | |
| spinning disc confocal microscope, scanning unit | Yokagawa | CSU-X1 | |
| software | |||
| FIJI | https://fiji.sc | ||
| StackReg plugin | https://github.com/fiji-BIG/StackReg/blob/master/src/main/java/StackReg_.java | ||
| TurboReg plugin | https://github.com/fiji-BIG/TurboReg/blob/master/src/main/java/TurboReg_.java |
References
- Roede, J. R., Go, Y. M., Jones, D. P. Redox equivalents and mitochondrial bioenergetics. Methods in Molecular Biology. 810, 249-280 (2012).
- Turrens, J. F. Mitochondrial formation of reactive oxygen species. Journal of Physiology. 552, 335-344 (2003).
- Lin, M. T., Beal, M. F. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases. Nature. 443 (7113), 787-795 (2006).
- Manfredi, G., Beal, M. F. The role of mitochondria in the pathogenesis of neurodegenerative diseases. Brain Pathology. 10 (3), 462-472 (2000).
- Mari, M., Morales, A., Colell, A., Garcia-Ruiz, C., Fernandez-Checa, J. C. Mitochondrial glutathione, a key survival antioxidant. Antioxidants & Redox Signaling. 11 (11), 2685-2700 (2009).
- Murphy, M. P. Mitochondrial thiols in antioxidant protection and redox signaling: distinct roles for glutathionylation and other thiol modifications. Antioxidants & Redox Signaling. 16 (6), 476-495 (2012).
- Dooley, C. T., et al. Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators. Journal of Biological Chemistry. 279 (21), 22284-22293 (2004).
- Hanson, G. T., et al. Investigating mitochondrial redox potential with redox-sensitive green fluorescent protein indicators. Journal of Biological Chemistry. 279 (13), 13044-13053 (2004).
- Gutscher, M., et al. Real-time imaging of the intracellular glutathione redox potential. Nature Methods. 5 (6), 553-559 (2008).
- Morgan, B., Sobotta, M. C., Dick, T. P. Measuring E(GSH) and H2O2 with roGFP2-based redox probes. Free Radical Biology & Medicine. 51 (11), 1943-1951 (2011).
- Marwick, K. F. M., Hardingham, G. E. Transfection in primary cultured neuronal cells. Methods in Molecular Biology. 1677, 137-144 (2017).
- Kohrmann, M., et al. convenient, and effective method to transiently transfect primary hippocampal neurons. Journal of Neuroscience Research. 58 (6), 831-835 (1999).
- Depp, C., Bas-Orth, C., Schroeder, L., Hellwig, A., Bading, H. Synaptic activity protects neurons against calcium-mediated oxidation and contraction of mitochondria during excitotoxicity. Antioxidants & Redox Signaling. 29 (12), 1109-1124 (2018).
- Hauck, B., Chen, L., Xiao, W. Generation and characterization of chimeric recombinant AAV vectors. Molecular Therapy. 7 (3), 419-425 (2003).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
- Zhang, S. J., et al. Nuclear calcium signaling controls expression of a large gene pool: identification of a gene program for acquired neuroprotection induced by synaptic activity. PLoS Genetics. 5 (8), 1000604 (2009).
- Winterbourn, C. C. The challenges of using fluorescent probes to detect and quantify specific reactive oxygen species in living cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (2), 730-738 (2014).
- Sies, H. Oxidative stress: a concept in redox biology and medicine. Redox Biology. 4, 180-183 (2015).
- Lukyanov, K. A., Belousov, V. V. Genetically encoded fluorescent redox sensors. Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (2), 745-756 (2014).
- Nietzel, T., et al. Redox-mediated kick-start of mitochondrial energy metabolism drives resource-efficient seed germination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 741-751 (2020).
- Albrecht, S. C., et al. Redesign of genetically encoded biosensors for monitoring mitochondrial redox status in a broad range of model eukaryotes. Journal of Biomolecular Screening. 19 (3), 379-386 (2014).
- Albrecht, S. C., Barata, A. G., Grosshans, J., Teleman, A. A., Dick, T. P. In vivo mapping of hydrogen peroxide and oxidized glutathione reveals chemical and regional specificity of redox homeostasis. Cell Metabolism. 14 (6), 819-829 (2011).
- Breckwoldt, M. O., et al. Multiparametric optical analysis of mitochondrial redox signals during neuronal physiology and pathology in vivo. Nature Medicine. 20 (5), 555-560 (2014).
- Ricke, K. M., et al. Mitochondrial dysfunction combined with high calcium load leads to impaired antioxidant defense underlying the selective loss of nigral dopaminergic neurons. Journal of Neuroscience. 40 (9), 1975-1986 (2020).
- Bjornberg, O., Ostergaard, H., Winther, J. R. Mechanistic insight provided by glutaredoxin within a fusion to redox-sensitive yellow fluorescent protein. Biochemistry. 45 (7), 2362-2371 (2006).
- Shokhina, A. G., et al. Red fluorescent redox-sensitive biosensor Grx1-roCherry. Redox Biology. 21, 101071 (2019).
