Imágenes en vivo del estado redox de glutatión mitocondrial en neuronas primarias utilizando un indicador ratiométrico

Varias enzimas mitocondriales importantes y moléculas de señalización están sujetas a la regulación tiol ^redox1. Además, las mitocondrias son una fuente celular importante de especies reactivas de oxígeno y son selectivamente vulnerables al daño ^oxidativo2. En consecuencia, el potencial redox mitocondrial afecta directamente a la bioenergética, la señalización celular, la función mitocondrial y, en última instancia, la viabilidad ^celular3,4. La matriz mitocondrial contiene altas cantidades (1-15 mM) del tampón tiol-disulfuro redox glutatión (GSH) para mantener la homeostasis redox y montar defensas ^{antioxidantes5,6}. El GSH se puede unir covalentemente a las proteínas diana (S-glutationilación) para controlar su estado y actividad redox y es utilizado por una variedad de enzimas desintoxicantes que reducen las proteínas oxidadas. Por lo tanto, el potencial redox de glutatión mitocondrial es un parámetro altamente informativo cuando se estudia la función mitocondrial y la fisiopatología.

roGFP2 es una variante de GFP que se ha hecho sensible a la redox mediante la adición de dos cisteínas expuestas a la superficie que forman un par artificial de ditiol-disulfuro7,8. Tiene un solo pico de emisión a ~510 nm y dos picos de excitación a ~400 nm y 490 nm. Es importante destacar que las amplitudes relativas de los dos picos de excitación dependen del estado redox de roGFP2 (Figura 1), lo que convierte a esta proteína en un sensor ratiométrico. En el sensor Grx1-roGFP2, la glutaredoxina-1 humana (Grx1) se ha fusionado con el extremo N de roGFP29,10. La unión covalente de la enzima Grx1 a roGFP2 ofrece dos mejoras importantes del sensor: hace que la respuesta del sensor sea específica para el par redox de glutatión GSH / GSSG (Figura 1), y acelera el equilibrio entre GSSG y roGFP2 en un factor de al menos 100,0009. Por lo tanto, Grx1-roGFP2 permite obtener imágenes específicas y dinámicas del potencial redox del glutatión celular.

Las imágenes Grx1-roGFP2 se pueden realizar en una amplia gama de microscopios, incluidos los microscopios de fluorescencia de campo amplio, los microscopios confocales de disco giratorio y los microscopios confocales de barrido láser. La expresión del sensor en las neuronas primarias se puede lograr mediante varios métodos que incluyen ^{lipofección11}, coprecipitación ADN/^{calcio-fosfato12}, transferencia de genes mediada por virus o uso de animales transgénicos como fuente celular (Figura 2). Para los experimentos de este artículo se utilizaron virus adenoasociados recombinantes pseudotipados (rAAV) que contienen una proporción de 1:1 de proteínas de la cápside ^AAV1 y AAV2 ^13,14. Con este vector, la máxima expresión del sensor se alcanza típicamente 4-5 días después de la infección y se mantiene estable durante al menos dos semanas. Hemos utilizado con éxito Grx1-roGFP2 en neuronas primarias del hipocampo y cortical de ratones y ratas.

En este artículo, la expresión mediada por rAAV de Grx1-roGFP2 dirigida a mitocondrias en neuronas primarias del hipocampo y cortical de rata se utiliza para evaluar el estado redox de glutatión mitocondrial basal y su perturbación aguda. Se proporciona un protocolo para imágenes confocales en vivo con instrucciones detalladas sobre cómo (i) optimizar la configuración del microscopio confocal de escaneo láser, (ii) ejecutar un experimento de imágenes en vivo y (iii) analizar datos con FIJI.