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Biology

Isolierung und Kultur von primären oralen Keratinozyten aus dem erwachsenen Mausgaumen

Published: September 24, 2021
doi:
10.3791/62820
, , , , , ,
1Life Science Center for Survival Dynamics, Tsukuba Advanced Research Alliance (TARA),University of Tsukuba, 2Ph.D. Program in Human Biology, School of Integrative and Global Majors,University of Tsukuba, 3International Research Center for Medical Sciences (IRCMS),Kumamoto University, 4Division of Biomimetics, Faculty of Dentistry and Graduate School of Medical and Dental Sciences,Niigata University, 5Faculty of Medicine,University of Tsukuba

Summary

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Isolierung und Kultur von oralen Keratinozyten aus dem erwachsenen Mausgaumen. Eine Bewertungsmethode unter Verwendung von Immunfärbung wird ebenfalls berichtet.

Abstract

Seit Jahren werden die meisten Studien mit Keratinozyten mit epidermalen Keratinozyten aus menschlicher und Maushaut durchgeführt. In letzter Zeit haben orale Keratinozyten aufgrund ihrer einzigartigen Funktion und Eigenschaften Aufmerksamkeit erregt. Sie erhalten die Homöostase des oralen Epithels und dienen als Ressourcen für Anwendungen in regenerativen Therapien. In-vitro-Studien, die orale primäre Keratinozyten von erwachsenen Mäusen verwenden, waren jedoch aufgrund des Fehlens eines effizienten und gut etablierten Kulturprotokolls begrenzt. Hier wurden orale primäre Keratinozyten aus dem Gaumengewebe erwachsener Mäuse isoliert und in einem kommerziellen kalziumarmen Medium kultiviert, das mit einem Chelexed-Serum ergänzt wurde. Unter diesen Bedingungen wurden Keratinozyten in einem proliferativen oder stammzellähnlichen Zustand gehalten und ihre Differenzierung wurde auch nach erhöhten Passagen gehemmt. Die Markerexpressionsanalyse zeigte, dass die kultivierten oralen Keratinozyten die Basalzellmarker p63, K14 und α6-Integrin exprimierten und für den Differenzierungsmarker K13 und den Fibroblastenmarker PDGFRα negativ waren. Diese Methode produzierte lebensfähige und kultivierbare Zellen, die für nachgeschaltete Anwendungen bei der Untersuchung oraler epithelialer Stammzellfunktionen in vitro geeignet sind.

Introduction

Das orale Epithel dient als erste Barriere beim Schutz des Körpers vor Umweltbelastungen, einschließlich chemischer oder physikalischer Schäden und bakterieller und viraler Infektionen1,2. Die Mundschleimhaut besteht aus einer äußeren Schicht aus geschichtetem Plattenepithel, die aus Keratinozyten und darunter liegendem Bindegewebe besteht, der Lamina propria, die hauptsächlich aus Fibroblasten und der extrazellulären Matrix besteht. Die Mundschleimhaut der Maus kann grob in drei Subtypen unterteilt werden: Kauen (harter Gaumen und Gingiva), spezialisiert (dorsale Zunge) und Auskleidung (Wangenschleimhaut, ventrale Zunge, weicher Gaumen, Lippen) Schleimhaut2,3 (Abbildung 1A). Das orale Epithel ist in der Kau- und Spezialschleimhaut keratinisiert und in der Futterschleimhaut nicht keratinisiert. Trotz seiner anatomischen Lage ähnelt das orale Epithel der Hautepidermis insofern, als es aus dicht gepackten Epithelzellen mit unterschiedlichem Differenzierungsgrad besteht: Basalschichten, die undifferenzierte Zellen enthalten; dornige, körnige und verhornte Schichten, die keratinisiertes Epithel bilden, oder zwischen- und oberflächliche Schichten, die nicht keratinisiertes Epithel bilden4. Transgene Mausmodelle haben die Untersuchung der zellulären und molekularen Merkmale oraler epithelialer Stammzellen in Gaumen, Wangenschleimhaut, Zunge und Gingiva erleichtert5,6,7,8,9,10,11. Die meisten dieser Studien verwendeten jedoch hauptsächlich In-vivo-Mausexperimente. Zellkultursysteme wurden aufgrund fehlender etablierter und effizienter Protokolle typischerweise nicht eingesetzt.

Ein In-vitro-Kultursystem kann für die molekulare und biochemische Analyse von Stammzellregulatoren, zellbasierte Assays und das Wirkstoffscreening eingesetzt werden. Derzeit wurden Protokolle für die Kultur von primären Keratinozyten der Hautepidermis entwickelt, in denen basale Keratinozyten erfolgreich isoliert und für klinische und Forschungszwecke kultiviert werden können12,13,14,15. 1980 zeigten Hennings et al., dass eine niedrige Calciumkonzentration (< 0,09 mM Ca2+) im Kulturmedium die Proliferation erleichterte und die Zellen in einem undifferenzierten Zustand hielt. Ein höherer Kalziumspiegel förderte die Zelldifferenzierung und reduzierte die Proliferation16. In der Folge wurden Kulturmethoden für neonatale und adulte murine epidermale Keratinozyten etabliert und in zahlreichen Mausmodellen mit unterschiedlichem genetischem Hintergrund für In-vitro-Studien umfassend angewendet17,18,19. Obwohl Haut- und Mundepithel gemeinsame Merkmale aufweisen, zeigen sie auch intrinsische Unterschiede, z. B. in ihrem Keratinisierungsstatus, ihrer Fluktuationsrate, Genexpression und Wundheilungsfähigkeit3,11,20,21,22,23,24,25,26.

Obwohl die orale Keratinozytenkultur beim Menschen erfolgreich durchgeführt wurde27,28,29, sind die Veröffentlichungen zur oralen Keratinozytenkultur der Maus30,31,32 aufgrund der geringen Größe des Zielgewebes und der unterschiedlichen Eigenschaften der Zellen im Vergleich zu epidermalen Keratinozyten der Haut begrenzt. Dieses Protokoll beschreibt die Isolations- und Langzeitkulturtechniken von primären oralen Keratinozyten der Maus.

Protocol

Alle Tierversuche wurden gemäß den Richtlinien des Institutional Animal Experiment Committee an der Kumamoto University und der University of Tsukuba durchgeführt. 1. Aufbereitung von Reagenzien und Nährmedien 40 ml Keratinozytenkulturmedium mit 60 μM Calcium und 600 μL antibiotisch-antimykotischer Lösung herstellen. Bereiten Sie 20 ml 0,025% Trypsin und 400 μL antibiotisch-antimykotische Lösung vor. Die Trypsin-Hemmlösung bei Raumtemperatur auftauen und bis zur Anwendung in Schritt 4.1 bei 4 °C aufbewahren.HINWEIS: Das Isolationsreagenz wird für die Gewebeisolierung von fünf Mäusen hergestellt. Zur Herstellung der Kulturmedien werden 500 ml Medium entnommen und 5 ml einer Wachstumsergänzungslösung (siehe Materialtabelle) (im Folgenden als vollständiges Medium bezeichnet) und 20 % Calcium-depletiertes chelexed-fetales Rinderserum (FBS)33 (im Folgenden als chelexed-FBS bezeichnet) zugegeben. 2. Dissektion von Gaumengewebe von erwachsenen Mäusen Opfern Sie eine erwachsene C57BL/6J-Maus (entweder männlich oder weiblich) durch zervikale Luxation in Übereinstimmung mit den Tierschutzvorschriften der Einrichtung. Entfernen Sie die Haare um den Mund mit einem Rasierer. Mit einer Schere, von der Wange in Richtung Kiefer geschnitten, auf beiden Seiten.HINWEIS: Die Maus muss vor dem Opfer betäubt werden. Es wird eine anästhetische Mischung aus Medetomidin, Midazolam und Butorphanol verwendet (siehe Materialtabelle). Verwenden Sie eine Pinzette, um den Mund weit zu öffnen und Blut mit einem Wattestäbchen zu absorbieren. Um den Gaumen zu desinfizieren, wischen Sie die Innenseite des Mundes mit einem Wattestäbchen ab, das 10% Povidon-Jod enthält. Um den Gaumen der Maus zu ernten, verwenden Sie zuerst eine chirurgische Skalpellklinge, um einen Randschnitt in voller Dicke entlang der Gaumenseite der Oberkieferzähne zu machen. Dann sezieren Sie vorsichtig den gesamten Gaumen mit einem Raspatorium.HINWEIS: Ein Raspatorium ist ein Werkzeug, das verwendet wird, um eine mucoperiosteale Klappe anzuheben (siehe Materialtabelle) (Abbildung 1B). Übertragen Sie das Gaumengewebe schnell in ein 15-ml-Röhrchen, das 4 ml vollständiges Medium + antibiotisch-antimykotische Lösung enthält. Bewahren Sie die Gewebe auf Eis auf, bis sie für die Inkubation bereit sind.HINWEIS: Für die Entnahme von mehreren Mäusen können Gaumengewebe bis zu 4 h auf Eis gehalten werden. 3. Vorbehandlung von Gaumengewebe In einer Laminar-Flow-Haube das Gewebe in eine 60-mm-Schale mit 4 ml vollständigem Medium + antibiotisch-antimykotischer Lösung übertragen. Entfernen Sie mit einer kurzen, stumpfen Pinzette und einer Skalpellklinge vorsichtig Blut aus dem Gewebe. Waschen Sie das Taschentuch 10 Mal in einem vollständigen Medium. Übertragen Sie das Gewebe in eine 35-mm-Schale, die 4 ml 0,025% Trypsin + antibiotisch-antimykotische Lösung enthält, wobei die Epitheloberfläche nach unten zeigt.HINWEIS: Die Epitheloberfläche, die sich nach innen krümmt, sollte in der Trypsinlösung getränkt werden; die Lamina propria sollte nach oben zeigen. Das Gewebe sollte so weit wie möglich abgeflacht werden, um vollständig in der Trypsinlösung inkubiert zu werden. Inkubieren Sie Gewebe in 0,025% Trypsin für ~ 16 h bei Raumtemperatur in der Kulturhaube. 4. Entnahme und Kultur von Primärzellen Mit einer stumpfen Pinzette das Gewebe aus der Trypsinlösung (in der 35-mm-Schale) entfernen und in einer 60-mm-Schale (4 ml pro Schale) mit der Epitheloberfläche nach oben in trypsininhaltige Lösung überführen. Mit einer Pinzette, um sich am Gaumenrand festzuhalten, kratzen Sie die Epithelschicht vorsichtig mit einer Skalpellklinge von der darunter liegenden Lamina propria ab.HINWEIS: Bindegewebe wird von Trypsin nicht verdaut, so dass es sich während des Schabens nicht ablöst. Um die maximale Menge an Epithelzellen aus Geweben zu sammeln, übertragen Sie das Gewebe in eine andere 60-mm-Schale mit 4 ml vollständigem Medium und wiederholen Sie den Kratzschritt.HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Sie das Gewebe nicht mit der Spitze der Klinge abkratzen. Verwenden Sie stattdessen die Klingenkante. Scraping wird für 5-10 min pro Gewebe durchgeführt. Legen Sie ein steriles 100 μm Zellsieb auf die Oberseite eines 50 ml konischen Röhrchens. Mit einer sterilen Pipette werden 2 ml Trypsinlösung (aus Schritt 4.1) in das Sieb gegeben, um seine Oberfläche zu benetzen. Mit einer Pipette die Zellsuspension in der 60-mm-Schale (aus den Schritten 4.2-4.3) einige Male mischen und die Zellen durch das in den Schritten 4.4-4.5 vorbereitete 100 μm Zellsieb filtrieren. Zählen Sie die Anzahl der Zellen mit einem Hämozytometer. 15 μL Trypanblaulösung zubereiten und 15 μL Zellsuspension zugeben (Schritt 4.6). Übertragen Sie 10 μL der Zell-Trypan-Blau-Mischung auf ein Hämozytometer und zählen Sie die Anzahl der Zellen.HINWEIS: Ein Stück Mausgaumen kann bis zu 1 Million Zellen ergeben. Während der Zählung das Röhrchen (ab Schritt 4.6) bei 100 x g für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren. Aspirieren Sie den Überstand mit einer Pipette. Geben Sie 2 ml komplettes Medium + Chelexed-FBS in die Röhre. Resuspendieren Sie das Zellpellet, indem Sie es mehrmals mit einer 5 ml Pipette verdreinigen. Platte 2-5 x 105 Zellen von einer Maus in eine Vertiefung einer 24-Well-Platte, die mit Kollagen Typ I vorbeschichtet ist (siehe Materialtabelle). Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C für 2 Tage, ohne das Medium zu wechseln. Ersetzen Sie zwei Tage nach der Aussaat die Hälfte des Kulturmediums durch das komplette Medium + chelexed-FBS. Überprüfen Sie die Zellmorphologie unter dem Mikroskop. Füttern Sie Zellen mit komplettem Medium + chelexed-FBS alle 2 Tage.HINWEIS: Nach dem Seeding werden Zellen unterschiedlicher Größe beobachtet. Etwa 3-5 Tage nach der Aussaat können Keratinozyten mit einer Kopfsteinpflastermorphologie (Abbildung 2) beobachtet werden. Es dauert 1-2 Wochen der Kultur, bevor die erste Passage durchgeführt werden kann, und weitere 1-2 Wochen sind notwendig, bevor die Zellen für die zweite und dritte Passage bereit sind. Danach wachsen die Zellen schneller und können für die Kryokonservierung vorbereitet werden. Zellen können zu einer Vertiefung (einer 24-Well-Platte) und einer 6-Well-Platte in der ersten bzw. zweiten Passage umplattet werden. Die nachfolgende Passage hängt vom Zellwachstum und der Zelldichte ab. Ein Zellteilungsverhältnis von 1:2 oder 1:3 kann nach der dritten Passage verwendet werden. 5. Keratinozyten-Passage 2 ml des Überstandes aus der Kulturschale entnehmen und in ein 15 mL konisches Röhrchen (auf Eis) dosieren. Waschen Sie die Zellen zweimal mit sterilem 1x PBS.HINWEIS: Wenn die Zellen eine Konfluenz von etwa 70% -80% erreichen, sind sie bereit für die Passage. Geben Sie 1 ml 0,05% Trypsin-EDTA in die Schüssel in die eine Vertiefung eines 6-Well-Tellers. 5-15 min bei 37 °C inkubieren; Überprüfen Sie nach 5 Minuten, ob sich die Zellen von der Schale lösen. Neutralisieren Sie die Reaktion mit 1 ml Trypsin-Hemmlösung und 2 mL vollständigem Kulturmedium + Chelexed-FBS durch schonendes Pipettieren. Als nächstes wird die Zellsuspension in das gleiche konische 15-ml-Rohr wie in Schritt 5.1 überführt. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 100 x g für 5 min bei 4 °C. Den Überstand mit einer Pipette ansaugen und das Zellpellet in 1 ml vollständigem Kulturmedium resuspendieren. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer. Als nächstes platten 1 ml der Zellsuspension in eine neue 24- oder 6-Well-Kulturplatte.HINWEIS: Einige der Zellen aus den frühen Passagen können in einer Mischung aus 70% vollständigem Kulturmedium + 20% Chelexed-FBS + 10% DMSO eingefroren werden. 1-2 Kryovolen von Zellen können aus einer konfluenten Kulturplatte gesammelt werden. 6. Kryokonservierung und Wiederherstellung von Keratinozyten Einfrieren von Zellen Wachsen Sie Keratinozyten auf 80% -90% Konfluenz.HINWEIS: Lassen Sie zellen nicht überwachsen, da dies ihren Proliferationsstatus und ihre Lebensfähigkeit verringern könnte. Behandeln Sie die Keratinozyten in der Schale mit 0,05% Trypsin-EDTA, wie in den Schritten 5.1-5.5 beschrieben. Zählen Sie die Keratinozyten mit einem Hämozytometer. Bereiten Sie Kryoviale basierend auf berechneten Zellzahlen vor, um die Übertragung von 1 x 106 Zellen/ml auf jede Durchstechflasche zu ermöglichen. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 100 x g für 5 min bei 4 °C. Verwerfen Sie den Überstand und resuspenieren Sie das Zellpellet in einer 10 mL Lösung von 10% DMSO + 20% Chelexed-FBS + 70% vollständiges Kulturmedium (9 ml komplettes Medium + Chelexed-FBS und 1 mL DMSO). Geben Sie die Zellen mit 1 ml Suspension pro Durchstechflasche in Kryoviale ab. Legen Sie die Fläschchen über Nacht bei -80 °C in einen kryogenen Vorratsbehälter. Die Fläschchen am nächsten Tag in einen Flüssigstickstofftank geben. Zellrückgewinnung Entfernen Sie ein Kryovial aus dem Flüssigstickstofftank und tauen Sie bei Raumtemperatur teilweise auf. Mischen Sie in einem 15-ml-Röhrchen 1 ml der Zellsuspension mit 3 mL vollständigem Kulturmedium + chelexed-FBS. Zentrifugieren Sie die Mischung für 5 min bei 100 x g und 4 °C. Verwerfen Sie den Überstand und resuspenieren Sie das Pellet in 1 ml vollständigem Kulturmedium + chelexed-FBS. Die Zellsuspensionen in neue 60 mm Collagen I-beschichtete Kulturschalen geben. Ersetzen Sie das Kulturmedium alle 2-3 Tage und passieren Sie die Zellen, sobald sie konfluent sind. 7. Immunfluoreszenzfärbung Kultur orale Keratinozyten auf quadratischen Deckgläsern (22 mm x 22 mm) in 6-Well-Platten (5 x 105 Zellen/Well) für 2 Tage. Keratinozyten in einer Lösung aus 4% Paraformaldehyd (PFA) und PBS für 20 min bei Raumtemperatur fixieren, bevor Sie dreimal mit 1x PBS waschen. Permeabilisieren Sie Zellen in einer Lösung von 0,1% Triton in PBS. Inkubieren Sie Zellen in blockierendem Reagenz (2,5% Ziegenserum, 2,5% Eselserum) für 1 h bei Raumtemperatur, gefolgt von einer nächtlichen Inkubation mit primären Antikörpern (siehe Materialtabelle) bei 4 °C.ANMERKUNG: Primäre Antikörper wurden in den folgenden Verdünnungen verwendet: Kaninchen-Anti-K14 (1:1000), Ratten-α6-Integrin (1:100), Kaninchen-Anti-P63 (1:500), Kaninchen-Anti-K13 (1:100) und Ziegen-Anti-PDGFRα (1:100). Waschen Sie die Proben in einer Lösung von 0,1% Triton in PBS, gefolgt von einer Inkubation mit sekundären Antikörpern für 1 h bei Raumtemperatur.HINWEIS: Die sekundären Antikörper (Alexa 488 oder 555) wurden bei einer Verdünnung von 1:300 verwendet. Halten Sie alle Proben mit Hoechst-Lösung für 10 min auf und montieren Sie die Zellen auf Glasobjektträger.HINWEIS: Hoechst-Lösung wird verwendet, um die Zellkerne von Zellen zu färben. Führen Sie Eine Probenbildgebung mit einem konfokalen Mikroskop durch.HINWEIS: Helligkeit und Kontrast werden mit einer Bildbearbeitungssoftware auf gleiche Intensität eingestellt.

Representative Results

Überblick über den Dissektionsprozess und die Isolierung oraler Keratinozyten aus dem adulten MausgaumenDissoziierte orale Keratinozyten wurden aus dem Gaumen der erwachsenen Maus entnommen und in einem maßgeschneiderten 20% Chelexed-FBS kultiviert. Der Mausgaumen besteht aus dem harten Gaumen und dem weichen Gaumen (Abbildung 1C). Das Verfahren zur Isolierung von oralen Keratinozyten der Maus ist in Abbildung 1D zusammengefasst. Das Gaumengewebe wird seziert und auf ein Medium übertragen, das eine antibiotisch-antimykotische Lösung enthält, bevor es über Nacht in 0,025%iger Trypsinlösung bei 4 °C inkubiert wird. Am folgenden Tag wird das Gaumengewebe mit Trypsin-Inhibitor-Lösung und komplettem Kulturmedium in gleichen Volumina behandelt. Anschließend werden die Gewebe mit einer chirurgischen Skalpellklinge abgekratzt, um orale Keratinozyten zu sammeln. Die Zellsuspension wird durch ein 100 μm Zellsieb filtriert und zentrifugiert. Die Zellen werden dann in Kollagen I-beschichtete 24-Well-Platten gesät, die 2 ml vollständiges Kulturmedium + Chelexed-FBS enthalten. Repräsentative Ergebnisse der erfolgreichen Isolierung von oralen Keratinozyten der MausPrimäre orale Keratinozyten wuchsen als Monoschicht und zeigten eine Kopfsteinpflastermorphologie (Abbildung 2). Kleine Keratinozytenkolonien waren nach 3-5 Tagen sichtbar (Abbildung 2A,B); diese wurden größer und bildeten nach 1 Woche der Inkubation enge Kolonien (Abbildung 2C). Keratinozytenkolonien zeigten die typischen morphologischen Merkmale basaler Keratinozyten, was auf ihren gesunden Zustand hinweist. Menschliche orale Keratinozyten blieben für mehrere Passagen im gesamten Kulturmedium, das 0,06 mM Ca2+16,28 enthielt, undifferenziert. Die erste Passage wurde ca. 2 Wochen nach der ersten Beschichtung durchgeführt (Abbildung 2D). Bei späteren Passagen zeigten Keratinozyten ein stabiles Wachstum mit einer kürzeren Kulturperiode (Abbildung 2E-G). Keratinozyten hörten auf zu wachsen, wenn während des Isolationsprozesses eine signifikante Fibroblastenkontamination auftrat (Abbildung 2H). Isolierte orale Keratinozyten der Maus exprimieren BasalzellmarkerUm den Status der primären oralen Keratinozyten zu bestätigen, wurde eine Immunfärbung mit den Basalzellmarkern Keratin 14 (K14) und α6-Integrin34 durchgeführt. K14 und α6-Integrin wurden nach der Kultivierung in Keratinozyten exprimiert (Abbildung 3A,B). Die Zellen wurden auch mit dem Stammzellmarker p63 gefärbt, um ihre Stammhaftigkeit zu bestätigen. Frühe Passage (Passage 4) und späte Passage (Passage 7) Zellen zeigten eine gleichmäßige Expression von p63 (Abbildung 3C,D). Im Gegensatz dazu zeigten Keratinozyten, die mit hohem Kalziumgehalt (1,2 mM Induktion für 2 Tage) behandelt wurden, eine verminderte p63-Expression (Abbildung 3E), was darauf hindeutet, dass eine Behandlung mit hohem Kalziumstammzell-bezogene Gene in primären Keratinozyten unterdrückt, wie zuvor berichtet16. Der Differenzierungsmarker Keratin 13 (K13) zeigte eine seltene oder keine Expression sowohl in der frühen als auch in der späten Passage und eine signifikante Expression unter hoher Calciumbehandlung (Abbildung 3F-H). Um die Möglichkeit einer Fibroblastenkontamination in der Keratinozytenkultur zu testen, wurde die Färbung mit dem Fibroblastenmarker PDGFRα mit dem gleichen Satz von Keratinozyten im Vergleich zu embryonalen Fibroblasten (MEFs) der Maus durchgeführt. Es gab keine Expression von PDGFRα in der Keratinozytenkultur, verglichen mit der hohen Expression, die in MEF-Zellen beobachtet wurde (Abbildung 3I-3L). Diese Ergebnisse zeigten, dass dieses Protokoll erfolgreich basale Keratinozyten isolieren und diese Zellen im undifferenzierten Zustand halten könnte. Abbildung 1: Überblick über das Dissektionsverfahren und die Isolierung der oralen Keratinozyten der Maus. (A) Schematische Darstellung der Mundhöhle der Maus. (B) Instrumente zur Sezierung des Gaumens und zur Isolierung oraler Keratinozyten der Maus. (C) Hellfeldbild des Mausgaumens. Maßstabsleiste: 100 μm. (D) Zusammenfassung des Protokolls. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 2: Repräsentative Ergebnisse der erfolgreichen Isolierung von oralen Keratinozyten der Maus. (A-G) Zeitverlaufsbilder von kultivierten primären oralen Keratinozyten nach 3 Tagen (A), 5 Tagen (B), 1 Woche (C) und 2 Wochen (D) der Kultur nach der Isolierung. Morphologien der oralen Keratinozyten der Maus nach der ersten (E), zweiten (F) und dritten (G) Passage werden gezeigt. (H) Beispiel für eine Fibroblastenkontamination in oraler Keratinozytenkultur der Maus. Maßstabsleiste: 400 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 3: Isolierte orale Keratinozyten der Maus exprimieren Basalzellmarker. (A-B) Repräsentative Bilder der Immunfluoreszenzfärbung von K14 (A; rot) und α6-Integrin (B; grün) in Passage 4. (C-E) Repräsentative Bilder der immunfluoreszierenden Färbung von p63 (grün) in Passage 4 (C), Passage 7 (D) und behandlung mit hohem Kalziumgehalt (E). (F-H) Immunhaltige Bilder von K13 (grün) in Passage 4 (F), Passage 7 (G) und Behandlung mit hohem Kalziumgehalt (H). (I-L) Immunhaltige Bilder von PDGFRα (rot) in Passage 4 (I), Passage 7 (J), Behandlung mit hohem Kalziumgehalt (K) und MEFs (L). Kerne sind mit Hoechst (blau) gefärbt. Maßstabsbalken: 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Discussion

Primäre Keratinozyten, die aus der Epidermis der Haut von Menschen oder Mäusen isoliert wurden, werden seit vielen Jahren in Forschung und klinischen Anwendungen eingesetzt12,13,15,18,27,28,29. Im Gegensatz dazu wurden nur wenige Protokolle etabliert, um primäre orale Keratinozyten von erwachsenen Mäusen zu isolieren und zu kultivieren30,31,32. Die vorliegende Studie verwendete ein kommerzielles Gesamtkulturmedium und Chelexed-FBS, um Keratinozyten in einem proliferativen oder stammzellähnlichen Zustand zu halten. Dieses Kultursystem kann in molekularen und biochemischen Assays eingesetzt werden, um die Merkmale oraler epithelialer Stammzellen und ihrer verwandten Erkrankungen besser zu verstehen.

Mehrere kritische Schritte sind in diesem Protokoll enthalten. Erstens sind die Trypsinkonzentration und die Inkubationszeit essentiell für die Herstellung lebensfähiger Zellen für nachfolgende Kulturen. Wir verwendeten konsequent 0,025% Trypsin-Lösungen und 16 h Inkubationszeiten in der Kammerhaube bei Raumtemperatur. Wenn sie nicht über einen ausreichenden Zeitraum inkubiert werden, würden Keratinozyten nicht richtig vom Gewebe dissoziieren, was zu einer geringeren endgültigen Zellausbeute führt. Zweitens beeinträchtigt das schonende Pipettieren der Zellsuspension am zweiten Tag die Lebensfähigkeit der Zellen erheblich. Das Schaben sollte sanft von der Epithelseite beginnen und 10 Minuten pro Gewebeprobe nicht überschreiten. Schließlich enthält die erste isolierte Zellsuspension Fibroblasten und andere Zelltypen; Diese unerwünschten Zellen beginnen normalerweise in nachfolgenden Kulturen zu verschwinden.

Mögliche Einschränkungen wurden während der Zellisolierung und -kultur identifiziert. In seltenen Fällen können Fibroblasten während des Isolationsprozesses kontaminiert sein, und die Fibroblasten können das Wachstum von Keratinozyten in nachfolgenden Passagen hemmen (Abbildung 2H). Es ist notwendig, ein kommerzielles Medium auszuwählen, das einen Fibroblasten-Wachstumshemmer enthält, um eine solche Kontamination in der Kultur zu beseitigen. Da der Gaumen der Maus und andere Mundschleimhaut relativ klein sind, kann die anfängliche Zellausbeute einer Maus gering sein. Daher ist die gesamte Kulturdauer dieses Protokolls – bis zum Kryokonservierungsstadium – länger als die für primäre Hautkeratinozyten. Isolierte orale Keratinozyten werden am besten innerhalb von 10 Passagen verwendet, da längere Kulturperioden die Zelleigenschaften verändern und die Anzahl der Stammzellen verringern könnten.

Die aktuelle Methode zeigte, dass die oralen Keratinozyten der Maus eine dicht gepackte Kopfsteinpflastermorphologie aufwiesen und unter proliferativen Bedingungen Monolayer-Kolonien bildeten. Sie zeigten auch eine hohe Expression der basalen Marker α6-Integrin, K14 und Stammzellmarker p63. In zukünftigen Studien werden neben der Immunfluoreszenzfärbung auch RNA-Sequenzierung, RT-PCR und Western-Blot-Analysen verwendet, um die zelluläre Heterogenität und Reinheit oraler Keratinozyten zu überprüfen, was unser Verständnis der Natur dieser Zellen weiter verbessern wird.

Nach 2-3 Passagen waren die oralen Keratinozyten stabil genug, um in weiteren funktionellen Experimenten verwendet zu werden. Wichtig ist, dass dieses Kulturprotokoll mit transgenen Mauslinien kombiniert werden kann, einschließlich Gen-Knockout, Cre-loxP und tet-induzierbaren Systemen, und auch in zellulären und molekularen Assays verwendet werden kann. Somit bietet das vorliegende Protokoll den Forschern eine grundlegende und effiziente Methode, mit der die biologie der oralen Keratinozytenstammzellen weiter verstanden werden könnte.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch den Grant-in-Aid for Scientific Research (B) (20H03266) (an A.S.), Grant-in-Aid for Early-Career Scientists (18K14709) (an A.S.), AMED unter grant number JP21gm6110016 und 21bm0704067 (an A.S.) und Forschungsstipendien der Takeda Science Foundation (an A.S.) unterstützt. Wir danken dem Center for Animal Resources and Development an der Kumamoto University und dem Animal Resource Center an der University of Tsukuba für ihre hervorragende Mäusepflege. Wir danken der IRCMS Core Facility an der Kumamoto University für ihre Unterstützung in der konfokalen Bildgebung.

Materials

0.025% Trypsin/EDTA Gibco R001100
0.05% Trypsin/EDTA, phenol red Gibco 25300062
0.4w/v% Trypan Blue solution Wako 207-17081
10 mL Serological pipet Falcon 357551
100 µm Nylon cell strainer Falcon 352360
15 mL sterile conical tube Falcon 352096
2 mL Aspirating pipet Falcon 357558
35 mm Cell culture dish Corning 353801
50 mL sterile conical tube Falcon 352070
60 mm Cell culture dish Corning 353802
6-well Tissue Culture plate Falcon 353046
96 Well Culture plate (U bottom) Falcon 353077
Antibiotic-Antimycotic 100x Gibco 15240062
Biocoat Collagen I cellware 60mm dish Corning 356401
Blunt Forceps AS ONE 1-8187-03
Butorphanol Meiji Seika Pharma Vetorphale
CoolCell LX Corning 432002 Cryogenic storage
Cotton AS ONE 63-1452-97
Cover slips 22 x 22 μm square Matsunami Glass Ind. C022221
Cryogenic Vial 1.2 mL Thermo Scientific 5000-0012
Defined Trypsin Inhibitor (DTI) Gibco R007100
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich 276855-100ML
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 555 Invitrogen A31572
Donkey anti-Rat IgG (H+L), Alexa Fluor 488 Invitrogen A21208
Donkey serum Sigma-Aldrich D9663-10ML
EpiLife Defined Growth Supplement (EDGS) Gibco S0120
EpiLife, with 60 µM calcium Gibco MEPI500CA
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 26140079
Fine forceps BRC Bio Research Center PRI13-3374
Goat anti-PDGF Receptor α R&D Systems AF1062
Goat serum Sigma-Aldrich G9023-10ML
Half-curved forceps BRC Bio Research Center PRI13-3376
Hemocytometer Hirschmann Laborgeräte 8100204
Hoechst Sigma-Aldrich B2261
Iris Scissors Muromachi Kikai 14090-09
Medetomidine Nippon Zenyaku Kogyo Domitor
Midazolam Astellas Pharma Dormicum
No.15 Disposable scalpel Feather 219AABZX00136000
Paraformaldehyde Wako 162-16065
Phosphate Buffered Saline 1x, pH 7.4 Gibco 10010049
Povidone-iodine Y's Square 872612
Rabbit anti-Cytokeratin 13 antibody Abcam ab92551
Rabbit anti-K14 BioLegend 905301
Rabbit anti-p63 antibody Abcam ab124762
Raspatorium #14 AS ONE 8-4599-01
Rat α6-integrin BD Biosciences 553745
Triton X-100 Wako 581-81705
Type I Collagen coated 24-well plate Corning 354408
Type I Collagen coated 60mm dish Corning 356401
Type I Collagen coated 6-well plate Corning 355400
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References

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Xuan Ngo, Y., Haga, K., Suzuki, A., Kato, H., Yanagisawa, H., Izumi, K., Sada, A. Isolation and Culture of Primary Oral Keratinocytes from the Adult Mouse Palate. J. Vis. Exp. (175), e62820, doi:10.3791/62820 (2021).
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