成人マウス口蓋からの一次口腔角化細胞の分離と培養

熊本大学と筑波大学の動物実験委員会のガイドラインに従って、すべての動物実験を行いました。 試薬・培養媒体の製造 60μMのカルシウムと600μLの抗抗薬溶液を含むケラチノサイト培地40mLを調製します。0.025%トリプシン20mL、抗生物質抗ミコティック溶液400μLを調製します。 トリプシン阻害溶液を室温で解凍し、ステップ4.1で使用するまで4°Cに保ちます。注:分離試薬は、5匹のマウスの組織分離のために調製されます。 培養培地を調製するには、培地500mLを取り、5mLの成長サプリメント溶液(以下、完全 培地と呼ぶ)と20%カルシウム枯渇したキエキセドウシ胎児血清(FBS)33 (以下、キレキセド-FBSと呼ぶ)を加える。 2. 成人マウスからの口蓋組織の解剖 動物福祉に関する施設の規制に従って、頸部脱臼によって成人C57BL/6Jマウス(男性または女性)を犠牲にする。 口の周りの髪を剃りで取り除きます。はさみを使用して、頬から顎に向かって両側に切ります。注:マウスは犠牲になる前に麻酔をする必要があります。メデトミジン、ミダゾラム、ブトルファンノールの麻酔混合物が使用されています( 材料表を参照)。 鉗子を使って口を大きく開け、綿棒を使って血液を吸収します。口蓋を消毒するには、10%ポビドネヨウ素を含む綿棒で口の中を拭きます。 マウスの口蓋を収穫するには、まず、外科的メスの刃を使用して、上顎歯の口蓋側に沿って完全な厚さの限界切開を行います。その後、ラパトリアムを使用して口蓋全体を慎重に解剖する。注意:ラパラトリアムは、ムコプリオスチールフラップを上昇させるために使用されるツールです(材料表を参照)。 4 mLの完全培地+抗生物質抗ミコティック溶液を含む15 mLチューブに、口蓋組織を素早く移す。インキュベーションの準備ができるまで、組織を氷の上に置いてください。注:複数のマウスから採取する場合、口蓋組織は氷上に最大4時間保持される場合があります。 3. 口蓋組織の前処理 層流フードで、完全な培地+抗生物質抗ミコティック溶液の4 mLを含む60 mm皿に組織を移す。 短く鈍い鉗子とメスの刃を使用して、組織から血液をそっと取り除きます。完全な媒体でティッシュを10回洗う。 0.025%トリプシン+抗生物質抗ミクティック溶液の4 mLを含む35mm皿に組織を移し、上皮表面を下に向けます。注: 内側にカーブする上皮表面は、トリプシン溶液に浸す必要があります。層のプロポリアは上向きにする必要があります。組織は、トリプシン溶液に完全にインキュベートされるように可能な限り平坦化する必要があります。 培養フード内の室温で0.025%トリプシンで約16時間培養します。 4. 一次細胞の採取と培養 1組の鈍い鉗子を使用して、トリプシン溶液(35mm皿)から組織を取り除き、上皮表面を上向きにした60mm皿(1皿あたり4mL)でトリプシン阻害剤溶液に移す。 鉗子を使用して口蓋の端に保持し、メスの刃を使用して下層層の上皮層をそっと削り取ります。注:結合組織はトリプシンによって消化されないので、擦り傷の間は剥がれず。 組織から上皮細胞の最大量を収集するには、4 mL完全な培地で別の60 mm皿に組織を移し、掻取りステップを繰り返します。注:ブレードの先端で組織を削らないようにしてください。代わりにブレードのエッジを使用してください。掻き取りは、組織あたり5〜10分間行われます。 50 mL円錐形チューブの上に滅菌100 μmのセルストレーナーを置きます。 滅菌ピペットを使用して、2 mLのトリプシン溶液(ステップ4.1から)をストレーナーに移して表面を濡らします。 ピペットを使用して、60 mm皿(ステップ4.2-4.3から)に細胞懸濁液を数回混合し、ステップ4.4-4.5で調製した100 μmセルストレーナーを通して細胞をフィルターします。 ヘモサイトメーターを使用して細胞の数を数えます。15 μLのトリパンブルー溶液を準備し、15 μLのセル懸濁液を加えます(ステップ4.6)。細胞トリパンブルーミックスの10 μLをヘモサイトメーターに移し、細胞数を数えます。注:マウスの口蓋の1つの部分は、最大100万個の細胞を生成することができます。 カウント中、チューブを100 x g で室温で5分間(ステップ4.6から)遠心分離します。 ピペットで上清を吸引する。チューブに完全な培地+ キレキセドFBSの2 mLを加えます。5 mL ピペットを使用して数回トリチュールすることにより、細胞ペレットを再懸濁します。 1つのマウスから、コラーゲンタイプIであらかじめコーティングされた24ウェルプレートのウェルにプレート2-5 x 105 細胞をプレートします( 材料表を参照)。 培地を変えずに37°Cで2日間培養します。 播種の2日後、培地の半分を完全培地+キレキセドFBSに置き換える。顕微鏡下で細胞の形態を確認してください。完全な培地+キレキセドFBSを2日ごとにフィードセル。注:シードの後、異なるサイズのセルが観察されます。播種後約3~5日後、石畳の形態を有するケラチノサイト(図2)が観察できる。最初の通路が行われるまでに1〜2週間の培養が必要であり、その後の1〜2週間は、細胞が2番目と3番目の通路の準備が整う前に必要です。その後、細胞はより速く成長し、凍結保存のために準備することができます。細胞は、1つ目と2番目の通路でそれぞれ1つのウェル(24ウェルプレートの)と6ウェルプレートに再めっきすることができます。その後の通過は、細胞の成長と密度に依存します。3番目の通路の後に1:2または1:3の細胞分割比を使用することができます。 5. ケラチノサイトの通路 培養皿から上清の2 mLを収集し、15 mL円錐形のチューブ(氷の上)に分配します。滅菌1x PBSで細胞を2回洗います。注:細胞が約70%-80%の合流に達すると、それらは通過の準備ができています。 6ウェルプレートの1ウェルに0.05%トリプシンEDTAの1 mLを皿に加えます。 37°Cで5〜15分間インキュベート。5分後に細胞が皿から切り離されるかどうかを確認してください。 1 mLのトリプシン阻害液と2 mLの完全培養培地+キエキセドFBSを穏やかなピペットで反応を中和する。次に、ステップ5.1と同じ15 mL円錐管に細胞懸濁液を移す。 細胞懸濁液を100xgで4 °Cで5分間遠心分離する。 上清をピペットで吸引し、細胞ペレットを1mLの完全培養培地で再懸濁させた。 ヘモサイトメーターを使用して細胞を数えます。次に、細胞懸濁液のプレート1mLを新しい24-または6ウェル培養プレートに入す。注:初期の通路からの細胞の一部は、70%完全な培養培地+20%キレキセドFBS+10%DMSOの混合物で凍結することができる。1-2細胞のクライオビシャルは、1つのコンフルエント培養プレートから収集することができる。 6. ケラチノサイトの凍結保存と回収 細胞凍結 角化細胞を80%~90%の合流まで成長させます。注: 細胞の増殖状態と生存率が低下する可能性がありますので、細胞が過剰増殖しないようにしてください。 ステップ 5.1-5.5 で説明したように、0.05% トリプシン-EDTA で皿のケラチノサイトを扱います。 血球計を使用してケラチノサイトを数えます。計算されたセル番号に基づいて、各バイアルに1 x 106 セル/mLの転送を可能にするクライボシャルを準備します。 細胞懸濁液を100xgで4°Cで5分間遠心分離する。 上清を捨て、10%DMSO + 20% キレキセドFBS + 70%完全培養培地(9 mLの完全培地+キレキセドFBSおよび1 mL DMSO)の10 mL溶液で細胞ペレットを再懸濁します。 バイアルあたり1mLの懸濁液で細胞を凍結剤に分配する。バイアルを-80°Cで一晩極低温貯蔵容器に入れます。 翌日、バイアルを液体窒素タンクに移します。 細胞回復 液体窒素タンクから凍結液を取り出し、室温で部分的に解凍します。15 mL チューブに、完全な培養培地 + キレキセド FBS の 3 mL とセル懸濁液の 1 mL を混合します。 100xgおよび4°Cで5分間混合物を遠心分離する。 上清を捨て、完全培養培地+キエキセドFBSの1mLでペレットを再懸濁する。 細胞懸濁液を新しい60mmコラーゲンIコーティングされた培養皿に盛り付けます。培養培地を2〜3日ごとに交換し、一度コンフルエントに細胞を通過させる。 7. 免疫蛍光染色 6ウェルプレート(5 x 105 細胞/ウェル)の正方形のカバーリップ(22mm x 22mm)上の経口ケラチノサイトを2日間培養する。 ケラチノサイトを4%パラホルムアルデヒド(PFA)とPBSの溶液に20分間室温で固定してから、1x PBSで3回洗浄します。 PBSで0.1%トリトンの溶液中の細胞を透過させる。細胞をブロッキング試薬(2.5%ヤギ血清、ロバ血清2.5%)で室温で1時間培養し、続いて一次抗体( 材料表を参照)を4°Cでインキュベートする。注:一次抗体は、ウサギの抗K14(1:1000)、ラットα6-インテグリン(1:100)、ウサギの抗p63(1:500)、ウサギの抗K13(1:100)、ヤギ抗PDGFRα(1:100)の希釈剤で使用されました。 PBSで0.1%トリトンの溶液中のサンプルを洗浄し、続いて室温で1時間二次抗体をインキュベートする。注:2次抗体(Alexa 488または555)を1:300希釈で使用しました。 10分間のHoechst溶液を用いたすべてのサンプルに対抗し、ガラススライドにセルをマウントします。注:Hoechst溶液は、細胞の核を染色するために使用されます。 共焦点顕微鏡を用いてサンプルイメージングを行います。メモ:画像編集ソフトウェアを使用して、明るさとコントラストは等しい強度に調整されます。