Yetişkin Fare Damak Tadından Birincil Oral Keratinositlerin İzolasyonu ve Kültürü

Tüm hayvan deneyleri Kumamoto Üniversitesi ve Tsukuba Üniversitesi Kurumsal Hayvan Deney Komitesi yönergelerine göre gerçekleştirildi. 1. Reaktiflerin ve kültür medyasının hazırlanması 60 μM kalsiyum ve 600 μL antibiyotik-antimykotik çözelti içeren 40 mL keratinosit kültür ortamı hazırlayın. 20 mL%0,025 tripsin ve 400 μL antibiyotik-antimycotic çözelti hazırlayın. Tripin inhibisyon çözeltisini oda sıcaklığında çözün ve 4.1 adımında kullanılana kadar 4 °C’de tutun.NOT: İzolasyon reaktifi beş farenin doku izolasyonu için hazırlanır. Kültür medyasını hazırlamak için, 500 mL orta alın ve 5 mL büyüme takviyesi çözeltisi ekleyin (bkz. Malzeme Tablosu) (bundan böyle tam orta olarak anılacaktır) ve% 20 kalsiyum tükenmiş chelexed-fetal sığır serumu (FBS)33 (bundan böyle chelexed-FBS olarak anılacaktır). 2. Damak dokusunun yetişkin fareden diseksiyonu Yetişkin bir C57BL/6J fareyi (erkek veya dişi) tesisin hayvan refahı ile ilgili yönetmeliklerine uygun olarak servikal çıkık yoluyla kurban edin. Ağız çevresindeki saçları bir tıraş makinesi ile çıkarın. Makas kullanarak, yanaktan çeneye doğru, her iki taraftan kesin.NOT: Kurbandan önce farenin uyuşturulması gerekir. Metetomididin, midazolam ve butorphanolün anestezik karışımı kullanılır (bkz. Malzeme Tablosu). Ağzı geniş açmak ve pamuklu çubuk kullanarak herhangi bir kanı emmek için kümesleri kullanın. Damağı dezenfekte etmek için ağzın içini% 10 povidone-iyot içeren bir pamuklu çubukla silin. Fare damağı toplamak için, önce, maksiller dişlerin damak tarafı boyunca tam kalınlıklı marjinal bir kesi yapmak için cerrahi bir neşter bıçağı kullanın. Daha sonra, bir raspatorium kullanarak tüm damağı dikkatlice parçalara ayırın.NOT: Raspatorium, mukoperiosteal bir flep yükseltmek için kullanılan bir araçtır (bkz. Malzeme Tablosu) (Şekil 1B). Damak dokusunu 4 mL tam orta + antibiyotik-antimykotik çözelti içeren 15 mL’lik bir tüpe hızlı bir şekilde aktarın. Dokuları inkübasyona hazır olana kadar buzda tutun.NOT: Birden fazla fareden toplanmak için damak dokuları 4 saate kadar buzda tutulabilir. 3. Damak dokusunun ön işlemden önce Laminer akış davlumbazında, dokuları 4 mL tam orta + antibiyotik-antimykotik çözelti içeren 60 mm’lik bir tabağa aktarın. Kısa, künt tokalar ve neşter bıçağı kullanarak, dokulardaki herhangi bir kanı nazikçe çıkarın. Dokuları tam ortamda 10 kez yıkayın. Dokuları, epitel yüzeyi aşağı bakacak şekilde 4 mL%0,025 tripsin + antibiyotik-antimycotic çözelti içeren 35 mm’lik bir tabağa aktarın.NOT: İçe doğru kıvrılan epitel yüzeyi tripsin çözeltisinde bekletilmelidir; lamina propria yüz yüze olmalıdır. Doku tamamen tripsin çözeltisinde inkübe edilecek şekilde mümkün olduğunca düzleştirilmelidir. Dokuları kültür kaputunda oda sıcaklığında ~16 saat boyunca % 0.025 trypsin içinde kuluçkaya yatırın. 4. Birincil hücrelerin toplanması ve kültürü Bir çift künt forseps kullanarak, dokuyu tripsin çözeltisinden (35 mm’lik tabakta) çıkarın ve epitel yüzeyi yukarı bakacak şekilde 60 mm’lik bir tabakta (çanak başına 4 mL) tripsin inhibitörü çözeltisine aktarın. Damak kenarına tutunmak için epansları kullanarak, neşter bıçağı kullanarak alttaki lamina propria’daki epitel tabakasını hafifçe kazıyın.NOT: Bağ dokusu tripsin ile sindirilmez, bu nedenle kazıma sırasında soyulmaz. Dokulardan maksimum miktarda epitel hücresi toplamak için, dokuyu 4 mL tam orta ile başka bir 60 mm’lik çanağa aktarın ve kazıma adımını tekrarlayın.NOT: Bıçağın ucuyla dokuyu kazımaktan kaçındığından emin olun; bunun yerine bıçağın kenarını kullanın. Kazıma doku başına 5-10 dakika boyunca gerçekleştirilir. Steril bir 100 μm hücre süzgecini 50 mL konik tüpün üstüne yerleştirin. Steril bir pipet kullanarak, yüzeyini ıslatmak için 2 mL tripsin çözeltisini (adım 4.1’den) süzgeçe aktarın. Pipet kullanarak, hücre süspansiyonunu 60 mm’lik tabakta (4.2-4.3 adımlarından) birkaç kez karıştırın ve hücreleri 4.4-4.5 adımlarında hazırlanan 100 μm hücre süzgecinden filtreleyin. Hemositometre kullanarak hücre sayısını sayın. 15 μL trippan mavisi çözelti hazırlayın ve 15 μL hücre süspansiyonu ekleyin (adım 4.6). Hücre-trippan mavi karışımının 10 μL’sini bir hemositometreye aktarın ve hücre sayısını sayın.NOT: Bir fare damak parçası 1 milyon hücreye kadar verim verebilir. Sayarken, tüpü oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 100 x g’da (adım 4.6’dan itibaren) santrifüj edin. Bir pipet ile süpernatant aspirat. Tüpe 2 mL komple orta + chelexed-FBS ekleyin. 5 mL pipet kullanarak birkaç kez tritüre ederek hücre peletini yeniden canlandırın. Plaka 2-5 x 105 hücre bir fareden kollajen tip I ile önceden kaplanmış 24 kuyulu bir plakanın bir kuyusuna (bkz. Malzeme Tablosu). Ortamı değiştirmeden hücreleri 2 gün boyunca 37 °C’de kuluçkaya yatırın. Tohumlamadan iki gün sonra, kültür ortamının yarısını tam orta + chelexed-FBS ile değiştirin. Mikroskop altındaki hücre morfolojisini kontrol et. Hücreleri her 2 günde bir tam orta + chelexed-FBS ile besleyin.NOT: Tohumlamadan sonra, farklı boyutlarda hücreler gözlenecektir. Tohumlamadan yaklaşık 3-5 gün sonra, parke taşı morfolojisi olan keratinositler (Şekil 2) gözlenebilir. İlk pasajın gerçekleştirilebilmesi için 1-2 hafta kültür gerekir ve hücreler ikinci ve üçüncü pasajlara hazır olmadan önce sonraki 1-2 hafta gereklidir. Bundan sonra, hücreler daha hızlı büyür ve kriyoprezervasyona hazırlanabilir. Hücreler sırasıyla birinci ve ikinci geçitte bir kuyuya (24 kuyu plakası) ve 6 kuyu plakasına yeniden kaplanabilir. Sonraki geçiş hücre büyümesine ve yoğunluğuna bağlı olacaktır. Üçüncü pasajdan sonra 1:2 veya 1:3 hücre bölünme oranı kullanılabilir. 5. Keratinosit pasajı Kültür çanaktan 2 mL süpernatant toplayın ve 15 mL konik bir tüpe (buz üzerinde) dağıtın. Hücreleri steril 1x PBS ile iki kez yıkayın.NOT: Hücreler yaklaşık – izdiah süresine ulaştığında geçişe hazırdır. 6 kuyulu bir tabağa yemeğe 1 mL% 0.05 trypsin-EDTA ekleyin. 37 °C’de 5-15 dakika kuluçkaya yatır; hücrelerin tabaktan ayrılıp kopmadığını görmek için 5 dakika sonra kontrol edin. Hafif pipetleme ile 1 mL tripsin inhibisyon çözeltisi ve 2 mL tam kültür ortamı + chelexed-FBS kullanarak reaksiyonu nötralize edin. Ardından, hücre süspansiyonu 5.1 adımındakiyle aynı 15 mL konik tüpe aktarın. Hücre süspansiyonu 100 x g’da 4 °C’de 5 dakika santrifüj. Süpernatantı bir pipetle aspire edin ve hücre peletini 1 mL tam kültür ortamında yeniden dirilir. Hemositometre kullanarak hücreleri sayın. Daha sonra, hücre süspansiyonunun 1 mL’lik plakasını yeni bir 24 veya 6 kuyu kültür plakasına koyun.NOT: Erken pasajlardan gelen hücrelerin bir kısmı komple kültür ortamı + chelexed-FBS + DMSO karışımında dondurulabilir. Bir birleştiği kültür plakasından 1-2 hücre kriyovyalleri toplanabilir. 6. Kriyoprezervasyon ve keratinositlerin geri kazanımı Hücre dondurma Keratinositleri% 80-% 90 izdiah eder.NOT: Hücrelerin aşırı büyümesine izin vermeyin, çünkü bu onların çoğalma durumlarını ve canlılıklarını azaltabilir. Yemekteki keratinositleri 5.1-5.5 adımlarında açıklandığı gibi% 0.05 tripsin-EDTA ile tedavi edin. Hemositometre kullanarak keratinositleri sayın. Her şişeye 1 x 106 hücre/mL aktarımı için hesaplanan hücre numaralarına göre cryovials hazırlayın. Hücre süspansiyonu 100 x g’da 4 °C’de 5 dakika santrifüj. Süpernatantı atın ve hücre peletini % 10 DMSO + % 20 chelexed-FBS + % 70 tam kültür ortamı (9 mL komple orta + chelexed-FBS ve 1 mL DMSO) 10 mL çözeltisinde yeniden kullanın. Hücreleri şişe başına 1 mL süspansiyonda cryovials içine dağıtın. Şişeleri -80 °C’de gece boyunca kriyojenik bir saklama kabına yerleştirin. Şişeleri ertesi gün sıvı bir azot tankına aktarın. Hücre kurtarma Sıvı nitrojen tankından bir cryovial çıkarın ve oda sıcaklığında kısmen çözün. 15 mL’lik bir tüpte, hücre süspansiyonunun 1 mL’lik kısmını 3 mL tam kültür ortamı + chelexed-FBS ile karıştırın. Karışımı 100 x g ve 4 °C’de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatantı atın ve peletin 1 mL tam kültür ortamı + chelexed-FBS’de yeniden diriltin. Hücre süspansiyonlarını yeni 60 mm Collagen I kaplamalı kültür yemeklerine dönüştürin. Kültür ortamını her 2-3 günde bir değiştirin ve bir kez birleştiğinde hücreleri geçin. 7. İmmünofluoresan boyama 2 gün boyunca 6 kuyulu plakalarda (5 x 105 hücre/kuyu) kare kapaklarda (22 mm x 22 mm) kültür oral keratinositler. Keratinositleri 1x PBS ile üç kez yıkamadan önce oda sıcaklığında 20 dakika boyunca% 4 paraformaldehit (PFA) ve PBS çözeltisinde sabitlayın. PBS’de %0,1 Triton çözeltisinde hücrelerin dengesini bozar. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca reaktifi bloke eden hücreleri (%2,5 keçi serumu, %2,5 eşek serumu) kuluçkaya yatırın, ardından 4 °C’de birincil antikorlarla gece boyunca inkübasyon (bkz. Malzeme Tablosu).NOT: Birincil antikorlar aşağıdaki seyreltmelerde kullanılmıştır: tavşan anti-K14 (1:1000), sıçan α6-integrin (1:100), tavşan anti-p63 (1:500), tavşan anti-K13 (1:100) ve keçi anti-PDGFRα (1:100). Örnekleri PBS’de% 0.1 Triton çözeltisinde yıkayın, ardından oda sıcaklığında 1 saat ikincil antikorlarla inkübasyon.NOT: İkincil antikorlar (Alexa 488 veya 555) 1:300 seyreltmede kullanıldı. Tüm numuneleri Hoechst çözeltisi ile 10 dakika boyunca karşı tutun ve hücreleri cam slaytlara monte edin.NOT: Hoechst çözeltisi hücrelerin çekirdeklerini lekelendirmek için kullanılır. Konfokal mikroskop kullanarak örnek görüntüleme gerçekleştirin.NOT: Parlaklık ve kontrast, görüntü düzenleme yazılımı kullanılarak eşit yoğunluğa ayarlanır.