Isolatie en kweek van primaire orale keratinocyten uit het volwassen muizengehemelte

Alle dierproeven werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de Institutional Animal Experiment Committee aan de Kumamoto University en de University of Tsukuba. 1. Bereiding van reagentia en kweekmedia Bereid 40 ml keratinocytenkweekmedium met 60 μM calcium en 600 μL antibiotisch-antimycotische oplossing. Bereid 20 ml 0,025% trypsine en 400 μL antibiotisch-antimycotische oplossing. Ontdooi de trypsineremmingsoplossing bij kamertemperatuur en houd deze op 4 °C tot gebruik in stap 4.1.OPMERKING: Het isolatiereagens is voorbereid voor de weefselisolatie van vijf muizen. Neem voor de bereiding van de kweekmedia 500 ml medium en voeg 5 ml groeisupplementoplossing (zie materiaaltabel) (hierna “volledig medium” genoemd) en 20% calciumarm chelex-foetaal runderserum (FBS)33 (hierna chelex-FBS genoemd) toe. 2. Dissectie van gehemelteweefsel van volwassen muis Offer een volwassen C57BL/6J-muis (mannelijk of vrouwelijk) op door cervicale dislocatie in overeenstemming met de voorschriften van de faciliteit met betrekking tot dierenwelzijn. Verwijder het haar rond de mond met een scheerapparaat. Met behulp van een schaar, gesneden van de wang naar de kaak, aan beide zijden.OPMERKING: De muis moet worden verdoofd voordat hij wordt opgeofferd. Een verdovend mengsel van medetomidine, midazolam en butorphanol wordt gebruikt (zie Tabel met materialen). Gebruik een tang om de mond wijd te openen en eventueel bloed te absorberen met behulp van een wattenstaafje. Om het gehemelte te desinfecteren, veegt u de binnenkant van de mond af met een wattenstaafje met 10% povidon-jodium. Om het muizengehemelte te oogsten, gebruikt u eerst een chirurgisch scalpelmes om een marginale incisie van volledige dikte langs de gehemeltezijde van de maxillaire tanden te maken. Ontleed vervolgens zorgvuldig het hele gehemelte met behulp van een raspatorium.OPMERKING: Een raspatorium is een hulpmiddel dat wordt gebruikt om een mucoperiosteale flap te verheffen (zie Tabel met materialen) (figuur 1B). Breng het gehemelteweefsel snel over naar een buis van 15 ml met 4 ml volledig medium + antibiotisch-antimycotische oplossing. Houd de weefsels op ijs totdat ze klaar zijn voor incubatie.OPMERKING: Voor het verzamelen van meerdere muizen kunnen gehemelteweefsels tot 4 uur op ijs worden bewaard. 3. Voorbehandeling van gehemelteweefsel Breng in een laminaire stroomkap weefsels over naar een schaal van 60 mm met 4 ml volledig medium + antibiotisch-antimycotische oplossing. Gebruik een korte, stompe tang en een scalpelmesje om voorzichtig bloed uit de weefsels te verwijderen. Was tissues 10 keer in volledig medium. Breng weefsels over in een schaal van 35 mm met 4 ml 0,025% trypsine + antibiotisch-antimycotische oplossing, met het epitheeloppervlak naar beneden gericht.OPMERKING: Het epitheeloppervlak, dat naar binnen buigt, moet worden gedrenkt in de trypsine-oplossing; de lamina propria moet naar boven gericht zijn. Het weefsel moet zoveel mogelijk worden afgeplat om volledig in de trypsine-oplossing te worden geïncubeerd. Incubeer weefsels in 0,025% trypsine gedurende ~ 16 uur bij kamertemperatuur in de kweekkap. 4. Verzameling en kweek van primaire cellen Verwijder met één stompe tang weefsel uit de trypsine-oplossing (in de schotel van 35 mm) en breng over op trypsineremmeroplossing in een schaal van 60 mm (4 ml per schotel) met het epitheeloppervlak naar boven gericht. Gebruik een tang om de rand van het gehemelte vast te houden en schraap de epitheellaag voorzichtig van de onderliggende lamina propria met behulp van een scalpelmes.OPMERKING: Bindweefsel wordt niet verteerd door trypsine, dus het bladdert niet af tijdens het schrapen. Om de maximale hoeveelheid epitheelcellen uit weefsels te verzamelen, brengt u het weefsel over in een andere schaal van 60 mm met een volledig medium van 4 ml en herhaalt u de schraapstap.OPMERKING: Zorg ervoor dat u het weefsel niet schraapt met de punt van het mes; gebruik in plaats daarvan de rand van het mes. Schrapen wordt uitgevoerd gedurende 5-10 minuten per weefsel. Plaats een steriele celzeef van 100 μm op de bovenkant van een conische buis van 50 ml. Breng met behulp van een steriele pipet 2 ml trypsine-oplossing (vanaf stap 4.1) over in de zeef om het oppervlak nat te maken. Meng met behulp van een pipet de celsuspensie in de 60 mm schaal (uit stap 4.2-4.3) een paar keer en filter cellen door de 100 μm celzeef bereid in stappen 4.4-4.5. Tel het aantal cellen met behulp van een hemocytometer. Bereid 15 μL trypan blauwe oplossing en voeg 15 μL celsuspensie toe (stap 4.6). Breng 10 μL van het cel-trypan blauwe mengsel over naar een hemocytometer en tel het aantal cellen.OPMERKING: Een stuk muizengehemelte kan tot 1 miljoen cellen opleveren. Centrifugeer tijdens het tellen de buis (vanaf stap 4.6) gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur bij 100 x g . Aspirateer het supernatant met een pipet. Voeg 2 ml volledig medium + chelexed-FBS toe aan de buis. Resuspend de celkorrel door meerdere keren te tritureren met behulp van een pipet van 5 ml. Plaat 2-5 x 105 cellen van één muis in één put van een 24-putplaat voorgecoat met collageentype I (zie Tabel met materialen). Incubeer de cellen bij 37 °C gedurende 2 dagen zonder het medium te veranderen. Vervang twee dagen na het zaaien de helft van het kweekmedium door het volledige medium + chelexed-FBS. Controleer de celmorfologie onder de microscoop. Voer cellen met volledig medium + chelexed-FBS om de 2 dagen.OPMERKING: Na het zaaien worden cellen van verschillende groottes waargenomen. Ongeveer 3-5 dagen na het zaaien kunnen keratinocyten met een geplaveide morfologie (figuur 2) worden waargenomen. Het duurt 1-2 weken van de kweek voordat de eerste passage kan worden uitgevoerd en een volgende 1-2 weken is nodig voordat de cellen klaar zijn voor de tweede en derde passage. Daarna zullen cellen sneller groeien en kunnen ze worden voorbereid op cryopreservatie. Cellen kunnen worden omgevormd tot één put (van een 24-putplaat) en een 6-putplaat in respectievelijk de eerste en tweede passage. De daaropvolgende passage zal afhankelijk zijn van de celgroei en -dichtheid. Een celsplitsingsverhouding van 1:2 of 1:3 kan worden gebruikt na de derde passage. 5. Keratinocyten passage Verzamel 2 ml van het supernatant uit de kweekschaal en doseer in een conische buis van 15 ml (op ijs). Was de cellen tweemaal met steriele 1x PBS.OPMERKING: Wanneer de cellen ongeveer 70% -80% confluentie bereiken, zijn ze klaar voor passage. Voeg 1 ml 0,05% trypsine-EDTA toe aan het gerecht in de put van een bord met 6 putten. Incubeer gedurende 5-15 minuten bij 37 °C; controleer na 5 minuten of de cellen loskomen van de schaal. Neutraliseer de reactie met behulp van 1 ml trypsine-remmingsoplossing en 2 ml volledig kweekmedium + chelexed-FBS door zacht pipetteren. Breng vervolgens de celsuspensie over in dezelfde conische buis van 15 ml als in stap 5.1. Centrifugeer de celsuspensie bij 100 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Zuig het supernatant op met een pipet en resuspend de celkorrel in 1 ml volledig kweekmedium. Tel de cellen met behulp van een hemocytometer. Vervolgens plaat 1 ml van de celsuspensie in een nieuwe 24- of 6-well kweekplaat.OPMERKING: Sommige cellen uit de vroege passages kunnen worden ingevroren in een mengsel van 70% volledig kweekmedium + 20% chelexed-FBS + 10% DMSO. 1-2 cryovialen van cellen kunnen worden verzameld uit één confluentcultuurplaat. 6. Cryopreservatie en herstel van keratinocyten Cel bevriezen Groei keratinocyten tot 80% -90% confluentie.OPMERKING: Laat cellen niet overgroeien, omdat dit hun proliferatiestatus en levensvatbaarheid zou kunnen verminderen. Behandel de keratinocyten in de schaal met 0,05% trypsine-EDTA, zoals beschreven in stappen 5.1-5.5. Tel de keratinocyten met behulp van een hemocytometer. Bereid cryovialen voor op basis van berekende celaantallen om de overdracht van 1 x 106 cellen / ml naar elke injectieflacon mogelijk te maken. Centrifugeer de celsuspensie bij 100 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatant weg en resuspend de celkorrel in een 10 ml oplossing van 10% DMSO + 20% chelexed-FBS + 70% volledig kweekmedium (9 ml volledig medium + chelexed-FBS en 1 ml DMSO). Doseer de cellen in cryovialen bij 1 ml suspensie per injectieflacon. Plaats de injectieflacons ‘s nachts in een cryogene opslagcontainer bij -80 °C. Breng de injectieflacons de volgende dag over in een tank met vloeibare stikstof. Celherstel Verwijder een cryovial uit de tank met vloeibare stikstof en ontdooi gedeeltelijk bij kamertemperatuur. Meng in een buis van 15 ml 1 ml van de celsuspensie met 3 ml volledig kweekmedium + chelexed-FBS. Centrifugeer het mengsel gedurende 5 minuten bij 100 x g en 4 °C. Gooi het supernatant weg en resuspend de pellet in 1 ml volledig kweekmedium + chelexed-FBS. Verdeel de celsuspensies in nieuwe 60 mm collageen I-gecoate kweekschalen. Vervang het kweekmedium om de 2-3 dagen en passeer de cellen eenmaal samenvloeiend. 7. Immunofluorescente kleuring Kweek orale keratinocyten op vierkante coverslips (22 mm x 22 mm) in 6-well platen (5 x 105 cellen/put) gedurende 2 dagen. Fixeer keratinocyten in een oplossing van 4% paraformaldehyde (PFA) en PBS gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur voordat u drie keer wordt gewassen met 1x PBS. Permeabiliseer cellen in een oplossing van 0,1% Triton in PBS. Incubeer cellen in blokkerend reagens (2,5% geitenserum, 2,5% ezelserum) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur, gevolgd door incubatie ‘s nachts met primaire antilichamen (zie Tabel met materialen) bij 4 °C.OPMERKING: Primaire antilichamen werden gebruikt bij de volgende verdunningen: konijn anti-K14 (1:1000), rat α6-integrine (1:100), konijn anti-p63 (1:500), konijn anti-K13 (1:100) en geit anti-PDGFRα (1:100). Was monsters in een oplossing van 0,1% Triton in PBS, gevolgd door incubatie met secundaire antilichamen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.OPMERKING: De secundaire antilichamen (Alexa 488 of 555) werden gebruikt bij een verdunning van 1:300. Counterstain alle monsters met Hoechst oplossing gedurende 10 minuten en monteer cellen op glazen dia’s.OPMERKING: Hoechst-oplossing wordt gebruikt om de kernen van cellen te kleuren. Voer monsterbeeldvorming uit met behulp van een confocale microscoop.OPMERKING: De helderheid en het contrast worden aangepast aan dezelfde intensiteit met behulp van beeldbewerkingssoftware.