عزل وثقافة الكريات الكيراتينية الفموية الأولية من الحنك الفأري البالغ
Summary
يصف هذا البروتوكول عزلة وثقافة الخلايا القرنية الفموية المشتقة من الحنك الفأري البالغ. كما يتم الإبلاغ عن طريقة تقييم تستخدم التثبيط المناعي.
Abstract
لسنوات, وقد أجريت معظم الدراسات التي تنطوي على keratinocytes باستخدام الإنسان والفأر الجلد البشرة keratinocytes. في الآونة الأخيرة، جذبت الكريات الكيراتينية عن طريق الفم الانتباه بسبب وظيفتها الفريدة وخصائصها. أنها تحافظ على التوازن من الظهارة الفموية وبمثابة موارد للتطبيقات في العلاجات التجديدية. ومع ذلك ، في المختبر الدراسات التي تستخدم الكيراتينيات الأولية عن طريق الفم من الفئران البالغة كانت محدودة بسبب عدم وجود بروتوكول ثقافة فعالة وراسخة. هنا، تم عزل الكريات الكيراتينية الأولية عن طريق الفم من أنسجة الحنك للفئران البالغة ومثقفة في وسط تجاري منخفض الكالسيوم مكمل بمصل chelexed. في ظل هذه الظروف ، تم الحفاظ على الخلايا القرنية في حالة التكاثر أو تشبه الخلايا الجذعية ، وتم منع تمييزها حتى بعد زيادة الممرات. أظهر تحليل تعبير العلامة أن الخلايا القرنية الفموية المثقفة عبرت عن علامات الخلايا القاعدية p63 و K14 و α6-integrin وكانت سلبية لعلامة التمايز K13 وعلامة الخلايا الليفية PDGFRα. أنتجت هذه الطريقة خلايا قابلة للحياة وقابلة للزراعة مناسبة لتطبيقات المصب في دراسة وظائف الخلايا الجذعية الظهارية الفموية في المختبر.
Introduction
الظهارة الفموية بمثابة الحاجز الأول في حماية الجسم من الضغوط البيئية، بما في ذلك الأضرار الكيميائية أو المادية والالتهابات البكتيرية والفيروسية1،2. تتكون الغشاء المخاطي الفموي من طبقة خارجية من الظهارة الحرشفية الطبقية التي تتكون من خلايا القرنية والأنسجة الضامة الأساسية تسمى البربريا الصفيحة ، والتي تتكون بشكل رئيسي من الخلايا الليفية والمصفوفة خارج الخلية. يمكن تقسيم الغشاء المخاطي الفموي للفأر على نطاق واسع إلى ثلاثة أنواع فرعية: المصطكي (الحنك الصلب واللثة) ، المتخصصة (اللسان الظهري) ، والبطانة (الغشاء المخاطي ، اللسان البطني ، الحنك الرخو ، الشفاه) الغشاء المخاطي 2،3 (الشكل 1A). الظهارة الفموية هي الكيراتينية في الغشاء المخاطي المصطكي والمتخصصة وغير الكيراتينية في الغشاء المخاطي بطانة. على الرغم من موقعه التشريحي ، فإن الظهارة الفموية تشبه البشرة من حيث أنها تتكون من خلايا ظهارية معبأة بإحكام بدرجات متفاوتة من التمايز: طبقات أساسية تحتوي على خلايا غير متمايزة ؛ طبقات أساسية تحتوي على خلايا غير متمايزة ؛ طبقات ظهارية ذات طبقات غير متمايزة ؛ طبقات ظهارية ذات نهايات ظهارية غير متمايزة ؛ طبقات ظهارية ذات نهايات مختلفة ؛ طبقات ظهارية متمايزة ؛ طبقات ظهارية ذات نهايات ظهارية متمايزة ؛ طبقات ظهارية تحتوي على خلايا غير متمايزة . طبقات شائكة، حبيبية، وكورنية تشكل ظهارة الكيراتينية، أو الطبقات المتوسطة والسطحية التي تشكل ظهارة غير القرنية4. وقد سهلت نماذج الماوس المعدلة وراثيا دراسة السمات الخلوية والجزيئية للخلايا الجذعية الظهارية الفموية في الحنك والغشاء المخاطي واللسان واللثة 6,7,8,9,10,11. ومع ذلك ، فإن معظم هذه الدراسات تستخدم في المقام الأول في تجارب الماوس فيفو. ولم تستخدم نظم زراعة الخلايا عادة بسبب الافتقار إلى بروتوكولات راسخة وفعالة.
يمكن استخدام نظام زراعة في المختبر للتحليل الجزيئي والكيميائي الحيوي لمنظمي الخلايا الجذعية، والفحوصات المستندة إلى الخلايا، وفحص الأدوية. حاليا، تم تطوير بروتوكولات لثقافة الخلايا القرنية الأولية للبشرة البشرة، والتي يمكن فيها عزل خلايا القرنية القاعدية بنجاح واستزراعها لأغراض سريرية وبحثية12,13,14,15. في عام 1980، أظهرت هينينغز وآخرون أن تركيز الكالسيوم المنخفض (< 0.09 mM Ca2+) في وسط الثقافة سهل الانتشار وحافظ على الخلايا في حالة غير متمايزة. وعزز ارتفاع مستوى الكالسيوم تمايز الخلايا وخفض الانتشار16. وفي وقت لاحق، تم وضع منهجيات ثقافية لخلايا القرنية النيدرماية الوليدية والبالغة وتطبيقها على نطاق واسع على العديد من نماذج الماوس ذات الخلفيات الجينية المختلفة للدراسات المختبرية17,18,19. على الرغم من أن الجلد والظهارة الفموية يشتركان في خصائص مشتركة، إلا أنهما يظهران أيضا اختلافات جوهرية، على سبيل المثال، في حالة الكيراتين، ومعدل الدوران، والتعبير الجيني، وقدرة التئام الجروح3،11،20،21،22،23،24،25،26.
على الرغم من أن الإنسان عن طريق الفم keratinocyte الثقافة قد أجريت بنجاح27,28,29, المنشورات على الماوس عن طريق الفم keratinocyte culture30,31,32 محدودة بسبب صغر حجم الأنسجة المستهدفة والخصائص المتميزة للخلايا مقارنة مع خلايا القرنية البشرة الجلد. يصف هذا البروتوكول تقنيات العزلة والثقافة طويلة الأجل لخلايا القرنية الفموية الأولية للفأر.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد استخدمت الخلايا الكيراتينية الأولية المعزولة عن البشرة البشرية أو الماوس لسنوات عديدة في البحوث والتطبيقات السريرية12,13,15,18,27,28,29. وعلى النقيض من ذلك، تم وضع بروتوكولات قليلة لعزل وزراعة الخلايا القرنية الفموية الأولية من الفئران البالغة30,31,32. استخدمت هذه الدراسة وسيلة ثقافية تجارية كاملة وchelexed-FBS للحفاظ على الخلايا الكيراتينية في حالة التكاثر أو الخلايا الجذعية. يمكن استخدام هذا النظام الثقافي في المقايسات الجزيئية والبيوكيميائية لزيادة فهم ملامح الخلايا الجذعية الظهارية الفموية والأمراض المرتبطة بها.
يتم تضمين العديد من الخطوات الهامة في هذا البروتوكول. أولا، تركيز التريبسين ووقت الحضانة ضروريان في إنتاج خلايا قابلة للحياة للثقافات اللاحقة. استخدمنا باستمرار حلول التريبسين بنسبة 0.025٪ وفترات حضانة 16 ساعة في غطاء الغرفة في درجة حرارة الغرفة. إذا لم يتم احتضانها لفترة كافية من الزمن ، فإن الخلايا القرنية لن تنأى بشكل صحيح عن الأنسجة ، مما يؤدي إلى انخفاض إنتاج الخلية النهائية. ثانيا، يؤثر الأنابيب اللطيفة لتعليق الخلية في اليوم الثاني بشكل ملحوظ على صلاحية الخلية. يجب أن يبدأ الكشط بلطف من الجانب الظهاري ولا يتجاوز 10 دقائق لكل عينة من الأنسجة. وأخيرا، يحتوي تعليق الخلية المعزولة الأولى على الخلايا الليفية وأنواع الخلايا الأخرى. هذه الخلايا غير المرغوب فيها عادة ما تبدأ في الاختفاء في الثقافات اللاحقة.
تم تحديد القيود المحتملة أثناء عزل الخلايا والثقافة. في حالات نادرة، قد تكون الخلايا الليفية ملوثة أثناء عملية العزل، وقد تمنع الخلايا الليفية نمو الخلايا الكيراتينية في المقاطع اللاحقة (الشكل 2H). من الضروري اختيار وسيط تجاري يحتوي على مثبط نمو الخلايا الليفية للقضاء على هذا التلوث في الثقافة. لأن الحنك الماوس والغشاء المخاطي عن طريق الفم الأخرى لها أحجام صغيرة نسبيا، قد تكون نسبة إنتاج الخلية الأولية من فأر واحد منخفضة. لذلك، فإن فترة الثقافة بأكملها من هذا البروتوكول- حتى مرحلة التبريد-أطول من ذلك لخلايا القرنية الجلد الأولية. يتم استخدام خلايا القرنية الفموية المعزولة بشكل أفضل في غضون 10 مقاطع ، حيث يمكن أن تغير فترات الثقافة الموسعة خصائص الخلية وتخفض عدد الخلايا الجذعية.
أظهرت الطريقة الحالية أن خلايا القرنية الفموية الماوس أظهرت مورفولوجيا معبأة بإحكام ، مرصوفة بالحصى وشكلت مستعمرات أحادية الطبقة في ظل ظروفتكاثرية. كما أظهرت تعبيرات عالية عن العلامات القاعدية α6-integrin و K14 وعلامة الخلايا الجذعية p63. في الدراسات المستقبلية، بالإضافة إلى تلطيخ immunofluorescence، RNA-التسلسل، RT-PCR، والغرب لطخة التحليلات سوف تستخدم للتحقق من عدم التجانس الخلوي ونقاء الخلايا القرنية عن طريق الفم، والتي سوف تعزز فهمنا لطبيعة هذه الخلايا.
بعد مرور 2-3 ، كانت الخلايا القرنية الفموية مستقرة بما يكفي لاستخدامها في تجارب وظيفية أخرى. والأهم من ذلك، يمكن الجمع بين بروتوكول الثقافة هذا وخطوط الماوس المعدلة وراثيا، بما في ذلك خروج المغلوب الجيني، وأنظمة Cre-loxP، وأنظمة tet-inducible، ويمكن استخدامها أيضا في المقايسات الخلوية والجزيئية. وهكذا، يوفر هذا البروتوكول للباحثين طريقة أساسية وفعالة يمكن استخدامها لفهم بيولوجيا الخلايا الجذعية الكيراتينية عن طريق الفم بشكل أكبر.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من خلال منحة في المعونة للبحث العلمي (B) (20H03266) (إلى A.S.) ، منحة في المعونة للعلماء في وقت مبكر الوظيفي (18K14709) (إلى A.S.)، AMED تحت رقم المنحة JP21gm6110016 و 21bm0704067 (إلى A.S.)، والمنح البحثية من مؤسسة تاكيدا للعلوم (إلى A.S.). نشكر مركز الموارد الحيوانية والتنمية في جامعة كوماموتو ومركز الموارد الحيوانية في جامعة تسوكوبا على رعايتهم الممتازة للفأر. نشكر منشأة IRCMS الأساسية في جامعة كوماموتو لدعمها في التصوير البؤري.
Materials
| 0.025% Trypsin/EDTA | Gibco | R001100 | |
| 0.05% Trypsin/EDTA, phenol red | Gibco | 25300062 | |
| 0.4w/v% Trypan Blue solution | Wako | 207-17081 | |
| 10 mL Serological pipet | Falcon | 357551 | |
| 100 µm Nylon cell strainer | Falcon | 352360 | |
| 15 mL sterile conical tube | Falcon | 352096 | |
| 2 mL Aspirating pipet | Falcon | 357558 | |
| 35 mm Cell culture dish | Corning | 353801 | |
| 50 mL sterile conical tube | Falcon | 352070 | |
| 60 mm Cell culture dish | Corning | 353802 | |
| 6-well Tissue Culture plate | Falcon | 353046 | |
| 96 Well Culture plate (U bottom) | Falcon | 353077 | |
| Antibiotic-Antimycotic 100x | Gibco | 15240062 | |
| Biocoat Collagen I cellware 60mm dish | Corning | 356401 | |
| Blunt Forceps | AS ONE | 1-8187-03 | |
| Butorphanol | Meiji Seika Pharma | Vetorphale | |
| CoolCell LX | Corning | 432002 | Cryogenic storage |
| Cotton | AS ONE | 63-1452-97 | |
| Cover slips 22 x 22 μm square | Matsunami Glass Ind. | C022221 | |
| Cryogenic Vial 1.2 mL | Thermo Scientific | 5000-0012 | |
| Defined Trypsin Inhibitor (DTI) | Gibco | R007100 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 276855-100ML | |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A31572 | |
| Donkey anti-Rat IgG (H+L), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21208 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663-10ML | |
| EpiLife Defined Growth Supplement (EDGS) | Gibco | S0120 | |
| EpiLife, with 60 µM calcium | Gibco | MEPI500CA | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140079 | |
| Fine forceps | BRC Bio Research Center | PRI13-3374 | |
| Goat anti-PDGF Receptor α | R&D Systems | AF1062 | |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023-10ML | |
| Half-curved forceps | BRC Bio Research Center | PRI13-3376 | |
| Hemocytometer | Hirschmann Laborgeräte | 8100204 | |
| Hoechst | Sigma-Aldrich | B2261 | |
| Iris Scissors | Muromachi Kikai | 14090-09 | |
| Medetomidine | Nippon Zenyaku Kogyo | Domitor | |
| Midazolam | Astellas Pharma | Dormicum | |
| No.15 Disposable scalpel | Feather | 219AABZX00136000 | |
| Paraformaldehyde | Wako | 162-16065 | |
| Phosphate Buffered Saline 1x, pH 7.4 | Gibco | 10010049 | |
| Povidone-iodine | Y's Square | 872612 | |
| Rabbit anti-Cytokeratin 13 antibody | Abcam | ab92551 | |
| Rabbit anti-K14 | BioLegend | 905301 | |
| Rabbit anti-p63 antibody | Abcam | ab124762 | |
| Raspatorium #14 | AS ONE | 8-4599-01 | |
| Rat α6-integrin | BD Biosciences | 553745 | |
| Triton X-100 | Wako | 581-81705 | |
| Type I Collagen coated 24-well plate | Corning | 354408 | |
| Type I Collagen coated 60mm dish | Corning | 356401 | |
| Type I Collagen coated 6-well plate | Corning | 355400 |
References
- Presland, R. B., Jurevic, R. J. Making sense of the epithelial barrier: what molecular biology and genetics tell us about the functions of oral mucosal and epidermal tissues. Journal of Dental Education. 66 (4), 564-574 (2002).
- Squier, C. A., Kremer, M. J. Biology of oral mucosa and esophagus. Journal of the National Cancer Institute Monographs. (29), 7-15 (2001).
- Jones, K. B., Klein, O. D. Oral epithelial stem cells in tissue maintenance and disease: the first steps in a long journey. International Journal of Oral Science. 5 (3), 121-129 (2013).
- Winning, T. A., Townsend, G. C. Oral mucosal embryology and histology. Clinics in Dermatology. 18 (5), 499-511 (2000).
- Asaka, T., Akiyama, M., Kitagawa, Y., Shimizu, H. Higher density of label-retaining cells in gingival epithelium. Journal of Dermatological Science. 55 (2), 132-134 (2009).
- Bickenbach, J. R. Identification and behavior of label-retaining cells in oral mucosa and skin. Journal of Dental Research. 60, 1611-1620 (1981).
- Bickenbach, J. R., Mackenzie, I. C. Identification and localization of label-retaining cells in hamster epithelia. Journal of Investigative Dermatology. 82 (6), 618-622 (1984).
- Byrd, K. M., et al. Heterogeneity within stratified epithelial stem cell populations maintains the oral mucosa in response to physiological stress. Cell Stem Cell. 25 (6), 814-829 (2019).
- Jones, K. B., et al. Quantitative clonal analysis and single-cell transcriptomics reveal division kinetics, hierarchy, and fate of oral epithelial progenitor cells. Cell Stem Cell. 24 (1), 183-192 (2019).
- Willberg, J., Syrjanen, S., Hormia, M. Junctional epithelium in rats is characterized by slow cell proliferation. Journal of Periodontology. 77 (5), 840-846 (2006).
- Tanaka, T., et al. Identification of stem cells that maintain and regenerate lingual keratinized epithelial cells. Nature Cell Biology. 15 (5), 511-518 (2013).
- Compton, C. C., et al. Skin regenerated from cultured epithelial autografts on full-thickness burn wounds from 6 days to 5 years after grafting. A light, electron microscopic and immunohistochemical study. Laboratory Investigation. 60 (5), 600-612 (1989).
- Gallico, G. G., O’Connor, N. E., Compton, C. C., Kehinde, O., Green, H. Permanent coverage of large burn wounds with autologous cultured human epithelium. New England Journal of Medicine. 311 (7), 448-451 (1984).
- Guo, Z., et al. Building a microphysiological skin model from induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 4, 2 (2013).
- O’connor, N. E., Mulliken, J. B., Banksschlegel, S., Kehinde, O., Green, H. Grafting of burns with cultured epithelium prepared from autologous epidermal-cells. Lancet. 1 (8211), 75-78 (1981).
- Hennings, H., et al. Calcium regulation of growth and differentiation of mouse epidermal cells in culture. Cell. 19 (1), 245-254 (1980).
- Caldelari, R., Suter, M. M., Baumann, D., De Bruin, A., Muller, E. Long-term culture of murine epidermal keratinocytes. Journal of Investigative Dermatology. 114 (5), 1064-1065 (2000).
- Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice. Nature Protocols. 3 (5), 799-810 (2008).
- Yano, S., Okochi, H. Long-term culture of adult murine epidermal keratinocytes. British Journal of Dermatology. 153 (6), 1101-1104 (2005).
- Iglesias-Bartolome, R., et al. Transcriptional signature primes human oral mucosa for rapid wound healing. Science Translational Medicine. 10 (451), (2018).
- Papagerakis, S., et al. Oral epithelial stem cells – implications in normal development and cancer metastasis. Experimental Cell Research. 325 (2), 111-129 (2014).
- Szpaderska, A. M., Zuckerman, J. D., DiPietro, L. A. Differential injury responses in oral mucosal and cutaneous wounds. Journal of Dental Research. 82 (8), 621-626 (2003).
- Chen, L., et al. Positional differences in the wound transcriptome of skin and oral mucosa. BMC Genomics. 11, 471 (2010).
- Chen, L., Gajendrareddy, P. K., DiPietro, L. A. Differential expression of HIF-1alpha in skin and mucosal wounds. Journal of Dental Research. 91 (9), 871-876 (2012).
- Simoes, A., et al. Differential microRNA profile underlies the divergent healing responses in skin and oral mucosal wounds. Scientific Reports. 9 (1), 7160 (2019).
- Turabelidze, A., et al. Intrinsic differences between oral and skin keratinocytes. PLoS One. 9 (9), 101480 (2014).
- Aasen, T., Izpisua Belmonte, J. C. Isolation and cultivation of human keratinocytes from skin or plucked hair for the generation of induced pluripotent stem cells. Nature Protocols. 5 (2), 371-382 (2010).
- Izumi, K., Tobita, T., Feinberg, S. E. Isolation of human oral keratinocyte progenitor/stem cells. Journal of Dental Research. 86 (4), 341-346 (2007).
- Liu, Z., et al. A simplified and efficient method to isolate primary human keratinocytes from adult skin tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), (2018).
- Hatakeyama, S., et al. Establishment of gingival epithelial cell lines from transgenic mice harboring temperature sensitive simian virus 40 large T-antigen gene. Journal of Oral Pathology & Medicine. 30 (5), 296-304 (2001).
- Ookura, T., et al. Fibroblast and epidermal growth factors modulate proliferation and neural cell adhesion molecule expression in epithelial cells derived from the adult mouse tongue. In Vitro Cellular & Developmental Biology – Animal. 38 (6), 365-372 (2002).
- Parikh, N., Nagarajan, P., Sei-ichi, M., Sinha, S., Garrett-Sinha, L. A. Isolation and characterization of an immortalized oral keratinocyte cell line of mouse origin. Archives of Oral Biology. 53 (11), 1091-1100 (2008).
- Brennan, J. K., Mansky, J., Roberts, G., Lichtman, M. A. Improved methods for reducing calcium and magnesium concentrations in tissue culture medium: application to studies of lymphoblast proliferation in vitro. In Vitro. 11 (6), 354-360 (1975).
- Cerqueira, M. T., Frias, A. M., Reis, R. L., Marques, A. P. Interfollicular epidermal stem cells: boosting and rescuing from adult skin. Methods in Molecular Biology. 989, 1-9 (2013).
