בידוד ותרבות של קרטינוציטים אוראליים ראשוניים מחך העכבר למבוגרים

כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו על פי הנחיות הוועדה לניסוי בעלי חיים מוסדית באוניברסיטת קומאמוטו ובאוניברסיטת צוקובה. 1. הכנת ריאגנטים ומדיה תרבותית הכן 40 מ”ל של מדיום תרבות קרטינוציטים המכיל 60 מיקרומטר של סידן ו 600 μL של פתרון אנטיביוטי-אנטי-ממיקוטי. הכן 20 מ”ל של 0.025% טריפסין ו 400 μL של פתרון אנטיביוטי-אנטי-ממיקוטי. להפשיר את פתרון עיכוב טריפסין בטמפרטורת החדר ולשמור אותו ב 4 °C (5 °F) עד לשימוש בשלב 4.1.הערה: ריאגנט הבידוד מוכן לבידוד רקמות של חמישה עכברים. כדי להכין את המדיה התרבותית, לקחת 500 מ”ל של בינוני ולהוסיף 5 מ”ל של פתרון תוספת צמיחה (ראה טבלה של חומרים) (להלן המכונה בינוני מלא) ו 20% סרום בקר chelexed-עובר מרוקן סידן (FBS)33 (להלן המכונה chelexed-FBS). 2. ניתוח רקמת חיך מעכבר מבוגר להקריב עכבר C57BL/6J מבוגר (זכר או נקבה) על ידי פריקת צוואר הרחם בהתאם לתקנות המתקן הנוגעות לרווחת בעלי החיים. הסר את השיער סביב הפה עם מכונת גילוח. באמצעות מספריים, לחתוך מן הלחי לכיוון הלסת, משני הצדדים.הערה: העכבר צריך להיות מרדים לפני הקרבה. תערובת הרדמה של מדטומינדין, מידזולם, ו butorphanol משמש (ראה טבלה של חומרים). השתמש במלקחיים כדי לפתוח את הפה לרווחה ולספוג כל דם באמצעות צמר גפן. כדי לחטא את החיך, לנגב את החלק הפנימי של הפה עם צמר גפן המכיל 10% povidone-יוד. כדי לקצור את חיך העכבר, ראשית, להשתמש בלהב אזמל כירורגי כדי לבצע חתך שולי בעובי מלא לאורך צד החיך של השיניים מקסילרי. לאחר מכן, לנתח בזהירות את החיך כולו באמצעות raspatorium.הערה: פטל הוא כלי המשמש להעלאת דש רירית (ראו טבלת חומרים) (איור 1B). העבר במהירות את רקמת החיך לצינור 15 מ”ל המכיל 4 מ”ל של פתרון בינוני + אנטי-אנטי-מיקרוטי מלא. שמור את הרקמות על קרח עד מוכן דגירה.הערה: לאיסוף מעכברים מרובים, רקמות חיך עשוי להישמר על קרח עד 4 שעות. 3. טיפול מקדים ברקמת החיך במכסה המנוע לזרימה למינאר, להעביר רקמות לצלחת 60 מ”מ המכיל 4 מ”ל של מדיום מלא + פתרון אנטי-אנטי-מיקרוטי. באמצעות מלקחיים קצרים וקהים ולהב אזמל, להסיר בעדינות כל דם מן הרקמות. לשטוף רקמות 10 פעמים במדיום מלא. העבר רקמות לצלחת 35 מ”מ המכילה 4 מ”ל של 0.025% טריפסין + פתרון אנטיביוטי-אנטי-ממיקוטי, כאשר משטח האפיתל פונה כלפי מטה.הערה: משטח האפיתל, המתעקל פנימה, צריך להיות ספוג בתמיסת טריפסין; הלמינה פרופריה צריכה להתמודד עם הפנים כלפי מעלה. הרקמה צריכה להיות שטוחה ככל האפשר כדי להיות דגירה לחלוטין בתמיסת טריפסין. רקמות דגירה ב 0.025% טריפסין עבור ~ 16 שעות בטמפרטורת החדר בשכונת התרבות. 4. איסוף ותרבות של תאים ראשוניים באמצעות זוג אחד של מלקחיים קהים, להסיר רקמה מפתרון טריפסין (בצלחת 35 מ”מ) ולהעביר לתמיסת מעכב טריפסין בצלחת 60 מ”מ (4 מ”ל לצלחת) עם משטח האפיתל פונה כלפי מעלה. באמצעות מלקחיים כדי להחזיק בקצה החיך, לגרד בעדינות את שכבת האפיתל את propria למינה הבסיסית באמצעות להב אזמל.הערה: רקמת חיבור אינה מתעכלת על ידי טריפסין, ולכן היא אינה מתקלף במהלך גירוד. כדי לאסוף את הכמות המרבית של תאי אפיתל מרקמות, להעביר את הרקמה לתוך צלחת נוספת 60 מ”מ עם 4 מ”ל בינוני מלא ולחזור על שלב גירוד.הערה: הקפד להימנע מגרד את הרקמה עם קצה הלהב; השתמש בקצה הלהב במקום. גירוד מבוצע במשך 5-10 דקות לכל רקמה. מניחים מסננת תאי 100 מיקרומטר סטרילית על גבי צינור חרוטי 50 מ”ל. באמצעות פיפטה סטרילית, להעביר 2 מ”ל של פתרון טריפסין (בשלב 4.1) לתוך מסננת כדי להרטיב את פני השטח שלה. באמצעות פיפטה, מערבבים את מתלה התא בצלחת 60 מ”מ (משלבים 4.2-4.3) כמה פעמים ומסננים תאים דרך מסננת התאים 100 מיקרומטר שהוכנה בשלבים 4.4-4.5. ספירת מספר התאים באמצעות המוציטים. הכן 15 μL של פתרון כחול טריפן ולהוסיף 15 μL של השעיית תא (שלב 4.6). העבר 10 μL של תערובת כחולה cell-trypan להמוציטומטר ולספור את מספר התאים.הערה: חתיכה אחת של חיך העכבר יכולה להניב עד מיליון תאים. בעת הספירה, צנטריפוגה הצינור (מ שלב 4.6) ב 100 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. שאף את סופרנטנט עם פיפטה. הוסף 2 מ”ל של מדיום מלא + chelexed-FBS לצינור. resuspend גלולה התא על ידי טריטוריה מספר פעמים באמצעות פיפטה 5 מ”ל. צלחת 2-5 x 105 תאים מעכבר אחד לבאר אחת של צלחת 24-well מצופה מראש עם קולגן סוג I (ראה טבלה של חומרים). לדגור על התאים ב 37 °C (55 °F) במשך 2 ימים מבלי לשנות את המדיום. יומיים לאחר הזריעה, להחליף חצי מדיום התרבות עם מדיום מלא + chelexed-FBS. בדוק את מורפולוגיית התא מתחת למיקרוסקופ. להאכיל תאים עם מדיום מלא + chelexed-FBS כל יומיים.הערה: לאחר זריעה, תאים בגדלים שונים נצפו. כ-3-5 ימים לאחר הזריעה, ניתן להבחין בקרטינוציטים עם מורפולוגיה מרוצפת אבן (איור 2). זה ייקח 1-2 שבועות של תרבות לפני המעבר הראשון יכול להתבצע ו 1-2 שבועות הבאים יש צורך לפני התאים מוכנים למעבר השני והשלישי. לאחר מכן, התאים יגדלו מהר יותר ועשויים להיות מוכנים לשימור קריופ. תאים יכולים להיות מצופים מחדש לבאר אחת (של צלחת 24-well) וצלחת 6-באר במעבר הראשון והשני, בהתאמה. המעבר הבא יהיה תלוי בצמיחת התא ובצפיפות. ניתן להשתמש ביחס פיצול תא של 1:2 או 1:3 לאחר הקטע השלישי. 5. מעבר קרטינוציט לאסוף 2 מ”ל של supernatant מן צלחת התרבות ולחלק לתוך צינור חרוטי 15 מ”ל (על קרח). לשטוף את התאים עם PBS סטרילי 1x פעמיים.הערה: כאשר התאים מגיעים למפגש של כ-70%-80%, הם מוכנים למעבר. הוסף 1 מ”ל של 0.05% טריפסין-EDTA למנה לבאר אחת של צלחת 6-well. דגירה במשך 5-15 דקות ב 37 °C (5 °F); בדוק לאחר 5 דקות כדי לראות אם התאים מתנתקים מהמנה. לנטרל את התגובה באמצעות 1 מ”ל של פתרון עיכוב טריפסין ו 2 מ”ל של מדיום תרבות מלאה + chelexed-FBS על ידי pipetting עדין. לאחר מכן, להעביר את השעיית התא לתוך אותו צינור חרוטי 15 מ”ל כמו בשלב 5.1. צנטריפוגה השעיית התא ב 100 x g במשך 5 דקות ב 4 °C (70 °F). שאפו את supernatant עם pipette ו resuspend גלולה התא ב 1 מ”ל של מדיום תרבות מלאה. תספור את התאים באמצעות המוצ’ימומטר. לאחר מכן, צלחת 1 מ”ל של השעיית התא לתוך צלחת תרבות חדשה 24 או 6-well.הערה: חלק מהתאים מהמעברים המוקדמים יכולים להיות קפואים בתערובת של 70% מדיום תרבות מלא + 20% chelexed-FBS + 10% DMSO. 1-2 cryovials של תאים ניתן לאסוף מצלחת תרבות אחת. 6. שימור קריופרה והתאוששות של קרטינוציטים הקפאת תאים הגדל קרטינוציטים ל-80%-90% השפעה.הערה: אל תאפשר לתאים לגדול יתר על המידה, שכן הדבר עשוי להפחית את מצב ההתפשטות שלהם ואת הכדאיות שלהם. לטפל קרטינוציטים בצלחת עם 0.05% טריפסין-EDTA, כמתואר בשלבים 5.1-5.5. תספור את הקרטינוציטים באמצעות המוציטים. הכן cryovials המבוסס על מספרי תאים מחושבים כדי לאפשר העברה של 1 x 106 תאים / מ”ל לכל מקטורן. צנטריפוגה השעיית התא ב 100 x g במשך 5 דקות ב 4 °C (70 °F). להשליך את supernatant ו resuspend את גלולה התא בפתרון 10 מ”ל של 10% DMSO + 20% chelexed-FBS + 70% בינוני תרבות מלאה (9 מ”ל של מדיום מלא + chelexed-FBS ו 1 מ”ל של DMSO). מחלקים את התאים לתוך cryovials ב 1 מ”ל של השעיה לכל מקטורן. מניחים את הבקבוקונים במיכל אחסון קריוגני למשך הלילה ב -80 מעלות צלזיוס. מעבירים את הבקבוקונים למיכל חנקן נוזלי למחרת. שחזור תאים מוציאים קריוביאלי ממיכל החנקן הנוזלי ומפשירים חלקית בטמפרטורת החדר. בצינור 15 מ”ל, לערבב 1 מ”ל של השעיית התא עם 3 מ”ל של מדיום תרבות מלאה + chelexed-FBS. צנטריפוגות התערובת במשך 5 דקות ב 100 x גרם ו 4 °C (5 °F). להשליך את supernatant ו resuspend הכדור ב 1 מ”ל של מדיום תרבות מלאה + chelexed-FBS. צלחת התלי התא לתוך מנות תרבות קולגן I חדש 60 מ”מ מצופה. החלף את המדיום התרבותי כל 2-3 ימים ועבר את התאים פעם אחת. 7. כתמים חיסוניים תרבית קרטינוציטים אוראליים על כיסויים מרובעים (22 מ”מ x 22 מ”מ) בלוחות 6-well (5 x 105 תאים / טוב) במשך יומיים. תקן קרטינוציטים בתמיסה של 4% paraformaldehyde (PFA) ו- PBS למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר לפני הכביסה שלוש פעמים עם PBS 1x. פרמזייליזציה תאים בפתרון של 0.1% טריטון ב- PBS. תאי דגירה בחסימת ריאגנט (2.5% סרום עזים, סרום חמור 2.5% ) למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר, ואחריו דגירה לילית עם נוגדנים ראשוניים (ראה טבלה של חומרים) ב 4 °C (5 °F).הערה: נוגדנים ראשוניים שימשו בדילול הבא: ארנב אנטי K14 (1:1000), חולדה α6-integrin (1:100), ארנב אנטי p63 (1:500), ארנב אנטי K13 (1:100), ו עיזים נגד PDGFRα (1:100). לשטוף דגימות בתמיסה של 0.1% טריטון ב- PBS, ואחריו דגירה עם נוגדנים משניים במשך 1 שעה בטמפרטורת החדר.הערה: הנוגדנים המשניים (Alexa 488 או 555) שימשו בדילול של 1:300. תתקן את כל הדגימות עם תמיסת Hoechst במשך 10 דקות ולהרכיב תאים על מגלשות זכוכית.הערה: פתרון Hoechst משמש להכתים את הגרעינים של תאים. בצע הדמיה לדוגמה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי.הערה: הבהירות והחדות מותאמות לעוצמה שווה באמצעות תוכנת עריכת תמונות.