Ex Vivo Elektroretinogramın Küçük ve Büyük Gözlerde Retina Fonksiyonunu İncelemesi için Kurulum ve Koşulların Optimize Edilmesi
Summary
Mevcut multielektrot dizisinin veya yama kelepçesi ekipmanının modifikasyonu, ex vivo elektroretinogramı daha yaygın olarak erişilebilir hale getirir. Exvivo ışık yanıtlarını kaydetmek ve sürdürmek için geliştirilmiş yöntemler, sağlıklı retinada, göz hastalıklarının hayvan modellerinde ve insan donör retinalarında fotoreseptör ve ON-bipolar hücre fonksiyonunun incelenmesini kolaylaştırır.
Abstract
Retinal nöronal ışık yanıtlarının ölçümleri, sağlıklı retinanın fizyolojisinin araştırılması, retina hastalıklarında patolojik değişikliklerin belirlenmesi ve terapötik müdahalelerin test edilmesi için kritik öneme sahiptir. Exvivo elektroretinogram (ERG), spesifik farmakolojik ajanların eklenmesi ve sistemik etkilerden bağımsız olarak doku-intrinsik değişikliklerin değerlendirilmesi yoluyla izole retinadaki bireysel hücre tiplerinin katkılarının ölçülmesine olanak tanır. Retinal ışık tepkileri, mevcut yama kelepçesi veya mikroelektrot dizisi ekipmanından modifiye edilmiş özel bir ex vivo ERG numune tutucu ve kayıt kurulumu kullanılarak ölçülebilir. Özellikle, ON-bipolar hücrelerin ve aynı zamanda fotoreseptörlerin incelenmesi, zaman içinde ex vivo ERG’deki ışık tepkilerinin yavaş ama ilerleyici düşüşü ile engellenmiştir. Artan perfüzyon hızı ve perfüzyon sıcaklığının ayarlanması, ex vivo retinal fonksiyonu iyileştirir ve yanıt genliğini ve stabilitesini en üst düzeye çıkarır. Exvivo ERG, bireysel retinal nöronal hücre tiplerinin incelenmesine benzersiz bir şekilde izin verir. Ek olarak, yanıt genliklerini ve stabilitesini en üst düzeye çıkarmaya yönelik iyileştirmeler, büyük hayvanlardan ve insan donör gözlerinden alınan retina örneklerinde ışık yanıtlarının araştırılmasına izin vererek, ex vivo ERG’yi retina fonksiyonunu araştırmak için kullanılan tekniklerin repertuarına değerli bir katkı sağlar.
Introduction
Elektroretinografi, ışığa yanıt olarak retina fonksiyonunu ölçer1. Retina fizyolojisi ve patofizyolojisini incelemek ve retina hastalıkları için tedavilerin başarısını ölçmek için ayrılmaz bir bütündür. İn vivo ERG, bozulmamış organizmalarda retina fonksiyonunu değerlendirmek için yaygın olarak kullanılır, ancak önemli sınırlamaları vardır 2,3. Bunlar arasında, in vivo ERG’deki bireysel retinal hücre tiplerinin kantitatif analizi, tüm retinal hücrelerden ışık uyaranlarına kadar potansiyel değişikliklerin toplamını ve dolayısıyla üst üste binen tepkileri kaydettiği için engellenmektedir4. Ayrıca, retinaya ilaç eklenmesine kolayca izin vermez, sistemik etkilere karşı savunmasızdır ve nispeten düşük bir sinyal-gürültü oranına sahiptir. Bu dezavantajlar, izole retina 2,3,5,6’nın işlevini araştıran ex vivo ERG’de ortadan kaldırılmıştır. Exvivo ERG, farmakolojik inhibitörlerin eklenmesi ve süperfüzyona eklenebilen terapötik ajanların kolay değerlendirilmesi ile spesifik retinal hücre tiplerinden büyük ve stabil yanıtların kaydedilmesini sağlar. Aynı zamanda, sistemik etkilerin etkilerini ortadan kaldırır ve fizyolojik gürültüyü (örneğin, kalp atışı veya solunum) ortadan kaldırır.
Ex vivo ERG’de, retinalar veya retinal örnekler izole edilir ve numune tutucu 3,5’in kubbesi üzerinde fotoreseptör tarafı yukarı doğru monte edilir. Numune tutucu monte edilir, retinaya ısıtılmış, oksijenli ortam sağlayan bir perfüzyon sistemine bağlanır ve bilgisayar kontrollü ışık uyaranları vermek için modifiye edilmiş bir mikroskop sahnesine yerleştirilir. Işığın ortaya çıkardığı tepkileri kaydetmek için, numune tutucu bir amplifikatöre, sayısallaştırıcıya ve kayıt sistemine bağlanır (Şekil 1). Bu teknik, ışık uyaranlarının parametrelerini değiştirerek ve farmakolojik ajanlar ekleyerek çubuk ve koni fotoreseptörlerinden, ON-bipolar hücrelerden ve Müller glia’dan gelen yanıtların izole edilmesini sağlar.
Mevcut bir yama kelepçesi veya çoklu elektrot dizisi (MEA) kurulumu, fareler gibi küçük hayvan modellerinden retinalardaki ışık tepkilerini ölçmek için piyasada satılan bir ex vivo ERG adaptörü veya özel bir polikarbonat bilgisayar sayısal kontrol (CNC) ile işlenmiş numune tutucu ile birlikte ex vivo ERG’yi kaydetmek için dönüştürülebilir. Bu değişiklik, ex vivo ERG’nin erişilebilirliğini artırırken, özel ekipman ihtiyacını en aza indirir. Numune tutucunun tasarımı, montaj tekniğini basitleştirir ve elektrotları entegre ederek, daha önce bildirilen transretinal ex vivo ERG yöntemlerine kıyasla mikroelektrotların manipülasyon ihtiyacını ortadan kaldırır7. Numune tutucunun içindeki perfüzyon hızı ve sıcaklık, fotoreseptörlerden ve ON-bipolar hücrelerden gelen yanıt özelliklerini etkileyen önemli faktörlerdir. Bu koşulları ayarlayarak, ex vivo ERG, izole fare retinasından uzun süre boyunca güvenilir bir şekilde kaydedilebilir. Optimize edilmiş deneysel koşullar, büyük hayvan gözleri ve insan donör gözleri de dahil olmak üzere daha büyük retinalardan retinal yumruklarda ex vivo ERG kayıtlarına izin verir8.
Protocol
Representative Results
Discussion
İlk olarak 1865 yılında Holmgren tarafından amfibi retina10’dan retinal ışık tepkilerini ölçmek için geliştirilen teknik kısıtlamalar başlangıçta ERG’nin yaygın olarak kullanılmasını engelledi. Bununla birlikte, Ragnar Granit ve diğerleri tarafından yapılan seminal çalışmalar, ERG’nin hücresel kökenlerini tanımladı ve fotoreseptör ve ON-bipolar hücre yanıtlarını ex vivo 11,12,13 olarak…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Ulusal Göz Enstitüsü’nün Dr. Vinberg’e EY02665 ve EY031706 ve Uluslararası Retinal Araştırma Vakfı, Ulusal Sağlık Enstitüleri Çekirdek Hibe (EY014800) ve New York, NY’daki Körlüğü Önleme Araştırmalarından Utah Üniversitesi Oftalmoloji ve Görsel Bilimler Bölümü’ne Sınırsız Hibe ile desteklenmiştir. Dr. Frans Vinberg ayrıca Körlüğü Önleme Araştırması / Dr. H. James ve Carole Ücretsiz Kariyer Geliştirme Ödülü ve ARVO EyeFind hibesinden Dr. Silke Becker’in de sahibidir. Scripps Araştırma Enstitüsü’nden Dr. Anne Hanneken’e, Şekil 2E’de gösterilen kayıtlar için kullanılan donör gözünü sağladığı için teşekkür ederiz.
Materials
| 2 mm socket | WPI | 2026-10 | materials to prepare electrode |
| Ag/AgCl Electrode | World Precision Instruments | EP1 | materials to prepare electrode |
| Ames' medium | Sigma Aldrich | A1420 | perfusion media |
| barium chloride | Sigma Aldrich | B0750 | potassium channel blocker |
| DL-AP4 | Tocris | 0101 | broad spectrum glutamatergic antagonist |
| OcuScience Ex Vivo ERG Adapter | OcuScience | n/a | ex vivo ERG specimen holder |
| Threaded luer connector | McMaster-Carr | 51525K222 or 51525K223 | materials to prepare electrode |
References
- Perlman, I., Kolb, H., Fernandez, E., Nelson, R. . Webvision: The Organization of the Retina and Visual System. , (1995).
- Bonezzi, P. J., Tarchick, M. J., Renna, J. M. Ex vivo electroretinograms made easy: performing ERGs using 3D printed components. Journal of Physiology. 598 (21), 4821-4842 (2020).
- Vinberg, F., Kefalov, V. Simultaneous ex vivo functional testing of two retinas by in vivo electroretinogram system. Journal of Visualized Experiments. (99), e52855 (2015).
- Heckenlively, J. R., Arden, G. B. . Principles and Practice of Clinical Electrophysiology of Vision. , (2006).
- Vinberg, F., Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. Ex vivo ERG analysis of photoreceptors using an in vivo ERG system. Vision Research. 101, 108-117 (2014).
- Winkler, B. S. Calcium and the fast and slow components of P3 of the electroretinogram of the isolated rat retina. Vision Research. 14 (1), 9-15 (1974).
- Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. A dissection of the electroretinogram from the isolated rat retina with microelectrodes and drugs. Visual Neuroscience. 16 (4), 727-741 (1999).
- Abbas, F., et al. Revival of light signalling in the postmortem mouse and human retina. Nature. , (2022).
- Becker, S., Carroll, L. S., Vinberg, F. Diabetic photoreceptors: Mechanisms underlying changes in structure and function. Visual Neuroscience. 37, (2020).
- Kantola, L., Piccolino, M., Wade, N. J. The action of light on the retina: Translation and commentary of Holmgren (1866). Journal of the History of the Neurosciences. 28 (4), 399-415 (2019).
- Frank, R. N., Dowling, J. E. Rhodopsin photoproducts: effects on electroretinogram sensitivity in isolated perfused rat retina. Science. 161 (3840), 487-489 (1968).
- Hamasaki, D. I. The effect of sodium ion concentration on the electroretinogram of the isolated retina of the frog. Journal of Physiology. 167 (1), 156-168 (1963).
- Granit, R. The components of the retinal action potential in mammals and their relation to the discharge in the optic nerve. Journal of Physiology. 77 (3), 207-239 (1933).
- Donner, K., Hemila, S., Koskelainen, A. Temperature-dependence of rod photoresponses from the aspartate-treated retina of the frog (Rana temporaria). Acta Physiologica Scandinavica. 134 (4), 535-541 (1988).
- Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. Electrophysiological properties of a new isolated rat retina preparation. Vision Research. 39 (13), 2165-2177 (1999).
- Luke, M., et al. The isolated perfused bovine retina–a sensitive tool for pharmacological research on retinal function. Brain Research Protocols. 16 (1-3), 27-36 (2005).
- Becker, S., Carroll, L. S., Vinberg, F. Rod phototransduction and light signal transmission during type 2 diabetes. BMJ Open Diabetes Research and Care. 8 (1), 001571 (2020).
- Nymark, S., Haldin, C., Tenhu, H., Koskelainen, A. A new method for measuring free drug concentration: retinal tissue as a biosensor. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (6), 2583-2588 (2006).
- Winkler, B. S., Kapousta-Bruneau, N., Arnold, M. J., Green, D. G. Effects of inhibiting glutamine synthetase and blocking glutamate uptake on b-wave generation in the isolated rat retina. Visual Neuroscience. 16 (2), 345-353 (1999).
