大小眼の網膜機能を研究するための Ex Vivo 網膜電図のセットアップと条件の最適化
Summary
既存の多電極アレイまたはパッチクランプ装置の改造により、 ex vivo 網膜電図がより広く利用できるようになります。 生体外 光応答を記録および維持するための改善された方法は、健康な網膜、眼疾患の動物モデル、およびヒトドナー網膜における光受容体およびONバイポーラ細胞機能の研究を容易にします。
Abstract
網膜ニューロン光応答の測定は、健康な網膜の生理機能を調査し、網膜疾患の病理学的変化を決定し、治療的介入をテストするために重要です。 ex vivo 網膜電図(ERG)は、特定の薬理学的物質を添加し、全身の影響とは無関係に組織固有の変化を評価することにより、単離された網膜の個々の細胞タイプからの寄与を定量化することができます。網膜の光応答は、既存のパッチクランプまたは微小電極アレイ装置から変更された特殊な ex vivo ERG試料ホルダーと記録セットアップを使用して測定できます。特に、ONバイポーラ細胞だけでなく光受容体の研究も、時間の経過に伴う ex vivoERG における光応答のゆっくりとした、しかし進行性の低下によって妨げられてきました。灌流速度の向上と灌流液温度の調整により、 ex vivo 網膜機能が改善され、応答振幅と安定性が最大化されます。 ex vivo ERGは、個々の網膜神経細胞タイプの研究を独自に可能にします。さらに、応答振幅と安定性を最大化するための改善により、大型動物やヒトドナーの目からの網膜サンプルの光応答の調査が可能になり、 ex vivo ERGは網膜機能の調査に使用される技術のレパートリーに貴重な追加となります。
Introduction
網膜電図は、光に応答して網膜機能を測定する1.これは、網膜生理学と病態生理学を研究し、網膜疾患の治療の成功を測定するために不可欠です。in vivo ERGは、無傷の生物の網膜機能を評価するために広く使用されていますが、重大な制限があります2,3。これらの中で、in vivo ERGにおける個々の網膜細胞タイプの定量分析は、すべての網膜細胞から光刺激への潜在的な変化の合計を記録し、したがって応答を重ね合わせるため、妨げられています4。さらに、網膜への薬物の添加を容易に許さず、全身の影響に対して脆弱であり、信号対雑音比が比較的低い。これらの欠点は、単離された網膜2、3、5、6の機能を調べるex vivo ERGにおいて排除される。ex vivo ERGは、薬理学的阻害剤の添加およびスーパーフューセートに添加することができる治療薬の容易な評価により、特定の網膜細胞型からの大規模で安定した応答の記録を可能にする。同時に、全身的影響の影響を除去し、生理学的ノイズ(例えば、心拍または呼吸)を排除する。
ex vivo ERGでは、網膜または網膜試料が単離され、標本ホルダー3,5のドーム上に感光体側を上にしてマウントされる。試料ホルダーは組み立てられ、網膜に加熱された酸素化媒体を供給する灌流システムに接続され、コンピューター制御の光刺激を提供するように変更された顕微鏡のステージに配置されます。光によって誘発された応答を記録するために、試料ホルダーはアンプ、デジタイザ、および記録システムに接続されています(図1)。この技術は、光刺激のパラメータを変更し、薬理学的物質を添加することにより、桿体および錐体光受容体、ONバイポーラ細胞、およびミュラーグリアからの応答の単離を可能にする。
既存のパッチクランプまたは多電極アレイ(MEA)セットアップは、市販のex vivo ERGアダプターまたはカスタムポリカーボネートコンピューター数値制御(CNC)機械加工された標本ホルダーと組み合わせて、ex vivo ERGを記録するように変換して、マウスなどの小動物モデルからの網膜の光応答を測定することができます。この変更により、特殊な機器の必要性を最小限に抑えながら、ex vivo ERGのアクセシビリティが向上します。試料ホルダーの設計により、取り付け技術が簡素化され、電極が統合されるため、以前に報告された経網膜ex vivo ERG法と比較して、微小電極の操作が不要になります7。試料ホルダー内の灌流速度と温度は、光受容体とONバイポーラ細胞からの応答特性に影響を与える重要な要素です。これらの条件を調整することにより、ex vivo ERGを単離されたマウス網膜から長期間にわたって確実に記録することができる。最適化された実験条件により、大型動物の目やヒトドナーの目など、より大きな網膜からの網膜パンチでのex vivoERG記録が可能になります8。
Protocol
Representative Results
Discussion
もともとは両生類の網膜10からの網膜光応答を測定するためにホルムグレンによって1865年に開発されましたが、当初は技術的な制約によりERGは広く使用されていませんでした。それにもかかわらず、Ragnar Granitらによる独創的な研究は、ERGの細胞起源を特定し、ex vivoで光受容体およびONバイポーラ細胞応答を測定した11,12,13<s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、National Eye Instituteの助成金EY02665およびEY031706、およびInternational Retinal Research FoundationからVinberg博士へのNational Institutes of Health Core Grant(EY014800)、およびニューヨーク州ニューヨークのユタ大学眼科・視覚科学部へのResearch to Prevention Blindnessからの無制限助成金の支援を受けた。フランス・ヴィンバーグ博士は、失明予防研究/H.ジェームズ博士とキャロルフリーキャリア開発賞、およびARVO EyeFind助成金のシルケベッカー博士の受賞者でもあります。図2Eに示す記録に使用されるドナーアイを提供してくれたスクリップス研究所のアン・ハンネケン博士に感謝します。
Materials
| 2 mm socket | WPI | 2026-10 | materials to prepare electrode |
| Ag/AgCl Electrode | World Precision Instruments | EP1 | materials to prepare electrode |
| Ames' medium | Sigma Aldrich | A1420 | perfusion media |
| barium chloride | Sigma Aldrich | B0750 | potassium channel blocker |
| DL-AP4 | Tocris | 0101 | broad spectrum glutamatergic antagonist |
| OcuScience Ex Vivo ERG Adapter | OcuScience | n/a | ex vivo ERG specimen holder |
| Threaded luer connector | McMaster-Carr | 51525K222 or 51525K223 | materials to prepare electrode |
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