Optimalisatie van de instellingen en voorwaarden voor ex vivo elektroretinogram om de retinafunctie in kleine en grote ogen te bestuderen
Summary
Modificatie van bestaande multi-elektrode array of patch clamp apparatuur maakt het ex vivo elektroretinogram breder toegankelijk. Verbeterde methoden om ex vivo lichtresponsen te registreren en te onderhouden vergemakkelijken de studie van fotoreceptor en ON-bipolaire celfunctie in het gezonde netvlies, diermodellen van oogziekten en menselijke donorvliezen.
Abstract
Metingen van retinale neuronale lichtresponsen zijn van cruciaal belang voor het onderzoeken van de fysiologie van het gezonde netvlies, het bepalen van pathologische veranderingen in retinale ziekten en het testen van therapeutische interventies. Het ex vivo elektroretinogram (ERG) maakt de kwantificering van bijdragen van individuele celtypen in het geïsoleerde netvlies mogelijk door toevoeging van specifieke farmacologische middelen en evaluatie van weefselintrinsieke veranderingen onafhankelijk van systemische invloeden. Retinale lichtresponsen kunnen worden gemeten met behulp van een gespecialiseerde ex vivo ERG-monsterhouder en opname-opstelling, aangepast van bestaande patchklem of micro-elektrode array-apparatuur. Met name de studie van ON-bipolaire cellen, maar ook van fotoreceptoren, werd belemmerd door de langzame maar progressieve afname van lichtresponsen in de ex vivo ERG in de loop van de tijd. Verhoogde perfusiesnelheid en aanpassing van de perfusaattemperatuur verbeteren de ex vivo retinale functie en maximaliseren de responsamplitude en stabiliteit. De ex vivo ERG maakt op unieke wijze de studie van individuele retinale neuronale celtypen mogelijk. Bovendien maken verbeteringen om responsamplitudes en stabiliteit te maximaliseren het onderzoek van lichtreacties in netvliesmonsters van grote dieren mogelijk, evenals menselijke donorogen, waardoor de ex vivo ERG een waardevolle aanvulling is op het repertoire van technieken die worden gebruikt om de retinale functie te onderzoeken.
Introduction
Elektroretinografie meet de retinale functie als reactie op licht1. Het is een integraal onderdeel van het bestuderen van retinale fysiologie en pathofysiologie, en het meten van het succes van therapieën voor retinale ziekten. De in vivo ERG wordt veel gebruikt om de retinale functie in intacte organismen te beoordelen, maar heeft significante beperkingen 2,3. Onder deze wordt de kwantitatieve analyse van individuele retinale celtypen in de in vivo ERG belemmerd, omdat het de som van potentiële veranderingen registreert, en dus overlappende reacties, van alle retinale cellen naar lichtstimuli4. Bovendien staat het niet gemakkelijk toevoeging van geneesmiddelen aan het netvlies toe, is het kwetsbaar voor systemische invloeden en heeft het een relatief lage signaal-ruisverhouding. Deze nadelen worden geëlimineerd in de ex vivo ERG die de functie van het geïsoleerde netvliesonderzoekt 2,3,5,6. De ex vivo ERG maakt de registratie mogelijk van grote en stabiele reacties van specifieke retinale celtypen door toevoeging van farmacologische remmers en eenvoudige evaluatie van therapeutische middelen, die aan het superfusaat kunnen worden toegevoegd. Tegelijkertijd verwijdert het invloeden van systemische effecten en elimineert het fysiologische ruis (bijv. Hartslag of ademhaling).
In de ex vivo ERG worden netvliezen of retinale monsters geïsoleerd en aan de zijkant van de fotoreceptor gemonteerd op de koepel van de monsterhouder 3,5. De monsterhouder wordt geassembleerd, verbonden met een perfusiesysteem dat het netvlies voorziet van verwarmde, zuurstofrijke media en op het podium van een microscoop geplaatst, die is aangepast om computergestuurde lichtstimuli te leveren. Om de reacties die door licht worden opgewekt vast te leggen, is de monsterhouder aangesloten op een versterker, digitizer en opnamesysteem (figuur 1). Deze techniek maakt isolatie van reacties van staaf- en kegelfotoreceptoren, ON-bipolaire cellen en Müller-glia mogelijk door de parameters van de lichtprikkels te veranderen en farmacologische middelen toe te voegen.
Een bestaande patchklem of multi-electrode array (MEA) opstelling kan worden geconverteerd om ex vivo ERG te registreren, hetzij in combinatie met een in de handel verkrijgbare ex vivo ERG-adapter of een aangepaste polycarbonaat computer numerieke controle (CNC) -gefreesde monsterhouder, om lichtreacties in netvliezen van kleine diermodellen, zoals muizen, te meten. Deze wijziging verhoogt de toegankelijkheid van ex vivo ERG terwijl de behoefte aan gespecialiseerde apparatuur wordt geminimaliseerd. Het ontwerp van de monsterhouder vereenvoudigt de montagetechniek en integreert elektroden, waardoor manipulatie van micro-elektroden in vergelijking met eerder gerapporteerde transretinale ex vivo ERG-methoden7 wordt geëlimineerd. De perfusiesnelheid en temperatuur in de monsterhouder zijn belangrijke factoren die de responseigenschappen van fotoreceptoren en ON-bipolaire cellen beïnvloeden. Door deze omstandigheden aan te passen, kan de ex vivo ERG gedurende langere tijd betrouwbaar worden geregistreerd vanaf het geïsoleerde netvlies van de muis. Geoptimaliseerde experimentele omstandigheden maken ex vivo ERG-opnames mogelijk in retinale stoten van grotere netvliezen, waaronder grote dierenogen en menselijke donorogen8.
Protocol
Representative Results
Discussion
Oorspronkelijk ontwikkeld in 1865 door Holmgren om retinale lichtresponsen van het netvlies van amfibieën te meten10, verhinderden technische beperkingen aanvankelijk dat de ERG op grote schaal werd gebruikt. Niettemin identificeerden baanbrekende studies door Ragnar Granit en anderen de cellulaire oorsprong van de ERG en maten fotoreceptor en ON-bipolaire celresponsen ex vivo 11,12,13. Sindsdie…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door national eye institute subsidies EY02665 en EY031706 en International Retinal Research Foundation aan Dr. Vinberg, National Institutes of Health Core Grant (EY014800), en een onbeperkte subsidie van onderzoek om blindheid te voorkomen, New York, NY, aan de afdeling oogheelkunde en visuele wetenschappen, Universiteit van Utah. Dr. Frans Vinberg is ook een ontvanger van een Research to Prevent Blindness / Dr. H. James and Carole Free Career Development Award, en Dr. Silke Becker van een ARVO EyeFind-beurs. We bedanken Dr. Anne Hanneken van The Scripps Research Institute voor het verstrekken van het donoroog dat wordt gebruikt voor opnames in figuur 2E.
Materials
| 2 mm socket | WPI | 2026-10 | materials to prepare electrode |
| Ag/AgCl Electrode | World Precision Instruments | EP1 | materials to prepare electrode |
| Ames' medium | Sigma Aldrich | A1420 | perfusion media |
| barium chloride | Sigma Aldrich | B0750 | potassium channel blocker |
| DL-AP4 | Tocris | 0101 | broad spectrum glutamatergic antagonist |
| OcuScience Ex Vivo ERG Adapter | OcuScience | n/a | ex vivo ERG specimen holder |
| Threaded luer connector | McMaster-Carr | 51525K222 or 51525K223 | materials to prepare electrode |
References
- Perlman, I., Kolb, H., Fernandez, E., Nelson, R. . Webvision: The Organization of the Retina and Visual System. , (1995).
- Bonezzi, P. J., Tarchick, M. J., Renna, J. M. Ex vivo electroretinograms made easy: performing ERGs using 3D printed components. Journal of Physiology. 598 (21), 4821-4842 (2020).
- Vinberg, F., Kefalov, V. Simultaneous ex vivo functional testing of two retinas by in vivo electroretinogram system. Journal of Visualized Experiments. (99), e52855 (2015).
- Heckenlively, J. R., Arden, G. B. . Principles and Practice of Clinical Electrophysiology of Vision. , (2006).
- Vinberg, F., Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. Ex vivo ERG analysis of photoreceptors using an in vivo ERG system. Vision Research. 101, 108-117 (2014).
- Winkler, B. S. Calcium and the fast and slow components of P3 of the electroretinogram of the isolated rat retina. Vision Research. 14 (1), 9-15 (1974).
- Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. A dissection of the electroretinogram from the isolated rat retina with microelectrodes and drugs. Visual Neuroscience. 16 (4), 727-741 (1999).
- Abbas, F., et al. Revival of light signalling in the postmortem mouse and human retina. Nature. , (2022).
- Becker, S., Carroll, L. S., Vinberg, F. Diabetic photoreceptors: Mechanisms underlying changes in structure and function. Visual Neuroscience. 37, (2020).
- Kantola, L., Piccolino, M., Wade, N. J. The action of light on the retina: Translation and commentary of Holmgren (1866). Journal of the History of the Neurosciences. 28 (4), 399-415 (2019).
- Frank, R. N., Dowling, J. E. Rhodopsin photoproducts: effects on electroretinogram sensitivity in isolated perfused rat retina. Science. 161 (3840), 487-489 (1968).
- Hamasaki, D. I. The effect of sodium ion concentration on the electroretinogram of the isolated retina of the frog. Journal of Physiology. 167 (1), 156-168 (1963).
- Granit, R. The components of the retinal action potential in mammals and their relation to the discharge in the optic nerve. Journal of Physiology. 77 (3), 207-239 (1933).
- Donner, K., Hemila, S., Koskelainen, A. Temperature-dependence of rod photoresponses from the aspartate-treated retina of the frog (Rana temporaria). Acta Physiologica Scandinavica. 134 (4), 535-541 (1988).
- Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. Electrophysiological properties of a new isolated rat retina preparation. Vision Research. 39 (13), 2165-2177 (1999).
- Luke, M., et al. The isolated perfused bovine retina–a sensitive tool for pharmacological research on retinal function. Brain Research Protocols. 16 (1-3), 27-36 (2005).
- Becker, S., Carroll, L. S., Vinberg, F. Rod phototransduction and light signal transmission during type 2 diabetes. BMJ Open Diabetes Research and Care. 8 (1), 001571 (2020).
- Nymark, S., Haldin, C., Tenhu, H., Koskelainen, A. A new method for measuring free drug concentration: retinal tissue as a biosensor. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (6), 2583-2588 (2006).
- Winkler, B. S., Kapousta-Bruneau, N., Arnold, M. J., Green, D. G. Effects of inhibiting glutamine synthetase and blocking glutamate uptake on b-wave generation in the isolated rat retina. Visual Neuroscience. 16 (2), 345-353 (1999).
