Otimizando a configuração e as condições do eletrorretinograma ex vivo para estudar a função da retina em olhos pequenos e grandes
Summary
A modificação do equipamento de matriz de multieletrodos ou patch clamp existente torna o eletrorretinograma ex vivo mais amplamente acessível. Métodos aprimorados para registrar e manter respostas à luz ex vivo facilitam o estudo da função fotorreceptora e das células ON-bipolar na retina saudável, modelos animais de doenças oculares e retinas de doadores humanos.
Abstract
As medições das respostas à luz neuronal da retina são críticas para investigar a fisiologia da retina saudável, determinar alterações patológicas em doenças da retina e testar intervenções terapêuticas. O eletrorretinograma ex vivo (ERG) permite a quantificação de contribuições de tipos celulares individuais na retina isolada por adição de agentes farmacológicos específicos e avaliação de alterações tecidual intrínsecas independentemente de influências sistêmicas. As respostas à luz da retina podem ser medidas usando um suporte de amostra ERG ex vivo especializado e uma configuração de gravação, modificada a partir do equipamento existente de patch clamp ou microeletrodos. Particularmente, o estudo das células ON-bipolares, mas também dos fotorreceptores, tem sido dificultado pelo declínio lento, mas progressivo, das respostas à luz no ERG ex vivo ao longo do tempo. O aumento da velocidade de perfusão e o ajuste da temperatura do perfusato melhoram a função retiniana ex vivo e maximizam a amplitude e a estabilidade da resposta. O ERG ex vivo permite exclusivamente o estudo de tipos individuais de células neuronais da retina. Além disso, melhorias para maximizar as amplitudes de resposta e a estabilidade permitem a investigação de respostas luminosas em amostras de retina de animais de grande porte, bem como em olhos de doadores humanos, tornando o ERG ex vivo uma adição valiosa ao repertório de técnicas utilizadas para investigar a função retiniana.
Introduction
A eletrorretinografia mede a função retiniana em resposta à luz1. É essencial para estudar a fisiologia e fisiopatologia da retina e medir o sucesso das terapias para doenças da retina. O ERG in vivo é amplamente utilizado para avaliar a função retiniana em organismos intactos, mas apresenta limitações significativas 2,3. Dentre estes, a análise quantitativa de tipos individuais de células da retina no ERG in vivo é dificultada, uma vez que registra a soma das possíveis alterações e, portanto, sobrepondo as respostas, de todas as células da retina aos estímulos luminosos4. Além disso, não permite prontamente a adição de drogas à retina, é vulnerável a influências sistêmicas e tem uma relação sinal-ruído relativamente baixa. Essas desvantagens são eliminadas no ERG ex vivo que investiga a função da retina isolada 2,3,5,6. O ERG ex vivo permite o registro de respostas grandes e estáveis de tipos específicos de células da retina por adição de inibidores farmacológicos e fácil avaliação de agentes terapêuticos, que podem ser adicionados ao superfusato. Ao mesmo tempo, remove influências de efeitos sistêmicos e elimina o ruído fisiológico (por exemplo, batimentos cardíacos ou respiração).
No ERG ex vivo, as retinas ou amostras de retina são isoladas e montadas do lado fotorreceptor na cúpula do suporte do espécime 3,5. O suporte da amostra é montado, conectado a um sistema de perfusão que fornece à retina meios aquecidos e oxigenados e colocado no palco de um microscópio, que foi modificado para fornecer estímulos de luz controlados por computador. Para registrar as respostas provocadas pela luz, o suporte do espécime é conectado a um amplificador, digitalizador e sistema de gravação (Figura 1). Esta técnica permite o isolamento de respostas de fotorreceptores de bastonetes e cones, células ON-bipolares e glia de Müller, alterando os parâmetros dos estímulos de luz e adicionando agentes farmacológicos.
Uma configuração existente de patch clamp ou multi-electrode array (MEA) pode ser convertida para registrar ERG ex vivo, em conjunto com um adaptador ERG ex vivo comercialmente disponível ou um suporte de amostra usinado por controle numérico computadorizado (CNC) de policarbonato personalizado, para medir as respostas à luz em retinas de pequenos modelos animais, como camundongos. Esta modificação aumenta a acessibilidade do ERG ex vivo, minimizando a necessidade de equipamentos especializados. O desenho do suporte do corpo de prova simplifica a técnica de montagem e integra eletrodos, eliminando a necessidade de manipulação de microeletrodos em comparação com os métodos ERG transretinais ex vivo relatados anteriormente7. A taxa de perfusão e a temperatura dentro do suporte da amostra são fatores importantes que afetam as propriedades de resposta dos fotorreceptores e das células ON-bipolares. Ao ajustar essas condições, o ERG ex vivo pode ser registrado de forma confiável a partir da retina isolada do camundongo por períodos prolongados de tempo. Condições experimentais otimizadas permitem registros ex vivo de ERG em socos de retina de retinas maiores, incluindo olhos de animais de grande porte e olhos de doadores humanos8.
Protocol
Representative Results
Discussion
Originalmente desenvolvido em 1865 por Holmgren para medir as respostas de luz da retina a partir da retina do anfíbio10, restrições técnicas inicialmente impediram que o ERG fosse amplamente utilizado. No entanto, estudos seminais de Ragnar Granit e outros identificaram as origens celulares do ERG e mediram as respostas fotorreceptoras e celulares ON-bipolar ex vivo11,12,13. Desde então, m?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelas bolsas do National Eye Institute EY02665 e EY031706 e pela International Retinal Research Foundation para o Dr. Vinberg, National Institutes of Health Core Grant (EY014800) e uma Concessão Irrestrita de Pesquisa para Prevenir a Cegueira, Nova York, NY, para o Departamento de Oftalmologia e Ciências Visuais da Universidade de Utah. O Dr. Frans Vinberg também recebeu um Prêmio de Pesquisa para Prevenir a Cegueira / Dr. H. James e Carole Free Career Development e a Dra. Silke Becker de uma bolsa ARVO EyeFind. Agradecemos à Dra. Anne Hanneken, do Instituto de Pesquisa Scripps, por fornecer o olho doador usado para gravações mostradas na Figura 2E.
Materials
| 2 mm socket | WPI | 2026-10 | materials to prepare electrode |
| Ag/AgCl Electrode | World Precision Instruments | EP1 | materials to prepare electrode |
| Ames' medium | Sigma Aldrich | A1420 | perfusion media |
| barium chloride | Sigma Aldrich | B0750 | potassium channel blocker |
| DL-AP4 | Tocris | 0101 | broad spectrum glutamatergic antagonist |
| OcuScience Ex Vivo ERG Adapter | OcuScience | n/a | ex vivo ERG specimen holder |
| Threaded luer connector | McMaster-Carr | 51525K222 or 51525K223 | materials to prepare electrode |
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