تحسين الإعداد والظروف لمخطط كهربية الشبكية خارج الجسم الحي لدراسة وظيفة شبكية العين في العيون الصغيرة والكبيرة
Summary
إن تعديل مجموعة الأقطاب المتعددة أو معدات مشبك التصحيح الحالية يجعل مخطط كهربية الشبكية خارج الجسم الحي متاحا على نطاق أوسع. تسهل الطرق المحسنة لتسجيل استجابات الضوء خارج الجسم الحي والحفاظ عليها دراسة وظيفة مستقبلات الضوء والخلايا ثنائية القطب في شبكية العين السليمة ، والنماذج الحيوانية لأمراض العيون ، وشبكية العين من متبرع بشري.
Abstract
تعد قياسات استجابات الضوء العصبي في شبكية العين أمرا بالغ الأهمية للتحقيق في فسيولوجيا شبكية العين السليمة ، وتحديد التغيرات المرضية في أمراض الشبكية ، واختبار التدخلات العلاجية. يسمح مخطط كهربية الشبكية خارج الجسم الحي (ERG) بتحديد المساهمات من أنواع الخلايا الفردية في شبكية العين المعزولة عن طريق إضافة عوامل دوائية محددة وتقييم التغيرات الجوهرية للأنسجة بشكل مستقل عن التأثيرات الجهازية. يمكن قياس استجابات ضوء الشبكية باستخدام حامل عينة ERG متخصص خارج الجسم الحي وإعداد التسجيل ، ويتم تعديله من مشبك التصحيح الحالي أو معدات صفيف الأقطاب الكهربائية الدقيقة. على وجه الخصوص ، تم إعاقة دراسة الخلايا ثنائية القطب ON ، ولكن أيضا المستقبلات الضوئية ، بسبب الانخفاض البطيء ولكن التدريجي لاستجابات الضوء في ERG خارج الجسم الحي بمرور الوقت. تعمل زيادة سرعة التروية وتعديل درجة حرارة النفاذية على تحسين وظيفة الشبكية خارج الجسم الحي وزيادة سعة الاستجابة والاستقرار. يسمح ERG خارج الجسم الحي بشكل فريد بدراسة أنواع الخلايا العصبية الشبكية الفردية. بالإضافة إلى ذلك ، تسمح التحسينات لزيادة سعة الاستجابة والاستقرار إلى أقصى حد بالتحقيق في استجابات الضوء في عينات شبكية العين من الحيوانات الكبيرة ، وكذلك عيون المتبرعين من البشر ، مما يجعل ERG خارج الجسم الحي إضافة قيمة إلى ذخيرة التقنيات المستخدمة للتحقيق في وظيفة الشبكية.
Introduction
يقيس تخطيط كهربية الشبكية وظيفة الشبكية استجابة للضوء1. إنه جزء لا يتجزأ من دراسة فسيولوجيا الشبكية والفيزيولوجيا المرضية ، وقياس نجاح علاجات أمراض الشبكية. يستخدم ERG في الجسم الحي على نطاق واسع لتقييم وظيفة الشبكية في الكائنات الحية السليمة ، ولكن له قيود كبيرة 2,3. من بين هذه ، يتم إعاقة التحليل الكمي لأنواع خلايا الشبكية الفردية في الجسم الحي ERG ، لأنه يسجل مجموع التغييرات المحتملة ، وبالتالي تراكب الاستجابات ، من جميع خلايا الشبكية إلى المنبهات الضوئية4. علاوة على ذلك ، فإنه لا يسمح بسهولة بإضافة الأدوية إلى شبكية العين ، وهو عرضة للتأثيرات الجهازية ، ولديه نسبة إشارة إلى ضوضاء منخفضة نسبيا. يتم التخلص من هذه العيوب في خارج الجسم الحي ERG الذي يبحث في وظيفة شبكية العينالمعزولة 2،3،5،6. يسمح ERG خارج الجسم الحي بتسجيل استجابات كبيرة ومستقرة من أنواع معينة من خلايا الشبكية عن طريق إضافة مثبطات دوائية وتقييم سهل للعوامل العلاجية ، والتي يمكن إضافتها إلى superfusate. في الوقت نفسه ، يزيل تأثيرات التأثيرات الجهازية ويزيل الضوضاء الفسيولوجية (مثل ضربات القلب أو التنفس).
في خارج الجسم الحي ERG ، يتم عزل شبكية العين أو عينات الشبكية وتثبيتها على جانب المستقبلات الضوئية لأعلى على قبة حامل العينة 3,5. يتم تجميع حامل العينة ، وتوصيله بنظام التروية الذي يزود شبكية العين بوسائط ساخنة ومؤكسجة ، ويوضع على مرحلة المجهر ، والذي تم تعديله لتقديم محفزات ضوئية يتم التحكم فيها بواسطة الكمبيوتر. لتسجيل الاستجابات المستنبطة بالضوء ، يتم توصيل حامل العينة بمكبر للصوت ومحول رقمي ونظام تسجيل (الشكل 1). تسمح هذه التقنية بعزل الاستجابات عن المستقبلات الضوئية للقضيب والمخروط ، والخلايا ثنائية القطب ON-القطب، و Müller glia عن طريق تغيير معلمات المحفزات الضوئية وإضافة عوامل دوائية.
يمكن تحويل مشبك التصحيح الحالي أو إعداد الصفيف متعدد الأقطاب الكهربائية (MEA) لتسجيل ERG خارج الجسم الحي ، إما بالاقتران مع محول ERG خارج الجسم الحي المتاح تجاريا أو حامل عينة مخصص للتحكم العددي بالكمبيوتر من البولي كربونات (CNC) ، لقياس استجابات الضوء في شبكية العين من نماذج الحيوانات الصغيرة ، مثل الفئران. يزيد هذا التعديل من إمكانية الوصول إلى ERG خارج الجسم الحي مع تقليل الحاجة إلى المعدات المتخصصة. يبسط تصميم حامل العينة تقنية التركيب ويدمج الأقطاب الكهربائية ، مما يلغي الحاجة إلى معالجة الأقطاب الكهربائية الدقيقة مقارنة بطرق ERG عبر الشبكية خارج الجسم الحي المبلغ عنها سابقا7. يعد معدل التروية ودرجة الحرارة داخل حامل العينة من العوامل المهمة التي تؤثر على خصائص الاستجابة من المستقبلات الضوئية والخلايا ثنائية القطب ON. من خلال ضبط هذه الظروف ، يمكن تسجيل ERG خارج الجسم الحي بشكل موثوق من شبكية الفأر المعزولة على مدى فترات طويلة من الزمن. تسمح الظروف التجريبية المحسنة بتسجيلات ERG خارج الجسم الحي في لكمات شبكية العين من شبكية أكبر ، بما في ذلك عيون الحيوانات الكبيرة وعيون المتبرع البشري8.
Protocol
Representative Results
Discussion
تم تطويره في الأصل في عام 1865 بواسطة Holmgren لقياس استجابات ضوء الشبكية من شبكية العينالبرمائية 10 ، وقد حالت القيود التقنية في البداية دون استخدام ERG على نطاق واسع. ومع ذلك ، حددت الدراسات الأساسية التي أجراها راجنار جرانيت وآخرون الأصول الخلوية ل ERG وقياس المستقبلات الضوئية واست?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من خلال منح المعهد الوطني للعيون EY02665 و EY031706 والمؤسسة الدولية لأبحاث الشبكية للدكتور فينبرغ ، والمنحة الأساسية للمعاهد الوطنية للصحة (EY014800) ، ومنحة غير مقيدة من أبحاث الوقاية من العمى ، نيويورك ، نيويورك ، إلى قسم طب العيون والعلوم البصرية ، جامعة يوتا. حصل الدكتور فرانس فينبرغ أيضا على جائزة البحث لمنع العمى / جائزة الدكتور إتش جيمس وكارول للتطوير الوظيفي المجاني ، والدكتورة سيلك بيكر من منحة ARVO EyeFind. نشكر الدكتورة آن هانيكين من معهد سكريبس للأبحاث على توفير عين المتبرع المستخدمة في التسجيلات الموضحة في الشكل 2E.
Materials
| 2 mm socket | WPI | 2026-10 | materials to prepare electrode |
| Ag/AgCl Electrode | World Precision Instruments | EP1 | materials to prepare electrode |
| Ames' medium | Sigma Aldrich | A1420 | perfusion media |
| barium chloride | Sigma Aldrich | B0750 | potassium channel blocker |
| DL-AP4 | Tocris | 0101 | broad spectrum glutamatergic antagonist |
| OcuScience Ex Vivo ERG Adapter | OcuScience | n/a | ex vivo ERG specimen holder |
| Threaded luer connector | McMaster-Carr | 51525K222 or 51525K223 | materials to prepare electrode |
References
- Perlman, I., Kolb, H., Fernandez, E., Nelson, R. . Webvision: The Organization of the Retina and Visual System. , (1995).
- Bonezzi, P. J., Tarchick, M. J., Renna, J. M. Ex vivo electroretinograms made easy: performing ERGs using 3D printed components. Journal of Physiology. 598 (21), 4821-4842 (2020).
- Vinberg, F., Kefalov, V. Simultaneous ex vivo functional testing of two retinas by in vivo electroretinogram system. Journal of Visualized Experiments. (99), e52855 (2015).
- Heckenlively, J. R., Arden, G. B. . Principles and Practice of Clinical Electrophysiology of Vision. , (2006).
- Vinberg, F., Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. Ex vivo ERG analysis of photoreceptors using an in vivo ERG system. Vision Research. 101, 108-117 (2014).
- Winkler, B. S. Calcium and the fast and slow components of P3 of the electroretinogram of the isolated rat retina. Vision Research. 14 (1), 9-15 (1974).
- Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. A dissection of the electroretinogram from the isolated rat retina with microelectrodes and drugs. Visual Neuroscience. 16 (4), 727-741 (1999).
- Abbas, F., et al. Revival of light signalling in the postmortem mouse and human retina. Nature. , (2022).
- Becker, S., Carroll, L. S., Vinberg, F. Diabetic photoreceptors: Mechanisms underlying changes in structure and function. Visual Neuroscience. 37, (2020).
- Kantola, L., Piccolino, M., Wade, N. J. The action of light on the retina: Translation and commentary of Holmgren (1866). Journal of the History of the Neurosciences. 28 (4), 399-415 (2019).
- Frank, R. N., Dowling, J. E. Rhodopsin photoproducts: effects on electroretinogram sensitivity in isolated perfused rat retina. Science. 161 (3840), 487-489 (1968).
- Hamasaki, D. I. The effect of sodium ion concentration on the electroretinogram of the isolated retina of the frog. Journal of Physiology. 167 (1), 156-168 (1963).
- Granit, R. The components of the retinal action potential in mammals and their relation to the discharge in the optic nerve. Journal of Physiology. 77 (3), 207-239 (1933).
- Donner, K., Hemila, S., Koskelainen, A. Temperature-dependence of rod photoresponses from the aspartate-treated retina of the frog (Rana temporaria). Acta Physiologica Scandinavica. 134 (4), 535-541 (1988).
- Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. Electrophysiological properties of a new isolated rat retina preparation. Vision Research. 39 (13), 2165-2177 (1999).
- Luke, M., et al. The isolated perfused bovine retina–a sensitive tool for pharmacological research on retinal function. Brain Research Protocols. 16 (1-3), 27-36 (2005).
- Becker, S., Carroll, L. S., Vinberg, F. Rod phototransduction and light signal transmission during type 2 diabetes. BMJ Open Diabetes Research and Care. 8 (1), 001571 (2020).
- Nymark, S., Haldin, C., Tenhu, H., Koskelainen, A. A new method for measuring free drug concentration: retinal tissue as a biosensor. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (6), 2583-2588 (2006).
- Winkler, B. S., Kapousta-Bruneau, N., Arnold, M. J., Green, D. G. Effects of inhibiting glutamine synthetase and blocking glutamate uptake on b-wave generation in the isolated rat retina. Visual Neuroscience. 16 (2), 345-353 (1999).
