אופטימיזציה של ההגדרה והתנאים עבור אלקטרורטינוגרמה של Ex Vivo כדי לחקור את תפקוד הרשתית בעיניים קטנות וגדולות
Summary
שינוי של מערך multielectrode קיים או ציוד מהדק תיקון עושה את ex vivo electroretinogram נגיש יותר. שיטות משופרות לתיעוד ושמירה על תגובות אור ex vivo מקלות על חקר תפקוד התאים הפוטורצפטורים וה-ON-דו-קוטביים ברשתית הבריאה, מודלים של בעלי חיים של מחלות עיניים ורשתיות של תורמים אנושיים.
Abstract
מדידות של תגובות אור עצביות ברשתית הן קריטיות לחקר הפיזיולוגיה של הרשתית הבריאה, לקביעת שינויים פתולוגיים במחלות רשתית ולבדיקת התערבויות טיפוליות. האלקטרורטינוגרמה ex vivo (ERG) מאפשרת כימות של תרומות מסוגי תאים בודדים ברשתית המבודדת על ידי הוספת חומרים פרמקולוגיים ספציפיים והערכה של שינויים פנימיים ברקמה ללא תלות בהשפעות מערכתיות. ניתן למדוד את תגובות אור הרשתית באמצעות מחזיק דגימת ex vivo ERG מיוחד ומערך הקלטה, ששונה מציוד קיים של מהדק טלאי או מערך מיקרואלקטרודה. במיוחד, המחקר של תאים דו-קוטביים על-קוטביים, אך גם של פוטורצפטורים, נפגע על ידי הירידה האיטית אך המתקדמת של תגובות האור ב-ex vivo ERG לאורך זמן. מהירות זלוף מוגברת והתאמת טמפרטורת ההפרשה משפרים את תפקוד הרשתית ex vivo וממקסמים את משרעת התגובה והיציבות. ה- ex vivo ERG מאפשר באופן ייחודי לחקור סוגי תאים עצביים ברשתית בודדים. בנוסף, שיפורים למקסום אמפליטודות התגובה והיציבות מאפשרים לחקור תגובות אור בדגימות רשתית מבעלי חיים גדולים, כמו גם מעיני תורמים אנושיים, מה שהופך את ה- ex vivo ERG לתוספת רבת ערך לרפרטואר הטכניקות המשמשות לחקר תפקוד הרשתית.
Introduction
אלקטרורטינוגרפיה מודדת את תפקוד הרשתית בתגובה לאור1. הוא חלק בלתי נפרד מלימוד הפיזיולוגיה והפתופיזיולוגיה של הרשתית, ומדידת ההצלחה של טיפולים במחלות רשתית. ה- in vivo ERG נמצא בשימוש נרחב להערכת תפקוד הרשתית באורגניזמים שלמים, אך יש לו מגבלות משמעותיות 2,3. בין אלה, הניתוח הכמותי של סוגי תאי רשתית בודדים ב- in vivo ERG נפגע, שכן הוא רושם את סכום השינויים הפוטנציאליים, ולכן תגובות כיסוי, מכל תאי הרשתית לגירויים קלים4. יתר על כן, הוא אינו מאפשר בקלות תוספת של תרופות לרשתית, הוא פגיע להשפעות סיסטמיות, ויש לו יחס אות לרעש נמוך יחסית. חסרונות אלה מתבטלים ב- ex vivo ERG החוקר את תפקוד הרשתית המבודדת 2,3,5,6. ה- ex vivo ERG מאפשר הקלטה של תגובות גדולות ויציבות מסוגי תאי רשתית ספציפיים על ידי הוספת מעכבים פרמקולוגיים והערכה קלה של חומרים טיפוליים, אשר ניתן להוסיף לסופרפוזט. יחד עם זאת, הוא מסיר השפעות של השפעות מערכתיות ומבטל רעש פיזיולוגי (למשל, פעימות לב או נשימה).
ב- ex vivo ERG, רשתיות או דגימות רשתית מבודדות ומותקנות בצד הפוטורצפטור למעלה על הכיפה של מחזיק הדגימה 3,5. מחזיק הדגימה מורכב, מחובר למערכת זלוף המספקת לרשתית מדיה מחוממת ומחומצנת, ומונח על במת מיקרוסקופ, אשר שונה כדי לספק גירויי אור מבוקרי מחשב. כדי לתעד את התגובות שמעוררות האור, מחזיק הדגימה מחובר למגבר, לדיגיטייזר ולמערכת הקלטה (איור 1). טכניקה זו מאפשרת בידוד של תגובות מפוטורצפטורים של מוטות וחרוטים, תאי ON-bipolar ו-Müller glia על ידי שינוי הפרמטרים של גירויי האור והוספת חומרים פרמקולוגיים.
ניתן להמיר מהדק תיקון קיים או מערך רב-אלקטרודות (MEA) להקלטת ex vivo ERG, בשילוב עם מתאם ex vivo ERG זמין מסחרית או מחזיק דגימה מותאם אישית במכונה של מחשב פוליקרבונט (CNC), כדי למדוד את תגובות האור ברשתיות ממודלים של בעלי חיים קטנים, כגון עכברים. שינוי זה מגדיל את הנגישות של ex vivo ERG תוך מזעור הצורך בציוד מיוחד. העיצוב של מחזיק הדגימה מפשט את טכניקת ההרכבה ומשלב אלקטרודות, ומבטל את הצורך במניפולציה של מיקרואלקטרודות בהשוואהלשיטות ex vivo ERG שדווחו בעבר 7. קצב הזלוף והטמפרטורה בתוך בעל הדגימה הם גורמים חשובים המשפיעים על תכונות התגובה של פוטורצפטורים ותאי ON-bipolar. על ידי התאמת תנאים אלה, ניתן להקליט את ה- ex vivo ERG באופן אמין מרשתית העכבר המבודדת לאורך פרקי זמן ממושכים. תנאי ניסוי ממוטבים מאפשרים הקלטות ex vivo ERG באגרופים ברשתית מרשתיות גדולות יותר, כולל עיניים גדולות של בעלי חיים ועיניים של תורמים אנושיים8.
Protocol
Representative Results
Discussion
הוא פותח במקור בשנת 1865 על ידי הולמגרן כדי למדוד את תגובות האור ברשתית מהרשתיתהדו-חיים 10, אך אילוצים טכניים מנעו בתחילה שימוש נרחב ב-ERG. אף על פי כן, מחקרים ראשוניים של Ragnar Granit ואחרים זיהו את המקורות התאיים של ה-ERG ומדדו תגובות של תאים פוטורצפטורים ותאי ON-bipolar exvivo 11,12…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקי המכון הלאומי לעיניים EY02665 ו- EY031706 והקרן הבינלאומית לחקר הרשתית לד”ר וינברג, מענק הליבה של המכונים הלאומיים לבריאות (EY014800), ומענק בלתי מוגבל ממחקר למניעת עיוורון, ניו יורק, ניו יורק, למחלקה לרפואת עיניים ומדעי הראייה, אוניברסיטת יוטה. ד”ר פרנס וינברג זכה גם בפרס מחקר למניעת עיוורון / פרס פיתוח הקריירה החופשית של ד”ר ה. ג’יימס וקרול, וד”ר סילקה בקר ממענק ARVO EyeFind. אנו מודים לד”ר אן הנקן ממכון המחקר סקריפס על כך שסיפקה את עין התורם המשמשת להקלטות המוצגות באיור 2E.
Materials
| 2 mm socket | WPI | 2026-10 | materials to prepare electrode |
| Ag/AgCl Electrode | World Precision Instruments | EP1 | materials to prepare electrode |
| Ames' medium | Sigma Aldrich | A1420 | perfusion media |
| barium chloride | Sigma Aldrich | B0750 | potassium channel blocker |
| DL-AP4 | Tocris | 0101 | broad spectrum glutamatergic antagonist |
| OcuScience Ex Vivo ERG Adapter | OcuScience | n/a | ex vivo ERG specimen holder |
| Threaded luer connector | McMaster-Carr | 51525K222 or 51525K223 | materials to prepare electrode |
References
- Perlman, I., Kolb, H., Fernandez, E., Nelson, R. . Webvision: The Organization of the Retina and Visual System. , (1995).
- Bonezzi, P. J., Tarchick, M. J., Renna, J. M. Ex vivo electroretinograms made easy: performing ERGs using 3D printed components. Journal of Physiology. 598 (21), 4821-4842 (2020).
- Vinberg, F., Kefalov, V. Simultaneous ex vivo functional testing of two retinas by in vivo electroretinogram system. Journal of Visualized Experiments. (99), e52855 (2015).
- Heckenlively, J. R., Arden, G. B. . Principles and Practice of Clinical Electrophysiology of Vision. , (2006).
- Vinberg, F., Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. Ex vivo ERG analysis of photoreceptors using an in vivo ERG system. Vision Research. 101, 108-117 (2014).
- Winkler, B. S. Calcium and the fast and slow components of P3 of the electroretinogram of the isolated rat retina. Vision Research. 14 (1), 9-15 (1974).
- Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. A dissection of the electroretinogram from the isolated rat retina with microelectrodes and drugs. Visual Neuroscience. 16 (4), 727-741 (1999).
- Abbas, F., et al. Revival of light signalling in the postmortem mouse and human retina. Nature. , (2022).
- Becker, S., Carroll, L. S., Vinberg, F. Diabetic photoreceptors: Mechanisms underlying changes in structure and function. Visual Neuroscience. 37, (2020).
- Kantola, L., Piccolino, M., Wade, N. J. The action of light on the retina: Translation and commentary of Holmgren (1866). Journal of the History of the Neurosciences. 28 (4), 399-415 (2019).
- Frank, R. N., Dowling, J. E. Rhodopsin photoproducts: effects on electroretinogram sensitivity in isolated perfused rat retina. Science. 161 (3840), 487-489 (1968).
- Hamasaki, D. I. The effect of sodium ion concentration on the electroretinogram of the isolated retina of the frog. Journal of Physiology. 167 (1), 156-168 (1963).
- Granit, R. The components of the retinal action potential in mammals and their relation to the discharge in the optic nerve. Journal of Physiology. 77 (3), 207-239 (1933).
- Donner, K., Hemila, S., Koskelainen, A. Temperature-dependence of rod photoresponses from the aspartate-treated retina of the frog (Rana temporaria). Acta Physiologica Scandinavica. 134 (4), 535-541 (1988).
- Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. Electrophysiological properties of a new isolated rat retina preparation. Vision Research. 39 (13), 2165-2177 (1999).
- Luke, M., et al. The isolated perfused bovine retina–a sensitive tool for pharmacological research on retinal function. Brain Research Protocols. 16 (1-3), 27-36 (2005).
- Becker, S., Carroll, L. S., Vinberg, F. Rod phototransduction and light signal transmission during type 2 diabetes. BMJ Open Diabetes Research and Care. 8 (1), 001571 (2020).
- Nymark, S., Haldin, C., Tenhu, H., Koskelainen, A. A new method for measuring free drug concentration: retinal tissue as a biosensor. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (6), 2583-2588 (2006).
- Winkler, B. S., Kapousta-Bruneau, N., Arnold, M. J., Green, D. G. Effects of inhibiting glutamine synthetase and blocking glutamate uptake on b-wave generation in the isolated rat retina. Visual Neuroscience. 16 (2), 345-353 (1999).
