Summary

Optimierung des Aufbaus und der Bedingungen für das Ex-vivo-Elektroretinogramm zur Untersuchung der Netzhautfunktion bei kleinen und großen Augen

Published: June 27, 2022
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Summary

Die Modifikation bestehender Multielektroden-Array- oder Patch-Clamp-Geräte macht das Ex-vivo-Elektroretinogramm breiter zugänglich. Verbesserte Methoden zur Aufzeichnung und Aufrechterhaltung von Ex-vivo-Lichtantworten erleichtern die Untersuchung der Photorezeptor- und ON-bipolaren Zellfunktion in der gesunden Netzhaut, Tiermodellen von Augenkrankheiten und menschlichen Spendernetzhaut.

Abstract

Messungen der retinalen neuronalen Lichtreaktionen sind entscheidend für die Untersuchung der Physiologie der gesunden Netzhaut, die Bestimmung pathologischer Veränderungen bei Netzhauterkrankungen und das Testen therapeutischer Interventionen. Das ex vivo Elektroretinogramm (ERG) ermöglicht die Quantifizierung von Beiträgen einzelner Zelltypen in der isolierten Netzhaut durch Zugabe spezifischer pharmakologischer Wirkstoffe und die Bewertung gewebeintrinsischer Veränderungen unabhängig von systemischen Einflüssen. Retinale Lichtantworten können mit einem speziellen Ex-vivo-ERG-Probenhalter und Aufnahmeaufbau gemessen werden, der von bestehenden Patchklemmen oder Mikroelektroden-Array-Geräten modifiziert wurde. Insbesondere die Untersuchung von ON-bipolaren Zellen, aber auch von Photorezeptoren, wurde durch den langsamen, aber fortschreitenden Rückgang der Lichtantworten im ex vivo ERG im Laufe der Zeit behindert. Die erhöhte Perfusionsgeschwindigkeit und die Einstellung der Perfusattemperatur verbessern die Ex-vivo-Netzhautfunktion und maximieren die Reaktionsamplitude und -stabilität. Das ex vivo ERG ermöglicht auf einzigartige Weise die Untersuchung einzelner retinaler neuronaler Zelltypen. Darüber hinaus ermöglichen Verbesserungen zur Maximierung der Reaktionsamplituden und -stabilität die Untersuchung von Lichtreaktionen in Netzhautproben von großen Tieren sowie menschlichen Spenderaugen, was das ex vivo ERG zu einer wertvollen Ergänzung des Repertoires an Techniken macht, die zur Untersuchung der Netzhautfunktion verwendet werden.

Introduction

Die Elektroretinographie misst die Netzhautfunktion als Reaktion auf Licht1. Es ist integraler Bestandteil des Studiums der Netzhautphysiologie und Pathophysiologie und der Messung des Erfolgs von Therapien für Netzhauterkrankungen. Das In-vivo-ERG wird häufig zur Beurteilung der Netzhautfunktion in intakten Organismen verwendet, weist jedoch signifikante Einschränkungenauf 2,3. Unter diesen wird die quantitative Analyse einzelner retinaler Zelltypen im in vivo ERG erschwert, da es die Summe der möglichen Veränderungen und damit überlagerten Reaktionen von allen Netzhautzellen zu Lichtreizen aufzeichnet4. Darüber hinaus erlaubt es nicht ohne weiteres die Zugabe von Medikamenten zur Netzhaut, ist anfällig für systemische Einflüsse und hat ein relativ niedriges Signal-Rausch-Verhältnis. Diese Nachteile werden in der ex vivo ERG eliminiert, die die Funktion der isolierten Netzhaut 2,3,5,6 untersucht. Das ex vivo ERG ermöglicht die Aufzeichnung großer und stabiler Reaktionen von spezifischen retinalen Zelltypen durch Zugabe pharmakologischer Inhibitoren und einfache Bewertung von Therapeutika, die dem Superfusat zugesetzt werden können. Gleichzeitig beseitigt es Einflüsse systemischer Effekte und eliminiert physiologische Geräusche (z.B. Herzschlag oder Atmung).

Bei der ex vivo ERG werden Netzhäute oder Netzhautproben isoliert und photorezeptorseitig nach oben auf der Kuppel des Probenhalters 3,5 montiert. Der Probenhalter wird zusammengebaut, mit einem Perfusionssystem verbunden, das die Netzhaut mit erhitzten, sauerstoffhaltigen Medien versorgt, und auf den Tisch eines Mikroskops gestellt, das modifiziert wurde, um computergesteuerte Lichtreize zu liefern. Um die durch Licht hervorgerufenen Reaktionen aufzuzeichnen, wird der Probenhalter an einen Verstärker, einen Digitizer und ein Aufzeichnungssystem angeschlossen (Abbildung 1). Diese Technik ermöglicht die Isolierung von Reaktionen von Stäbchen- und Zapfen-Photorezeptoren, ON-Bipolarzellen und Müller-Glia, indem die Parameter der Lichtstimuli verändert und pharmakologische Wirkstoffe hinzugefügt werden.

Eine vorhandene Patchklemme oder ein Multi-Elektroden-Array (MEA) kann in die Aufzeichnung von Ex-vivo-ERG umgewandelt werden, entweder in Verbindung mit einem handelsüblichen Ex-vivo-ERG-Adapter oder einem benutzerdefinierten CNC-bearbeiteten Probenhalter (Computer Numerical Control) aus Polycarbonat, um Lichtreaktionen in Netzhaut von Kleintiermodellen wie Mäusen zu messen. Diese Modifikation erhöht die Zugänglichkeit von ex vivo ERG und minimiert gleichzeitig den Bedarf an Spezialgeräten. Das Design des Probenhalters vereinfacht die Montagetechnik und integriert Elektroden, wodurch die Notwendigkeit einer Manipulation von Mikroelektroden im Vergleich zu zuvor berichteten transretinalen Ex-vivo-ERG-Methoden entfällt7. Die Perfusionsrate und die Temperatur im Probenhalter sind wichtige Faktoren, die die Reaktionseigenschaften von Photorezeptoren und ON-Bipolarzellen beeinflussen. Durch die Anpassung dieser Bedingungen kann das ex vivo ERG zuverlässig von der isolierten Netzhaut der Maus über längere Zeiträume aufgezeichnet werden. Optimierte experimentelle Bedingungen ermöglichen ex vivo ERG-Aufnahmen in Netzhautstempeln von größeren Netzhäuten, einschließlich großer Tieraugen und menschlicher Spenderaugen8.

Protocol

Alle Experimente mit Mäusen wurden in Übereinstimmung mit dem NIH-Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt und vom Institutional Animal Studies Committee der University of Utah genehmigt. Schweineaugen zur Demonstration dieses Videos wurden postmortal aus dem Schlachthof (Sustainable Swine Resources, Johnsonville) erhalten. Die Augen wurden von menschlichen Spendern nach Hirn- oder Herztod mit Zustimmung zur Forschungsnutzung durch die Utah Lions Eye Bank, die San Diego Eye Bank oder Lifes…

Representative Results

Ex vivo ERG ermöglicht die Aufzeichnung reproduzierbarer und stabiler Photorezeptor- und ON-bipolarer Zelllichtantworten, beispielsweise von der Netzhaut der Maus (Abbildung 2A-C). Die Aufzeichnung von Photorezeptorantworten menschlicher Spendernetzhaut ist mit bis zu 5 h postmortaler Verzögerung der Enukleation (Abbildung 2D) und von ON-bipolaren Zellantworten mit einer Enukleationsverzögerung von <20 min (<strong c…

Discussion

Ursprünglich 1865 von Holmgren entwickelt, um die retinalen Lichtantworten der Amphibiennetzhaut10 zu messen, verhinderten technische Einschränkungen zunächst eine breite Anwendung. Dennoch identifizierten wegweisende Studien von Ragnar Granit und anderen die zellulären Ursprünge des ERG und maßen Photorezeptor- und ON-bipolare Zellantworten ex vivo11,12,13. Seitdem haben verfeinerte Method…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch die Zuschüsse des National Eye Institute EY02665 und EY031706 und der International Retinal Research Foundation an Dr. Vinberg, National Institutes of Health Core Grant (EY014800), und einen uneingeschränkten Zuschuss von Research to Prevent Blindness, New York, NY, an das Department of Ophthalmology & Visual Sciences, University of Utah, unterstützt. Dr. Frans Vinberg erhielt auch einen Research to Prevent Blindness/Dr. H. James and Carole Free Career Development Award und Dr. Silke Becker ein ARVO EyeFind-Stipendium. Wir danken Dr. Anne Hanneken vom Scripps Research Institute für die Bereitstellung des Spenderauges, das für die in Abbildung 2E gezeigten Aufnahmen verwendet wurde.

Materials

2 mm socket WPI 2026-10 materials to prepare electrode
Ag/AgCl Electrode World Precision Instruments EP1 materials to prepare electrode
Ames' medium Sigma Aldrich A1420 perfusion media
barium chloride Sigma Aldrich B0750 potassium channel blocker
DL-AP4 Tocris 0101 broad spectrum glutamatergic antagonist
OcuScience Ex Vivo ERG Adapter OcuScience n/a ex vivo ERG specimen holder
Threaded luer connector McMaster-Carr 51525K222 or 51525K223 materials to prepare electrode

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Cite This Article
Abbas, F., Vinberg, F., Becker, S. Optimizing the Setup and Conditions for Ex Vivo Electroretinogram to Study Retina Function in Small and Large Eyes. J. Vis. Exp. (184), e62763, doi:10.3791/62763 (2022).

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