Aktif Caenorhabditis elegans'ın in vitro transkripsiyon için Nükleer Ekstrakt ve Rekonsitasyonu İzolasyonu

Küçük, serbest yaşayan nematod Caenorhabditis elegans , çok çeşitli biyolojik soruları ele almak için basit ama güçlü bir model organizmadır. 1963’te piyasaya sürülmesinden bu yana, nematodlar nörobiyoloji, metabolizma, yaşlanma, gelişim, bağışıklık ve ^genetik1 sorularını yanıtlamak için paha biçilmez olmuştur1. Hayvanın ideal bir model organizma olmasını sağlayan birçok özelliğinden bazıları arasında kısa nesil süre, RNA parazitinin etkinliği, şeffaf vücut ve hem hücresel soyunun hem de sinir sisteminin tamamlanmış haritaları bulunur.

Nematodun bilime katkıları çok büyük olsa da, ökaryotik transkripsiyon sistemini aydınlatmak için yetenmemiştir, bu mekanizmalar hakkındaki anlayışımızın çoğu maya, meyve sineği ve memeli hücre kültüründen nükleer ekstrakt kullanan çalışmalardan ^gelmektedir2. Araştırmacıları fonksiyonel nükleer özüt çıkarmaktan vazgeçiren en büyük engel nematodun sert dış manikürüdür. Bu dış iskelet çapraz bağlı kollajenler, cuticlins, glikoproteinler ve lipitlerden oluşur ve C. eleganları larva aşamasından yetişkinliğe kadar kimyasal veya mekanik kuvvetlerle protein ekstraksiyona dayanıklı hale ^getirir3. C. elegans nükleer ekstresi kullanan bir in vitro transkripsiyon sistemi bir zamanlar geliştirilmiştir, ancak sistemin sınırlı kapsamı nedeniyle yaygın olarak benimsenmemiştir ve özü hazırlamak için Dounce homojenizatörün kullanılması protein kararsızlığına yol ^açabilir4,5.

C. eleganları kırmak için bir Dounce homojenizatör kullanan nükleer ekstrakt izolasyonu için önceki protokolün aksine, bu protokol bir Balch homojenizatör kullanır. Balch homojenizatör iki ana bileşenden oluşur: bir tungsten karbür topu ve bir uçtan diğerine sıkılmış bir kanala sahip paslanmaz çelik bir blok. Balch homojenizatörü tungsten karbür topu ile yüklenir ve taşlama odasını kapatmak için her iki tarafa da kapatılmıştır. Şırınnalar, taşlama odasına giden iki dikey bağlantı noktasına yüklenebilir. Malzeme bir şırınnadan diğerine taşlama odasından geçirilirken, şırınnalardan gelen basınç malzemeyi top ile odanın duvarı arasındaki dar bir boşluktan geçirir. Bu yavaş ve sabit basınç, dar boşluktan kolayca geçebilen tutarlı bir boyuta ulaşana kadar malzemeyi kırar. C. elegans’ı sürekli ama yumuşak bir basınçla dar boşluktan zorlamak, hayvanları açar ve içeriklerini çevredeki tampona bırakır. Top boyutlarının değiştirilmesi boşluğu daha da sıkılaştırarak yeni salınan hücreleri kırar ve çekirdeği tampona boşaltır. Santrifüjlemenin birden fazla örneği çekirdekleri hücre kalıntılarının geri kalanından ayırarak temiz bir nükleer özün toplanmasına izin verir. Balch homojenizatör, Dounce homojenizatöre göre birkaç nedenden dolayı tercih edilir: sistem çok sayıda hayvanı idare edebilir ve tek bir denemede yüksek miktarda aktif protein çıkarmayı mümkün hale getirir; topların ve çelik bloğun hassas işlenmesi, birden fazla numune arasında tutarlı taşlama sağlar; ağır çelik blok bir ısı emici görevi görür, ısıyı taşlama odasından düzgün bir şekilde çeker ve denatüre etmeyi önler.

İzolasyondan sonra, nükleer ekstrakt transkripsiyon aktivitesi herhangi bir biyokimyasal deneyde kullanılmadan önce doğrulanmalıdır. Geleneksel olarak, transkripsiyon aktivitesi, yeni sentezlenen RNA’yı izlemek ve görselleştirmek için radyolabelli nükleotidler kullanılarak ölçüldü. Bununla birlikte, radyoaktif etiketleme, kullanım ve bertaraf sırasında önlem gerektirdiği için külfetli ^olabilir6. Günümüzde teknolojik gelişmeler, araştırmacıların nicel gerçek zamanlı PCR (qRT-PCR)⁷ gibi teknikleri kullanarak küçük RNA miktarlarını bile ölçmek için çok daha az zararlı veya zahmetli yöntemler kullanmalarına izin verir. Burada protokol, aktif nükleer özü larva evresi 4 (L4) C. eleganlardan izole etmek ve transkripsiyon aktivitesini bir in vitro sistemde görselleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır.