Isolatie van actief caenorhabditis elegans nucleair extract en reconstitutie voor in vitro transcriptie

De kleine, vrijlevende nematode Caenorhabditis elegans is een eenvoudig maar krachtig modelorganisme voor het aanpakken van een breed scala aan biologische vragen. Sinds de introductie in 1963 zijn de nematoden van onschatbare waarde geweest voor het beantwoorden van vragen in neurobiologie, metabolisme, veroudering, ontwikkeling, immuniteit en ^genetica1. Enkele van de vele kenmerken van het dier die het een ideaal modelorganisme maken, zijn korte generatietijd, de effectiviteit van RNA-interferentie, transparant lichaam en de voltooide kaarten van zowel de cellulaire afstamming als het zenuwstelsel.

Hoewel de bijdragen van de nematode aan de wetenschap enorm zijn, zijn ze onderbenut om het eukaryote transcriptiesysteem op te helderen, waarbij het grootste deel van ons begrip over deze mechanismen afkomstig is van studies met nucleair extract uit gist, fruitvlieg en zoogdiercelcultuur2. De grootste hindernis die onderzoekers ervan weerhoudt om functioneel nucleair extract te extraheren, is de taaie buitenste cuticula van de nematode. Dit exoskelet bestaat uit verknoopte collageen, cuticlinen, glycoproteïnen en lipiden, waardoor C. elegans van larvaal stadium tot volwassenheid resistent zijn tegen eiwitextractie via chemische of mechanische ^krachten3. Een in vitro transcriptiesysteem met C. elegans nucleair extract werd ooit ontwikkeld, maar niet op grote schaal toegepast vanwege de beperkte reikwijdte van het systeem, en het gebruik van Dounce-homogenisator voor het bereiden van het extract zou kunnen leiden tot ^{eiwitinstabiliteit4,5}.

In tegenstelling tot het vorige protocol voor nucleaire extractisolatie, waarbij een Dounce-homogenisator werd gebruikt om C. elegans te breken, gebruikt dit protocol een Balch-homogenisator. De Balch homogenisator bestaat uit twee hoofdcomponenten: een wolfraamcarbide kogel en een roestvrijstalen blok met een kanaal dat van het ene uiteinde naar het andere wordt geboord. De Balch-homogenisator wordt geladen met de wolfraamcarbidekogel en aan weerszijden afgedekt om de maalkamer af te dichten. Spuiten kunnen worden geladen op de twee verticale poorten die naar de slijpkamer leiden. Terwijl het materiaal door de slijpkamer van de ene spuit naar de andere wordt geleid, dwingt de druk van de spuiten het materiaal door een smalle opening tussen de bal en de wand van de kamer. Deze langzame en constante druk breekt het materiaal totdat het een consistente grootte bereikt die gemakkelijk door de smalle opening kan gaan. Door C. elegans via een constante maar zachte druk door de smalle opening te dwingen, breken de dieren open, waardoor hun inhoud in de omringende buffer vrijkomt. Het wisselen van kogelgroottes maakt de opening verder strakker, waardoor de nieuw vrijgegeven cellen worden gebroken en de kernen in de buffer worden bevrijd. Meerdere gevallen van centrifugatie scheiden de kernen van de rest van het celpuin, waardoor een schoon nucleair extract kan worden verzameld. De Balch-homogenisator heeft om verschillende redenen de voorkeur boven de Dounce-homogenisator: het systeem kan een groot aantal dieren aan, waardoor het mogelijk is om in één keer een grote hoeveelheid actieve eiwitten te extraheren; de nauwkeurige bewerking van de kogels en het stalen blok maakt consistent slijpen tussen meerdere monsters mogelijk; het zware stalen blok fungeert als een koellichaam en trekt gelijkmatig warmte weg van de slijpkamer, waardoor denaturering wordt voorkomen.

Na isolatie moet de transcriptionele activiteit van het nucleaire extract worden geverifieerd voordat het in biochemische experimenten wordt gebruikt. Traditioneel werd transcriptieactiviteit gemeten met behulp van radioactief gelabelde nucleotiden om het nieuw gesynthetiseerde RNA te volgen en te visualiseren. Radioactieve etikettering kan echter belastend zijn omdat het voorzorgsmaatregelen vereist tijdens gebruik en ^{verwijdering6}. Technologische vooruitgang stelt onderzoekers tegenwoordig in staat om veel minder schadelijke of lastige methoden te gebruiken om zelfs kleine RNA-hoeveelheden te meten met behulp van technieken zoals kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR)⁷. Hier beschrijft het protocol een methode om actief nucleair extract te isoleren uit larvale stadium 4 (L4) C. elegans en transcriptieactiviteit in een in vitro systeem te visualiseren.