Выделение активного caenorhabditis elegans Nuclear Extract и восстановление для транскрипции in vitro

Маленькая, свободно живущая нематода Caenorhabditis elegans является простым, но мощным модельным организмом для решения широкого круга биологических вопросов. С момента своего появления в 1963 году нематоды были бесценны для ответа на вопросы в нейробиологии, метаболизме, старении, развитии, иммунитете и ^{генетике1}. Некоторые из многих характеристик животного, которые делают его идеальным модельным организмом, включают короткое время генерации, эффективность РНК-интерференции, прозрачное тело и завершенные карты как его клеточной линии, так и нервной системы.

Хотя вклад нематод в науку огромен, они были недостаточно использованы для выяснения системы транскрипции эукариот, причем большая часть нашего понимания этих механизмов исходит из исследований с использованием ядерного экстракта дрожжей, плодовой мухи и культуры клеток ^{млекопитающих2}. Самым большим препятствием, которое отговаривает исследователей от извлечения функционального ядерного экстракта, является жесткая внешняя кутикула нематоды. Этот экзоскелет содержит сшитые коллагены, кутиклины, гликопротеины и липиды, что делает C. elegans от личиночной стадии до взрослой жизни устойчивыми к экстракции белка с помощью химических или механических ^сил3. Система транскрипции in vitro с использованием ядерного экстракта C. elegans была когда-то разработана, но не получила широкого распространения из-за ограниченного объема системы, и использование гомогенизатора Dounce для приготовления экстракта может привести к нестабильности ^{белка4,5}.

В отличие от предыдущего протокола для изоляции ядерного экстракта, в котором использовался гомогенизатор Dounce для разрушения C. elegans, этот протокол использует гомогенизатор Balch. Гомогенизатор Balch состоит из двух основных компонентов: шарика из карбида вольфрама и блока из нержавеющей стали с каналом, просверленным от одного конца до другого. Гомогенизатор Balch загружается шариком из карбида вольфрама и закрывается с обеих сторон для герметизации шлифовальной камеры. Шприцы могут быть загружены на два вертикальных порта, ведущих в шлифовальную камеру. Когда материал передается от одного шприца к другому через шлифовальную камеру, давление от шприцев заставляет материал проходить через узкий зазор между шаром и стенкой камеры. Это медленное и постоянное давление разрушает материал, пока он не достигнет постоянного размера, который способен легко проходить через узкий зазор. Заставляя C. elegans проходить через узкую щель с помощью постоянного, но мягкого давления, животные открываются, выпуская их содержимое в окружающий буфер. Переключение размеров шарика еще больше затягивает зазор, разрывая вновь высвобождаемые клетки и освобождая ядра в буфер. Многочисленные случаи центрифугирования отделяют ядра от остального клеточного мусора, что позволяет собирать чистый ядерный экстракт. Гомогенизатор Balch предпочтительнее гомогенизатора Dounce по нескольким причинам: система может обрабатывать большое количество животных, что позволяет извлекать большое количество активных белков за одну попытку; точная обработка шариков и стального блока обеспечивает последовательное шлифование между несколькими образцами; тяжелый стальной блок действует как радиатор, равномерно отводя тепло от шлифовальной камеры, предотвращая денатурацию.

После выделения транскрипционная активность ядерного экстракта должна быть проверена перед использованием в любых биохимических экспериментах. Традиционно активность транскрипции измеряли с использованием меченых радиоактивными нуклеотидами для отслеживания и визуализации вновь синтезированной РНК. Однако радиоактивная маркировка может быть обременительной, поскольку она требует предосторожности во время использования и ^{удаления6}. Технологические достижения позволяют исследователям сегодня использовать гораздо менее вредные или неприятные методы для измерения даже небольших количеств РНК с использованием таких методов, как количественная ПЦР в реальном времени (qRT-PCR)⁷. Здесь протокол описывает метод выделения активного ядерного экстракта из личиночной стадии 4 (L4) C. elegans и визуализации транскрипционной активности в системе in vitro.