Isolamento da Caenorhabditis Ativa elegans Extrato Nuclear e Reconstituição para Transcrição In Vitro

O pequeno nematode caenorhabditis elegans é um organismo modelo simples, mas poderoso, para abordar uma ampla gama de questões biológicas. Desde sua introdução em 1963, os nematoides têm sido inestimáveis para responder perguntas em neurobiologia, metabolismo, envelhecimento, desenvolvimento, imunidade e ^genética1. Algumas das muitas características do animal que o tornam um organismo modelo ideal incluem o curto tempo de geração, a eficácia da interferência do RNA, o corpo transparente e os mapas completos de sua linhagem celular e sistema nervoso.

Embora as contribuições do nematode para a ciência sejam vastas, elas têm sido subutilizados para elucidar o sistema de transcrição eucariótica, com a maioria de nosso entendimento sobre esses mecanismos provenientes de estudos que usam extrato nuclear de levedura, mosca-das-frutas e cultura celular de ^mamíferos2. O maior obstáculo que dissuade os pesquisadores de extrair extrato nuclear funcional é a dura cutícula externa do nematode. Este exoesqueleto compreende collagens transversais, cuticlins, glicoproteínas e lipídios, tornando C. elegans do estágio larval à idade adulta resistente à extração de proteínas através de forças químicas ou ^mecânicas3. Um sistema de transcrição in vitro usando extrato nuclear C. elegans já foi desenvolvido, mas não amplamente adotado devido ao escopo limitado do sistema, e o uso de homogeneizador Dounce para a preparação do extrato poderia levar à instabilidade proteica4,5.

Ao contrário do protocolo anterior para isolamento de extrato nuclear que utilizava um homogeneizador do Dounce para quebrar C. elegans, este protocolo usa um homogeneizador Balch. O homogeneizador Balch consiste em dois componentes principais: uma bola de carboneto de tungstênio e um bloco de aço inoxidável com um canal entediado de uma extremidade para outra. O homogeneizador Balch é carregado com a bola de carboneto de tungstênio e tampado em ambos os lados para selar a câmara de moagem. As seringas podem ser carregadas nas duas portas verticais que levam à câmara de moagem. À medida que o material é passado de uma seringa para a outra através da câmara de moagem, a pressão das seringas força o material através de uma estreita distância entre a bola e a parede da câmara. Esta pressão lenta e constante quebra o material até atingir um tamanho consistente que é capaz de passar pela estreita lacuna facilmente. Forçando C. elegans através da estreita lacuna através de uma pressão constante, mas suave, quebra os animais abertos, liberando seu conteúdo no buffer circundante. A troca de tamanhos de esfera aperta ainda mais a lacuna, quebrando as células recém-liberadas e libera os núcleos para o buffer. Vários casos de centrifugação separam os núcleos do resto dos detritos celulares, permitindo a coleta de um extrato nuclear limpo. O homogeneizador Balch é preferido em vez do homogeneizador do Dounce por várias razões: o sistema pode lidar com um grande número de animais, possibilitando extrair uma alta quantidade de proteínas ativas em uma única tentativa; a usinagem precisa das bolas e do bloco de aço permite uma moagem consistente entre múltiplas amostras; o bloco de aço pesado age como um dissipador de calor, afastando uniformemente o calor da câmara de moagem, impedindo a desnaturação.

Após o isolamento, a atividade transcricional do extrato nuclear deve ser verificada antes de ser usada em qualquer experimento bioquímico. Tradicionalmente, a atividade de transcrição era medida usando nucleotídeos radiolabelados para rastrear e visualizar o RNA recém-sintetizado. No entanto, a rotulagem radioativa pode ser pesada, pois requer precaução durante o uso e ^descarte6. Os avanços tecnológicos permitem que os pesquisadores de hoje usem métodos muito menos prejudiciais ou problemáticos para medir até mesmo pequenas quantidades de RNA usando técnicas como PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR)⁷. Aqui, o protocolo descreve um método para isolar o extrato nuclear ativo do estágio larval 4 (L4) C. elegans e visualizar a atividade de transcrição em um sistema in vitro.