能動 カエノハブディティス・エレガンス 核抽出物の分離と インビトロ 転写のための再構成

小さくて自由に生きている線虫カ エノハブディティスエレガンス は、幅広い生物学的問題に取り組むシンプルでありながら強力なモデル生物です。1963年の導入以来、線虫は神経生物学、代謝、老化、発達、免疫、遺伝学¹の質問に答えるのに非常に貴重なされています。理想的なモデル生物となる動物の多くの特徴のいくつかは、短い生成時間、RNA干渉の有効性、透明な身体、およびその細胞系統と神経系の両方の完成した地図を含む。

線虫の科学への貢献は膨大ですが、真核転写システムを解明するために十分に利用されておらず、酵母、フルーツフライ、哺乳類細胞培養からの核抽出物を用いた研究から得られたメカニズムに関する理解のほとんどが^{得ています。}研究者が機能性核抽出物を抽出するのを妨げる最大のハードルは、線虫のタフな外キューティクルです。この外骨格は、架橋されたコラーゲン、キューティクリン、糖タンパク質、および脂質を含み、幼虫期から化学的または^{機械的な力}を介したタンパク質抽出に耐性を持つC.エレガンスを作る3。C.エレガンス核抽出物を用いたインビトロ転写システムは、かつて開発されたが、システムの限られた範囲のために広く採用されておらず、抽出物を調製するためのDounceホモジナイザーの使用は、タンパク質不安定性につながる可能性がある^4,5。

C.エレガンスを破るためにDounceホモジナイザーを利用した核抽出分離のための以前のプロトコルとは異なり、このプロトコルはバルチホモジナイザーを使用しています。Balchホモジナイザーは2つの主要なコンポーネントから成っている:タングステンカーバイドボールと一方の端から別の端に退屈チャネルを持つステンレス鋼のブロック。バルチホモジナイザーはタングステンカーバイドボールを積み込み、粉砕室を密封するために両側にキャップされます。シリンジは、粉砕室につながる2つの垂直ポートに積み込むことができます。材料が一方の注射器からもう一方のシリンジに粉砕室を通って渡されると、注射器からの圧力は、ボールとチャンバーの壁との間の狭い隙間を通って材料を強制します。この遅く、一定の圧力は、それが容易に狭いギャップを通過することができる一貫したサイズに達するまで材料を壊す。一定でありながら穏やかな圧力を介して狭い隙間を通ってC.エレガンスを強制すると、動物が開き、周囲の緩衝液に内容物が放出されます。ボールサイズの切り替えにより、ギャップがさらに引き締まり、新たに放出された細胞が破壊され、核がバッファに解放されます。遠心分離の複数のインスタンスは、細胞の破片の残りの部分から核を分離し、きれいな核抽出物の収集を可能にする。バルチホモジナイザーは、いくつかの理由からDounceホモジナイザーよりも好ましい:システムは、一度の試みで活性タンパク質の大量を抽出することが可能になり、動物の多数を処理することができます。ボールとスチールブロックの精密な加工は、複数のサンプル間で一貫した研削を可能にします。重い鋼ブロックはヒートシンクとして機能し、均一に研削室から熱を引き出し、変性を防ぎます。

単離後、核抽出物の転写活性は、生化学的実験で使用される前に検証する必要があります。従来、転写活性は、新たに合成されたRNAを追跡および可視化するために、放射性標識ヌクレオチドを用いて測定した。しかし、放射性標識は使用時および処分時に注意を要するため、負担が大きくなる可能性があります^。技術の進歩により、研究者は定量的リアルタイムPCR(qRT-PCR)7などの技術を用いて、より有害でない、または面倒な方法を使用して、少量のRNA量を測定^{することができます}。ここで、プロトコルは、幼虫期4(L4) C.エレガンス から活性核抽出物を単離し、 インビトロ 系における転写活性を可視化する方法を説明する。