Aislamiento del extracto nuclear activo de Caenorhabditis elegans y reconstitución para la transcripción in vitro

El pequeño nematodo de vida libre Caenorhabditis elegans es un organismo modelo simple pero poderoso para abordar una amplia gama de preguntas biológicas. Desde su introducción en 1963, los nematodos han sido invaluables para responder preguntas en neurobiología, metabolismo, envejecimiento, desarrollo, inmunidad y ^genética1. Algunas de las muchas características del animal que lo convierten en un organismo modelo ideal incluyen el corto tiempo de generación, la efectividad de la interferencia de ARN, el cuerpo transparente y los mapas completos tanto de su linaje celular como de su sistema nervioso.

Si bien las contribuciones del nematodo a la ciencia son vastas, se han subutilizado para dilucidar el sistema de transcripción eucariota, y la mayor parte de nuestra comprensión sobre estos mecanismos proviene de estudios que utilizan extracto nuclear de levadura, mosca de la fruta y cultivo de células de ^mamíferos2. El mayor obstáculo que disuade a los investigadores de extraer extracto nuclear funcional es la dura cutícula externa del nematodo. Este exoesqueleto comprende colágenos, cuticlinas, glicoproteínas y lípidos reticulados, lo que hace que C. elegans desde la etapa larvaria hasta la edad adulta sea resistente a la extracción de proteínas a través de fuerzas químicas o mecánicas3. Una vez se desarrolló un sistema de transcripción in vitro que utiliza extracto nuclear de C. elegans, pero no se adoptó ampliamente debido al alcance limitado del sistema, y el uso del homogeneizador Dounce para preparar el extracto podría conducir a la inestabilidad de la ^proteína4,5.

A diferencia del protocolo anterior para el aislamiento de extractos nucleares que utilizaba un homogeneizador Dounce para romper C. elegans, este protocolo utiliza un homogeneizador Balch. El homogeneizador Balch consta de dos componentes principales: una bola de carburo de tungsteno y un bloque de acero inoxidable con un canal perforado de un extremo a otro. El homogeneizador Balch se carga con la bola de carburo de tungsteno y se tapa a cada lado para sellar la cámara de molienda. Las jeringas se pueden cargar en los dos puertos verticales que conducen a la cámara de molienda. A medida que el material pasa de una jeringa a la otra a través de la cámara de molienda, la presión de las jeringas fuerza el material a través de un espacio estrecho entre la bola y la pared de la cámara. Esta presión lenta y constante rompe el material hasta que alcanza un tamaño consistente que es capaz de pasar a través del espacio estrecho fácilmente. Forzar a C. elegans a través de la estrecha brecha a través de una presión constante pero suave rompe la apertura de los animales, liberando su contenido en el amortiguador circundante. Cambiar el tamaño de las bolas aprieta aún más la brecha, rompiendo las células recién liberadas y libera los núcleos en el tampón. Múltiples instancias de centrifugación separan los núcleos del resto de los desechos celulares, lo que permite la recolección de un extracto nuclear limpio. El homogeneizador Balch es preferido sobre el homogeneizador Dounce por varias razones: el sistema puede manejar una gran cantidad de animales, lo que permite extraer una gran cantidad de proteínas activas en un solo intento; el mecanizado preciso de las bolas y el bloque de acero permite un rectificado consistente entre múltiples muestras; el bloque de acero pesado actúa como un disipador de calor, extrayendo uniformemente el calor de la cámara de molienda, evitando la desnaturalización.

Después del aislamiento, la actividad transcripcional del extracto nuclear debe verificarse antes de ser utilizada en cualquier experimento bioquímico. Tradicionalmente, la actividad de transcripción se medía utilizando nucleótidos radiomarcados para rastrear y visualizar el ARN recién sintetizado. Sin embargo, el etiquetado radiactivo puede ser oneroso, ya que requiere precaución durante el uso y la ^{eliminación6}. Los avances tecnológicos permiten a los investigadores de hoy utilizar métodos mucho menos dañinos o problemáticos para medir incluso pequeñas cantidades de ARN utilizando técnicas como la PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR)⁷. Aquí, el protocolo describe un método para aislar el extracto nuclear activo de la etapa larvaria 4 (L4) C. elegans y visualizar la actividad de transcripción en un sistema in vitro.