Estudio de transferencia de energía de fluorescencia de molécula única de síntesis de proteínas ribosómicas

El ribosoma es un complejo de ribonucleoproteína grande de ø 20 nm de una subunidad grande (50S) y una pequeña (30S). Ensambla péptidos largos a lo largo de la plantilla de ARNm de manera procesiva y cooperativa. El ribosoma 30S se une al fMet-tRNA^fMet y al ARNm para iniciar la síntesis de proteínas, y el 50S luego se une para formar el complejo de iniciación 70S. Los ARNt llevan aminoácidos al ribosoma en el sitio A (sitio de unión aminoacil-ARNt), mientras que la cadena peptidilada alargada se mantiene en el sitio P (sitio de unión peptidil-ARNt). En el complejo de pre-translocación, la cadena de peptidil se transfiere al ARNt en el sitio A con un aminoácido añadido. Mientras tanto, el ARNt del sitio P está desacilado. Luego, los ARNt A-, P- se mueven a los sitios P-, E- para formar el complejo post-translocación, en el que el sitio E representa el sitio de salida del ARNt. En este estado, el PEPTIDIL-ARNt se mueve de vuelta al sitio P. El ciclo de elongación continúa entre las pre y postconformaciones mientras que el ribosoma se transloca en el ARNm, un codón a la vez¹. El ribosoma es altamente coordinativo de diferentes sitios funcionales para hacer que este proceso sea eficiente y preciso, como el trinquete intersubunidad^2,las fluctuaciones de hibridación de ARNt^3,las activaciones de GTPasa^4,la apertura-cierre del tallo L1^5,etc. En consecuencia, los ribosomas se desespaspas rápidamente porque cada molécula se mueve a su propio ritmo. Los métodos convencionales solo pueden deducir parámetros medios aparentes, pero las especies poco pobladas o de corta duración se enmascararán en el efecto medio⁶. El método de molécula única puede romper esta limitación detectando cada ribosoma individualmente, luego identificar diferentes especies a través de la reconstrucción estadística⁷. Se han implementado diferentes sitios de etiquetado para sondear la dinámica de los ribosomas, como las interacciones entre tRNA-ARNt^8,EF-G-L11^9,L1-ARNt^10,etc. Además, al etiquetar las subunidades grandes y pequeñas, respectivamente, se observa la cinética de trinquete entre subunidades y la coordinación con los factores^11,12. Mientras tanto, el método smFRET tiene amplias aplicaciones en otros procesos biológicos centrales, y están surgiendo métodos FRET multicolor¹³.

Anteriormente se desarrolló un nuevo par de RIBOSOMAS FRET^14,15. La proteína ribosómica recombinante L27 ha sido expresada, purificada y etiquetada, e incorporada de nuevo al ribosoma. Esta proteína interactuó con los ARNt a corta distancia y ayudó a estabilizar el ARNt del sitio P en el complejo post-translocación. Cuando el ARNt se mueve del sitio A- al P, la distancia entre esta proteína y el ARNt se acorta, lo que puede distinguirse por la señal smFRET. Se han identificado múltiples subpoblaciones de ribosomas utilizando métodos estadísticos y mutagénesis, y el intercambio espontáneo de estas poblaciones en el complejo pre- pero no post- translocación sugiere que el ribosoma es más flexible antes de moverse sobre el ARNm, y más rígido durante la decodificación^16,17,18. Estas variaciones son esenciales para la función del ribosoma. Aquí, el protocolo describe los detalles del etiquetado ribosómico/ARNt, su incorporación en el ribosoma, la preparación de muestras smFRET y la adquisición/análisis de datos¹⁹.