Ribozom Protein Sentezinin Tek Molekül floresan Enerji Transferi Çalışması
Summary
Tek moleküllü floresan enerji transferi ribozomal protein sentezi sırasında tRNA dinamiklerini izleyen bir yöntemdir. Bireysel ribozomları izleyerek, mekanizmalara ışık tutan inhomogeneöz popülasyonlar tanımlanır. Bu yöntem, diğer birçok karmaşık biyosistemdeki dinamik işlev ilişkilerini ortaya çıkarmak için genel olarak biyolojik konformasyon değişikliklerini izlemek için kullanılabilir. Tek molekül yöntemleri, ortalama etki nedeniyle geleneksel topluluk yöntemleriyle erişilemeyen oransız sınırlayıcı adımları ve düşük nüfuslu anahtar ara maddeleri gözlemleyebilir.
Abstract
Ribozom, proteinleri mRNA şablonları boyunca işlemsel olarak bir araya getiren büyük bir ribononcleoprotein kompleksidir. Ribozom çapı, A, P ve E-sahalarında büyük tRNA substratlarını barındırmak için yaklaşık 20 nm’dir. Sonuç olarak, ribozom dinamikleri doğal olarak hızlı bir şekilde fazdan arındırılır. Tek molekül yöntemi, her ribozomları ayrı ayrı algılayabilir ve çok bileşenli sistemlerin karmaşık mekanizmalarını ortaya çıkarmak için gerekli olan inhomogeneous popülasyonları ayırt edebilir. Ribozomal protein L27 ve tRNA’lar arasındaki ribozom dinamiklerini araştırmak için Nikon Ti2 ters mikroskobuna dayanan bir smFRET yönteminin ayrıntılarını rapor ediyoruz. L27, benzersiz Cys 53 pozisyonunda etiketlenmiştir ve L27’den yoksun olarak tasarlanmış bir ribozom haline yeniden inşa edilmiştir. tRNA dirsek bölgesinde etiketlenmiştir. tRNA, uzama döngüsü sırasında ribozom içinde translokasyon öncesi ve sonrası gibi farklı yerlere taşınırken, FRET verimlilikleri ve dinamikleri birden fazla alt nüfus öneren farklılıklar sergiler. Bu alt nüfuslar topluluk yöntemleri ile tespit edilemez. TIRF tabanlı smFRET mikroskop, ev yapımı lazer aydınlatmalı manuel veya motorlu ters mikroskop üzerine inşa edilir. Ribozom örnekleri ultrasantrifüjleme ile saflaştırılarak ev yapımı çok kanallı bir örnek hücreye yüklenir ve daha sonra evanescent lazer alanı ile aydınlatılmıştır. Yansıma lazer noktası, mükemmel odağın geri bildirim kontrolünü elde etmek için kullanılabilir. Floresan sinyalleri motorlu bir filtre kulesi ile ayrılır ve iki dijital CMOS kamera tarafından toplanır. Yoğunluklar NIS-Elements yazılımı aracılığıyla alınır.
Introduction
Ribozom, büyük (50S) ve küçük (30S) bir alt birenin ø 20 nm büyük ribonükleoprotein kompleksidir. mRNA şablonu boyunca uzun peptitleri işlemsel ve işbirliği içinde birleştirir. Ribozom 30S, protein sentezine başlamak içinfMet-tRNA fMet ve mRNA’ya bağlanır ve 50S daha sonra 70S başlatma kompleksini oluşturmak için birleşir. TRNA’lar amino asitleri A-sitesindeki (aminoasil- tRNA bağlama bölgesi) ribozomlara getirirken, uzun peptidil zinciri P-sitesinde (peptidyl- tRNA bağlama bölgesi) tutulur. Ön translokasyon kompleksinde, peptidyl zinciri bir amino asit eklenerek A sahasındaki tRNA’ya aktarılır. Bu arada, P-site tRNA’sı devre dışı bırakılır. Daha sonra, A-, P-tRNA’lar, E-sitenin tRNA çıkış sitesini temsil ettiği translokasyon sonrası kompleksini oluşturmak için P-, E-sitelerine taşınır. Bu durumda, peptidyl-tRNA P bölgesine geri döner. Ribozom mRNA üzerinde yer alırken, uzama döngüsü öncesi ve sonrası konformasyonlar arasında devam eder, her seferinde bir kodon1. Ribozom, bu işlemi verimli ve doğru hale getirmek için farklı fonksiyonel sitelerin son derece koordine edicidir, örneğin alt biralar arası cırcır2, tRNA hibridizasyon dalgalanmaları3, GTPase aktivasyonları4, L1 sap açma-kapama5,vb. Sonuç olarak, ribozomlar hızla fazdan arındırılır, çünkü her molekül kendi hızında hareket eder. Geleneksel yöntemler sadece belirgin ortalama parametreleri ortaya yaratabilir, ancak düşük nüfuslu veya kısa ömürlü türler ortalama etki6‘ da maskelenecektir. Tek molekül yöntemi, her ribozom ayrı ayrı tespit ederek bu sınırlamayı kırabilir, daha sonra istatistiksel rekonstrüksiyon ile farklı türleri tanımlayabilir7. tRNA-tRNA8, EF-G-L119,L1-tRNA10vb. Ek olarak, sırasıyla büyük ve küçük alt ünlemler etiketlenerek, alt biralar arası cırcır kinetiği ve faktörlerle koordinasyon gözlenir11,12. Bu arada, smFRET yöntemi diğer merkezi biyolojik süreçlerde geniş uygulamalara sahiptir ve çok renkli FRET yöntemleri ortaya13.
Daha önce yeni bir ribozom FRET çifti geliştirildi14,15. Rekombinant ribozomal protein L27 ifade edildi, saflaştırıldı ve etiketlendi ve ribozom içine geri dahil edildi. Bu protein tRNA’larla yakın mesafede etkileşime girdi ve translokasyon sonrası komplekste P bölgesi tRNA’sının stabilizesine yardımcı oldu. tRNA, A-‘dan P bölgesine taşındığında, bu protein ile tRNA arasındaki mesafe kısalır ve bu da smFRET sinyali ile ayırt edilebilir. İstatistiksel yöntemler ve mutajensis kullanılarak birden fazla ribozom alt popülasyonu tanımlanmıştır ve bu popülasyonların translokasyon öncesi ancak sonrası komplekste kendiliğinden değişimi ribozomların mRNA’ya geçmeden önce daha esnek ve16, 17,18’indekodlanması sırasında daha sert olduğunu göstermektedir. Bu varyasyonlar ribozom fonksiyonu için gereklidir. Burada, protokol ribozom / tRNA etiketlemesinin ayrıntılarını, ribozom, smFRET örnek hazırlama ve veri toplama / analiz19‘a dahil etmelerini açıklar.
Protocol
Representative Results
Discussion
SmFRET arka plan sinyallerine duyarlıdır. İlk olarak, numune odasını% 0.05 ara ile kaplamak ve daha sonra ribozom çözeltisi ile eşzamanlı olarak ribozom çözeltisi ile birlikte ribozomun yüzeye spesifik olmayan bağlanmasını engellemek için eklenebilir. Kabul eden Cy5 emisyonundan floresan görmek için oksijen çöpçü kokteyli (deoksi, glikoz ve Trolox çözeltileri) gereklidir. Bu çözüm olmadan, beyazlatma, yararlı bilgi elde etmek için kabul eden kanalda çok hızlıdır. Ribozom deneyleri için ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01GM111452) ve Welch Vakfı (E-1721) tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Aminosilane | Laysanbio | MPEG-SIL-5000 | |
| Biotin-PEG | Laysanbio | Biotin-PEG-SVA-5000 | |
| BL21(DE3)pLysS cells | Novagen | 71403 | |
| Catalase | millipore sigma | C3515 | |
| CS150FNX Micro Ultracentrifuge | nuaire | ||
| Cy3/C5-maleimide | ApexBio | A8138/A8140 | |
| ECLIPSE Ti2 inverted microscope | Nikon | ||
| EdgeGARD Laminar Flow Hood | Baker | ||
| Glucose oxidase | millipore sigma | G2133 | |
| Histrap HP column (Prepacked sepharose column) | Cytiva | 17524701 | |
| Microscope cover slip | VWR | 48393-230 | |
| Microscope glass slides | VWR | 470235-792 | |
| ORCA-Flash4.0 V3 camera | Hamamatsu | ||
| PEG (5,000) | Laysanbio | MPEG-SVA-5000 | |
| pET-21b (+) plasmid | Novagen | 69741 | |
| Sonicator | VWR | CPX-952-518R | |
| TCEP | Apexbio | B6055 | |
| Trolox | millipore sigma | 238813 |
References
- Ramakrishnan, V. What we have learned from ribosome structures. Biochemical Society Transactions. 36, 567-574 (2008).
- Frank, J., Agrawal, R. K. A ratchet-like inter-subunit reorganization of the ribosome during translocation. Nature. 406 (6793), 318-322 (2000).
- Moazed, D., Noller, H. F. Intermediate states in the movement of transfer RNA in the ribosome. Nature. 342 (6246), 142-148 (1989).
- Schmeing, T., et al. The crystal structure of the ribosome bound to EF-Tu and aminoacyl-tRNA. Science. 326 (5953), 688-694 (2009).
- Valle, M., et al. Locking and unlocking of ribosomal motions. Cell. 114 (1), 123-134 (2003).
- Gromadski, K. B., Rodnina, M. V. Kinetic determinants of high-fidelity tRNA discrimination on the ribosome. Molecular Cell. 13 (2), 191-200 (2004).
- Blanchard, S., et al. tRNA dynamics on the ribosome during translation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (35), 12893-12898 (2004).
- Blanchard, S., et al. tRNA selection and kinetic proofreading in translation. Nature Structural and Molecular Biology. 11 (10), 1008-1014 (2004).
- Wang, Y., et al. Single-molecule structural dynamics of ef-g-ribosome interaction during translocation. Biochemistry. 46 (38), 10767-10775 (2007).
- Cornish, P., et al. Following the movement of the L1 stalk between three functional states in single ribosomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (8), 2571-2576 (2009).
- Cornish, P., et al. Spontaneous intersubunit rotation in single ribosomes. Molecular Cell. 30 (5), 578-588 (2008).
- Chen, J., et al. Coordinated conformational and compositional dynamics drive ribosome translocation. Nature Structural and Molecular Biology. 20 (6), 718-727 (2013).
- Feng, X. A., Poyton, M. F., Ha, T. Multicolor single-molecule FRET for DNA and RNA processes. Current Opinion in Structural Biology. 70, 26-33 (2021).
- Ly, C. T., Altuntop, M. E., Wang, Y. Single-molecule study of viomycin’s inhibition mechanism on ribosome translocation. Biochemistry. 49 (45), 9732-9738 (2010).
- Altuntop, M. E., Ly, C. T., Wang, Y. Single-molecule study of ribosome hierarchic dynamics at the peptidyl transferase center. Biophysical Journal. 99 (9), 3002-3009 (2010).
- Wang, Y., Xiao, M., Li, Y. Heterogeneity of single molecule FRET signals reveals multiple active ribosome subpopulations. Proteins. 82 (1), 1-9 (2014).
- Xiao, M., Wang, Y. L27-tRNA interaction revealed by mutagenesis and pH titration. Biophysical Chemistry. 167, 8-15 (2012).
- Wang, Y., Xiao, M. Role of the ribosomal protein L27 revealed by single-molecule FRET study. Protein Science. 21 (11), 1696-1704 (2012).
- Lin, R., Wang, Y. Automated smFRET microscope for the quantification of label-free DNA oligos. Biomedical Optics Express. 10 (2), 682-693 (2019).
- Moazed, D., et al. Interconversion of active and inactive 30 S ribosomal subunits is accompanied by a conformational change in the decoding region of 16 S rRNA. Journal of Molecular Biology. 191 (3), 483-493 (1986).
- Wower, I. K., Wower, J., Zimmermann, R. A. Ribosomal protein L27 participates in both 50 S subunit assembly and the peptidyl transferase reaction. Journal of Biological Chemistry. 273 (31), 19847-19852 (1998).
- Pan, D., Qin, H., Cooperman, B. S. Synthesis and functional activity of tRNAs labeled with fluorescent hydrazides in the D-loop. RNA. 15 (2), 346-354 (2009).
- Yang, H., Xiao, M., Wang, Y. A novel data-driven algorithm to reveal and track the ribosome heterogeneity in single molecule studies. Biophysical Chemistry. 199, 39-45 (2015).
- Metskas, L. A., Rhoades, E. Single-molecule FRET of intrinsically disordered proteins. Annual Review of Physical Chemistry. 71, 391-414 (2020).
- Hellenkamp, B., et al. Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements-a multi-laboratory benchmark study. Nature Methods. 15 (9), 669-676 (2018).
- Tsai, T., et al. High-Efficiency “-1” and “-2” Ribosomal Frameshiftings Revealed by Force Spectroscopy. ACS Chemical Biology. 12 (6), 1629-1635 (2017).
- Yin, H., Xu, S., Wang, Y. Dual DNA rulers to study the mechanism of ribosome translocation with single-nucleotide resolution. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (149), e59918 (2019).
- Desai, V., et al. Co-temporal force and fluorescence measurements reveal a ribosomal gear shift mechanism of translation regulation by structured mRNAs. Molecular Cell. 75 (5), 1007-1019 (2019).
