Исследование переноса энергии флуоресценции одной молекулы синтеза белка рибосомы
Summary
Перенос энергии флуоресценции одной молекулы — это метод, который отслеживает динамику тРНК при синтезе рибосомного белка. Отслеживая отдельные рибосомы, идентифицируются неоднородные популяции, которые проливают свет на механизмы. Этот метод может быть использован для отслеживания биологических конформационных изменений в целом, чтобы выявить динамически-функциональные отношения во многих других сложных биосистемах. Одномолекулярные методы могут наблюдать нескоростные ограничивающие стадии и малонаселенные ключевые промежуточные продукты, которые недоступны обычным ансамблевым методам из-за среднего эффекта.
Abstract
Рибосома представляет собой большой рибонуклеопротеиновый комплекс, который процессно собирает белки вдоль шаблонов мРНК. Диаметр рибосомы составляет приблизительно 20 нм для размещения крупных субстратов тРНК на A-, P- и E-сайтах. Следовательно, динамика рибосом естественным образом быстро размещается. Одномолекулярный метод может обнаружить каждую рибосому отдельно и выделить неоднородные популяции, что необходимо для выявления сложных механизмов многокомпонентных систем. Мы сообщаем подробности метода smFRET на основе инвертированного микроскопа Nikon Ti2 для исследования динамики рибосом между рибосомным белком L27 и тРНК. L27 помечен в своем уникальном положении Cys 53 и восстановлен в рибосому, которая спроектирована так, чтобы не хватать L27. ТРНК мечется в области локтя. Поскольку тРНК перемещается в разные места внутри рибосомы во время цикла удлинения, такие как пре- и пост-транслокация, эффективность и динамика FRET демонстрируют различия, которые предполагают несколько субпопуляций. Эти субпопуляции не обнаруживаются ансамблевыми методами. Микроскоп smFRET на основе TIRF построен на ручном или моторизованного инвертированном микроскопе с самодельным лазерным освещением. Образцы рибосом очищают ультрацентрифугированием, загружают в самодельную многоканальный пробоотборную ячейку, а затем освещают с помощью испаряющегося лазерного поля. Отражательное лазерное пятно может быть использовано для достижения обратной связи управления идеальной фокусировки. Флуоресцентные сигналы разделены моторизованной фильтрующей башней и собраны двумя цифровыми КМОП-камерами. Интенсивности извлекаются с помощью программного обеспечения NIS-Elements.
Introduction
Рибосома представляет собой ø 20 нм большой рибонуклеопротеиновый комплекс большой (50S) и малой (30S) субъединица. Он собирает длинные пептиды вдоль шаблона мРНК процессивно и совместно. Рибосома 30S связывается с fMet-tRNAfMet и мРНК, чтобы начать синтез белка, а затем 50S присоединяется, образуя комплекс инициации 70S. ТРНК приносят аминокислоты в рибосому на А-сайте (сайт связывания аминоацил-тРНК), в то время как удлиненная пептидильная цепь удерживается на Р-сайте (пептидил-тРНК-сайт связывания). В пре-транслокационном комплексе пептидильная цепь переносится в тРНК на А-участке с добавлением одной аминокислоты. Между тем, Р-сайт тРНК деацилируется. Затем A-, P-тРНК перемещаются к P-, E-сайтам с образованием пост-транслокационного комплекса, в котором E-сайт представляет собой сайт выхода тРНК. В этом состоянии пептидил-тРНК перемещается обратно в Р-сайт. Цикл удлинения продолжается между пре- и постконформациями, в то время как рибосома транслоцируется на мРНК, по одному кодону за раз1. Рибосома высоко координирует различные функциональные участки, чтобы сделать этот процесс эффективным и точным, такие как храповая храповаяхраповая храповая 2между субъединицами, флуктуации гибридизации тРНК3,активации GTPase4,открытие-закрытие стебля L15и т. Д. Следовательно, рибосомы быстро раздваиваются, потому что каждая молекула движется в своем собственном темпе. Обычные методы могут выводить только кажущиеся средние параметры, но малонаселенные или короткоживущие виды будут маскироваться в среднемэффекте 6. Метод одной молекулы может нарушить это ограничение, обнаружив каждую рибосому по отдельности, а затем идентифицировать различные виды с помощью статистической реконструкции7. Различные сайты маркировки были реализованы для исследования динамики рибосом, таких как взаимодействия между тРНК-тРНК8,EF-G-L119,L1-тРНК10и т. Д. Кроме того, при маркировке больших и малых субъединиц, соответственно, наблюдается межсуставная храповая кинетика и координация с факторами11,12. Между тем, метод smFRET имеет широкое применение в других центральных биологических процессах, а многоцветные методы FRET появляются13.
Ранее была разработана новая рибосома FRET пары14,15. Рекомбинантный рибосомный белок L27 был экспрессирован, очищен и помечен и включен обратно в рибосому. Этот белок взаимодействовал с тРНК на близком расстоянии и помог стабилизировать рРНК P-сайта в пост-транслокационном комплексе. Когда тРНК перемещается из А- в Р-сайт, расстояние между этим белком и тРНК укорачивается, что можно различить по сигналу smFRET. Множественные рибосомные субпопуляции были идентифицированы с использованием статистических методов и мутагенеза, и спонтанный обмен этими популяциями в до-, но не пост-транслокационном комплексе предполагает, что рибосома более гибкая перед перемещением по мРНК и более жесткая при декодировании16,17,18. Эти вариации необходимы для функции рибосом. Здесь протокол описывает детали маркировки рибосом/тРНК, их включение в рибосому, подготовку образцов smFRET и сбор/анализ данных19.
Protocol
Representative Results
Discussion
SmFRET чувствителен к фоновым сигналам. Сначала необходимо покрыть камеру образца 0,05% анимацией, а затем добавить одновременно с раствором рибосомы, чтобы блокировать неспецифическое связывание рибосомы с поверхностью. Чтобы увидеть флуоресценцию от акцепторного излучения Cy5, необходим…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа поддерживается Национальными институтами здравоохранения США (R01GM111452) и Фондом Уэлча (E-1721).
Materials
| Aminosilane | Laysanbio | MPEG-SIL-5000 | |
| Biotin-PEG | Laysanbio | Biotin-PEG-SVA-5000 | |
| BL21(DE3)pLysS cells | Novagen | 71403 | |
| Catalase | millipore sigma | C3515 | |
| CS150FNX Micro Ultracentrifuge | nuaire | ||
| Cy3/C5-maleimide | ApexBio | A8138/A8140 | |
| ECLIPSE Ti2 inverted microscope | Nikon | ||
| EdgeGARD Laminar Flow Hood | Baker | ||
| Glucose oxidase | millipore sigma | G2133 | |
| Histrap HP column (Prepacked sepharose column) | Cytiva | 17524701 | |
| Microscope cover slip | VWR | 48393-230 | |
| Microscope glass slides | VWR | 470235-792 | |
| ORCA-Flash4.0 V3 camera | Hamamatsu | ||
| PEG (5,000) | Laysanbio | MPEG-SVA-5000 | |
| pET-21b (+) plasmid | Novagen | 69741 | |
| Sonicator | VWR | CPX-952-518R | |
| TCEP | Apexbio | B6055 | |
| Trolox | millipore sigma | 238813 |
References
- Ramakrishnan, V. What we have learned from ribosome structures. Biochemical Society Transactions. 36, 567-574 (2008).
- Frank, J., Agrawal, R. K. A ratchet-like inter-subunit reorganization of the ribosome during translocation. Nature. 406 (6793), 318-322 (2000).
- Moazed, D., Noller, H. F. Intermediate states in the movement of transfer RNA in the ribosome. Nature. 342 (6246), 142-148 (1989).
- Schmeing, T., et al. The crystal structure of the ribosome bound to EF-Tu and aminoacyl-tRNA. Science. 326 (5953), 688-694 (2009).
- Valle, M., et al. Locking and unlocking of ribosomal motions. Cell. 114 (1), 123-134 (2003).
- Gromadski, K. B., Rodnina, M. V. Kinetic determinants of high-fidelity tRNA discrimination on the ribosome. Molecular Cell. 13 (2), 191-200 (2004).
- Blanchard, S., et al. tRNA dynamics on the ribosome during translation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (35), 12893-12898 (2004).
- Blanchard, S., et al. tRNA selection and kinetic proofreading in translation. Nature Structural and Molecular Biology. 11 (10), 1008-1014 (2004).
- Wang, Y., et al. Single-molecule structural dynamics of ef-g-ribosome interaction during translocation. Biochemistry. 46 (38), 10767-10775 (2007).
- Cornish, P., et al. Following the movement of the L1 stalk between three functional states in single ribosomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (8), 2571-2576 (2009).
- Cornish, P., et al. Spontaneous intersubunit rotation in single ribosomes. Molecular Cell. 30 (5), 578-588 (2008).
- Chen, J., et al. Coordinated conformational and compositional dynamics drive ribosome translocation. Nature Structural and Molecular Biology. 20 (6), 718-727 (2013).
- Feng, X. A., Poyton, M. F., Ha, T. Multicolor single-molecule FRET for DNA and RNA processes. Current Opinion in Structural Biology. 70, 26-33 (2021).
- Ly, C. T., Altuntop, M. E., Wang, Y. Single-molecule study of viomycin’s inhibition mechanism on ribosome translocation. Biochemistry. 49 (45), 9732-9738 (2010).
- Altuntop, M. E., Ly, C. T., Wang, Y. Single-molecule study of ribosome hierarchic dynamics at the peptidyl transferase center. Biophysical Journal. 99 (9), 3002-3009 (2010).
- Wang, Y., Xiao, M., Li, Y. Heterogeneity of single molecule FRET signals reveals multiple active ribosome subpopulations. Proteins. 82 (1), 1-9 (2014).
- Xiao, M., Wang, Y. L27-tRNA interaction revealed by mutagenesis and pH titration. Biophysical Chemistry. 167, 8-15 (2012).
- Wang, Y., Xiao, M. Role of the ribosomal protein L27 revealed by single-molecule FRET study. Protein Science. 21 (11), 1696-1704 (2012).
- Lin, R., Wang, Y. Automated smFRET microscope for the quantification of label-free DNA oligos. Biomedical Optics Express. 10 (2), 682-693 (2019).
- Moazed, D., et al. Interconversion of active and inactive 30 S ribosomal subunits is accompanied by a conformational change in the decoding region of 16 S rRNA. Journal of Molecular Biology. 191 (3), 483-493 (1986).
- Wower, I. K., Wower, J., Zimmermann, R. A. Ribosomal protein L27 participates in both 50 S subunit assembly and the peptidyl transferase reaction. Journal of Biological Chemistry. 273 (31), 19847-19852 (1998).
- Pan, D., Qin, H., Cooperman, B. S. Synthesis and functional activity of tRNAs labeled with fluorescent hydrazides in the D-loop. RNA. 15 (2), 346-354 (2009).
- Yang, H., Xiao, M., Wang, Y. A novel data-driven algorithm to reveal and track the ribosome heterogeneity in single molecule studies. Biophysical Chemistry. 199, 39-45 (2015).
- Metskas, L. A., Rhoades, E. Single-molecule FRET of intrinsically disordered proteins. Annual Review of Physical Chemistry. 71, 391-414 (2020).
- Hellenkamp, B., et al. Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements-a multi-laboratory benchmark study. Nature Methods. 15 (9), 669-676 (2018).
- Tsai, T., et al. High-Efficiency “-1” and “-2” Ribosomal Frameshiftings Revealed by Force Spectroscopy. ACS Chemical Biology. 12 (6), 1629-1635 (2017).
- Yin, H., Xu, S., Wang, Y. Dual DNA rulers to study the mechanism of ribosome translocation with single-nucleotide resolution. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (149), e59918 (2019).
- Desai, V., et al. Co-temporal force and fluorescence measurements reveal a ribosomal gear shift mechanism of translation regulation by structured mRNAs. Molecular Cell. 75 (5), 1007-1019 (2019).
