Studio di trasferimento di energia di fluorescenza a singola molecola della sintesi proteica del ribosoma
Summary
Il trasferimento di energia di fluorescenza a singola molecola è un metodo che traccia la dinamica del tRNA durante la sintesi proteica ribosomiale. Tracciando i singoli ribosomi, vengono identificate popolazioni disomogenee, che fanno luce sui meccanismi. Questo metodo può essere utilizzato per tracciare i cambiamenti conformazionali biologici in generale per rivelare relazioni dinamico-funzionali in molti altri biosistemi complessi. I metodi a singola molecola possono osservare passaggi non limitanti la velocità e intermedi chiave poco popolati, che non sono accessibili con i metodi convenzionali di ensemble a causa dell’effetto medio.
Abstract
Il ribosoma è un grande complesso ribonucleoproteico che assembla le proteine in modo processivo lungo i modelli di mRNA. Il diametro del ribosoma è di circa 20 nm per ospitare grandi substrati di tRNA nei siti A-, P- ed E. Di conseguenza, la dinamica dei ribosomi viene naturalmente de-sfasata rapidamente. Il metodo a singola molecola può rilevare ogni ribosoma separatamente e distinguere popolazioni disomogenee, il che è essenziale per rivelare i complicati meccanismi dei sistemi multicomponenti. Riportiamo i dettagli di un metodo smFRET basato sul microscopio invertito Nikon Ti2 per sondare la dinamica dei ribosomi tra la proteina ribosomiale L27 e i tRNA. L’L27 è etichettato nella sua posizione unica Cys 53 e ricostituito in un ribosoma progettato per mancare di L27. Il tRNA è etichettato nella sua regione del gomito. Mentre il tRNA si sposta in diverse posizioni all’interno del ribosoma durante il ciclo di allungamento, come la pre e post traslocazione, le efficienze e le dinamiche FRET mostrano differenze, che hanno suggerito più sottopopolazioni. Queste sottopopolazioni non sono rilevabili con metodi di insieme. Il microscopio smFRET basato su TIRF è costruito su un microscopio invertito manuale o motorizzato, con illuminazione laser costruita in casa. I campioni di ribosomi vengono purificati mediante ultracentrifugazione, caricati in una cella campione multicanale costruita in casa e quindi illuminati tramite un campo laser evanescente. Lo spot laser a riflessione può essere utilizzato per ottenere il controllo del feedback della messa a fuoco perfetta. I segnali di fluorescenza sono separati da una torretta-filtro motorizzata e raccolti da due telecamere CMOS digitali. Le intensità vengono recuperate tramite il software NIS-Elements.
Introduction
Il ribosoma è un complesso ribonucleoproteico grande ø 20 nm di una grande (50S) e una piccola (30S) subunità. Assembla peptidi lunghi lungo il modello di mRNA in modo processivo e cooperativo. Il ribosoma 30S si lega al fMet-tRNAfMet e all’mRNA per avviare la sintesi proteica, e il 50S si unisce quindi per formare il complesso di iniziazione degli anni ’70. I tRNA portano gli amminoacidi al ribosoma nel sito A (sito di legame aminoacil-tRNA), mentre la catena peptidil allungata è tenuta nel sito P (sito di legame peptidil-tRNA). Nel complesso di pre-traslocazione, la catena peptidil viene trasferita al tRNA nel sito A con l’aggiunta di un amminoacido. Nel frattempo, il tRNA del sito P è deacilato. Quindi, i TRNA A-, P-tRNA si spostano nei siti P-, E- per formare il complesso post-traslocazione, in cui il sito E rappresenta il sito di uscita del tRNA. In questo stato, il peptidil-tRNA ritorna al sito P. Il ciclo di allungamento continua tra le pre- e post-conformazioni mentre il ribosoma trasloca sull’mRNA, un codone alla volta1. Il ribosoma è altamente coordinativo di diversi siti funzionali per rendere questo processo efficiente e preciso, come il ratcheting inter-subunità2,le fluttuazioni di ibridazione del tRNA3,le attivazioni della GTPasi4,l’apertura-chiusura del gambo L15,ecc. Di conseguenza, i ribosomi de-fase rapidamente perché ogni molecola si muove al proprio ritmo. I metodi convenzionali possono dedurre solo parametri medi apparenti, ma le specie poco popolate o di breve durata saranno mascherate nell’effetto medio6. Il metodo a singola molecola può rompere questa limitazione rilevando ogni ribosoma individualmente, quindi identificare diverse specie tramite la ricostruzione statistica7. Sono stati implementati diversi siti di etichettatura per sondare la dinamica dei ribosomi, come le interazioni tra tRNA-tRNA8, EF-G-L119, L1-tRNA10, ecc. Inoltre, etichettando le subunità grandi e piccole, rispettivamente, si osserva la cinetica a cricchetto inter-subunità e la coordinazione con i fattori11,12. Nel frattempo, il metodo smFRET ha ampie applicazioni in altri processi biologici centrali e i metodi FRET multicolore stanno emergendo13.
In precedenza è stata sviluppata una nuova coppia di ribosomi FRET14,15. La proteina ribosomiale ricombinante L27 è stata espressa, purificata ed etichettata e incorporata nel ribosoma. Questa proteina ha interagito con i tRNA a distanza ravvicinata e ha contribuito a stabilizzare il tRNA del sito P nel complesso post-traslocazione. Quando il tRNA si sposta dal sito A- al sito P, la distanza tra questa proteina e il tRNA si accorcia, che può essere distinta dal segnale smFRET. Sono state identificate sottopopolazioni multiple di ribosomi utilizzando metodi statistici e mutagenesi, e lo scambio spontaneo di queste popolazioni nel complesso pre- ma non post- traslocazione suggerisce che il ribosoma è più flessibile prima di muoversi sull’mRNA e più rigido durante la decodifica16,17,18. Queste variazioni sono essenziali per la funzione del ribosoma. Qui, il protocollo descrive i dettagli dell’etichettatura dei ribosomi / tRNA, la loro incorporazione nel ribosoma, la preparazione del campione smFRET e l’acquisizione / analisi dei dati19.
Protocol
Representative Results
Discussion
SmFRET è sensibile ai segnali di fondo. In primo luogo, è necessario rivestire la camera del campione con un’interpolazione dello 0,05% e quindi essere aggiunta contemporaneamente alla soluzione di ribosoma per bloccare il legame non specifico del ribosoma alla superficie. Per vedere la fluorescenza dall’emissione dell’accettore Cy5, il cocktail di scavenger di ossigeno (soluzioni deossidiche, glucosio e Trolox) è essenziale. Senza questa soluzione, lo sbiancamento è troppo veloce nel canale accettore per ottenere in…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è sostenuto dal National Institutes of Health degli Stati Uniti (R01GM111452) e dalla Welch Foundation (E-1721).
Materials
| Aminosilane | Laysanbio | MPEG-SIL-5000 | |
| Biotin-PEG | Laysanbio | Biotin-PEG-SVA-5000 | |
| BL21(DE3)pLysS cells | Novagen | 71403 | |
| Catalase | millipore sigma | C3515 | |
| CS150FNX Micro Ultracentrifuge | nuaire | ||
| Cy3/C5-maleimide | ApexBio | A8138/A8140 | |
| ECLIPSE Ti2 inverted microscope | Nikon | ||
| EdgeGARD Laminar Flow Hood | Baker | ||
| Glucose oxidase | millipore sigma | G2133 | |
| Histrap HP column (Prepacked sepharose column) | Cytiva | 17524701 | |
| Microscope cover slip | VWR | 48393-230 | |
| Microscope glass slides | VWR | 470235-792 | |
| ORCA-Flash4.0 V3 camera | Hamamatsu | ||
| PEG (5,000) | Laysanbio | MPEG-SVA-5000 | |
| pET-21b (+) plasmid | Novagen | 69741 | |
| Sonicator | VWR | CPX-952-518R | |
| TCEP | Apexbio | B6055 | |
| Trolox | millipore sigma | 238813 |
References
- Ramakrishnan, V. What we have learned from ribosome structures. Biochemical Society Transactions. 36, 567-574 (2008).
- Frank, J., Agrawal, R. K. A ratchet-like inter-subunit reorganization of the ribosome during translocation. Nature. 406 (6793), 318-322 (2000).
- Moazed, D., Noller, H. F. Intermediate states in the movement of transfer RNA in the ribosome. Nature. 342 (6246), 142-148 (1989).
- Schmeing, T., et al. The crystal structure of the ribosome bound to EF-Tu and aminoacyl-tRNA. Science. 326 (5953), 688-694 (2009).
- Valle, M., et al. Locking and unlocking of ribosomal motions. Cell. 114 (1), 123-134 (2003).
- Gromadski, K. B., Rodnina, M. V. Kinetic determinants of high-fidelity tRNA discrimination on the ribosome. Molecular Cell. 13 (2), 191-200 (2004).
- Blanchard, S., et al. tRNA dynamics on the ribosome during translation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (35), 12893-12898 (2004).
- Blanchard, S., et al. tRNA selection and kinetic proofreading in translation. Nature Structural and Molecular Biology. 11 (10), 1008-1014 (2004).
- Wang, Y., et al. Single-molecule structural dynamics of ef-g-ribosome interaction during translocation. Biochemistry. 46 (38), 10767-10775 (2007).
- Cornish, P., et al. Following the movement of the L1 stalk between three functional states in single ribosomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (8), 2571-2576 (2009).
- Cornish, P., et al. Spontaneous intersubunit rotation in single ribosomes. Molecular Cell. 30 (5), 578-588 (2008).
- Chen, J., et al. Coordinated conformational and compositional dynamics drive ribosome translocation. Nature Structural and Molecular Biology. 20 (6), 718-727 (2013).
- Feng, X. A., Poyton, M. F., Ha, T. Multicolor single-molecule FRET for DNA and RNA processes. Current Opinion in Structural Biology. 70, 26-33 (2021).
- Ly, C. T., Altuntop, M. E., Wang, Y. Single-molecule study of viomycin’s inhibition mechanism on ribosome translocation. Biochemistry. 49 (45), 9732-9738 (2010).
- Altuntop, M. E., Ly, C. T., Wang, Y. Single-molecule study of ribosome hierarchic dynamics at the peptidyl transferase center. Biophysical Journal. 99 (9), 3002-3009 (2010).
- Wang, Y., Xiao, M., Li, Y. Heterogeneity of single molecule FRET signals reveals multiple active ribosome subpopulations. Proteins. 82 (1), 1-9 (2014).
- Xiao, M., Wang, Y. L27-tRNA interaction revealed by mutagenesis and pH titration. Biophysical Chemistry. 167, 8-15 (2012).
- Wang, Y., Xiao, M. Role of the ribosomal protein L27 revealed by single-molecule FRET study. Protein Science. 21 (11), 1696-1704 (2012).
- Lin, R., Wang, Y. Automated smFRET microscope for the quantification of label-free DNA oligos. Biomedical Optics Express. 10 (2), 682-693 (2019).
- Moazed, D., et al. Interconversion of active and inactive 30 S ribosomal subunits is accompanied by a conformational change in the decoding region of 16 S rRNA. Journal of Molecular Biology. 191 (3), 483-493 (1986).
- Wower, I. K., Wower, J., Zimmermann, R. A. Ribosomal protein L27 participates in both 50 S subunit assembly and the peptidyl transferase reaction. Journal of Biological Chemistry. 273 (31), 19847-19852 (1998).
- Pan, D., Qin, H., Cooperman, B. S. Synthesis and functional activity of tRNAs labeled with fluorescent hydrazides in the D-loop. RNA. 15 (2), 346-354 (2009).
- Yang, H., Xiao, M., Wang, Y. A novel data-driven algorithm to reveal and track the ribosome heterogeneity in single molecule studies. Biophysical Chemistry. 199, 39-45 (2015).
- Metskas, L. A., Rhoades, E. Single-molecule FRET of intrinsically disordered proteins. Annual Review of Physical Chemistry. 71, 391-414 (2020).
- Hellenkamp, B., et al. Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements-a multi-laboratory benchmark study. Nature Methods. 15 (9), 669-676 (2018).
- Tsai, T., et al. High-Efficiency “-1” and “-2” Ribosomal Frameshiftings Revealed by Force Spectroscopy. ACS Chemical Biology. 12 (6), 1629-1635 (2017).
- Yin, H., Xu, S., Wang, Y. Dual DNA rulers to study the mechanism of ribosome translocation with single-nucleotide resolution. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (149), e59918 (2019).
- Desai, V., et al. Co-temporal force and fluorescence measurements reveal a ribosomal gear shift mechanism of translation regulation by structured mRNAs. Molecular Cell. 75 (5), 1007-1019 (2019).
