Étude de transfert d’énergie de fluorescence à molécule unique de synthèse de protéines ribosomes
Summary
Le transfert d’énergie de fluorescence à molécule unique est une méthode qui suit la dynamique de l’ARNt pendant la synthèse des protéines ribosomiques. En suivant les ribosomes individuels, des populations inhomogènes sont identifiées, ce qui met en lumière les mécanismes. Cette méthode peut être utilisée pour suivre les changements conformationnels biologiques en général afin de révéler les relations dynamique-fonction dans de nombreux autres biosystèmes complexes. Les méthodes à molécule unique peuvent observer des pas de limitation de débit et des intermédiaires clés peu peuplés, qui ne sont pas accessibles par les méthodes d’ensemble conventionnelles en raison de l’effet moyen.
Abstract
Le ribosome est un grand complexe ribonucléoprotéique qui assemble les protéines de manière processive le long des modèles d’ARNm. Le diamètre du ribosome est d’environ 20 nm pour accueillir de grands substrats d’ARNt sur les sites A, P et E. Par conséquent, la dynamique des ribosomes est naturellement déphasée rapidement. La méthode à molécule unique peut détecter chaque ribosome séparément et distinguer les populations inhomogènes, ce qui est essentiel pour révéler les mécanismes complexes des systèmes à plusieurs composants. Nous rapportons les détails d’une méthode smFRET basée sur le microscope inversé Nikon Ti2 pour sonder la dynamique des ribosomes entre la protéine ribosomique L27 et les ARNt. Le L27 est étiqueté à sa position unique Cys 53 et reconstitué en un ribosome conçu pour manquer de L27. L’ARNt est marqué à la région du coude. Au fur et à mesure que l’ARNt se déplace vers différents endroits à l’intérieur du ribosome pendant le cycle d’allongement, tels que la pré- et la post-translocation, l’efficacité et la dynamique fret présentent des différences, qui ont suggéré de multiples sous-populations. Ces sous-populations ne sont pas détectables par les méthodes d’ensemble. Le microscope smFRET basé sur le TIRF est construit sur un microscope inversé manuel ou motorisé, avec un éclairage laser fait maison. Les échantillons de ribosomes sont purifiés par ultracentrifugation, chargés dans une cellule d’échantillonnage multicanal construite à la maison, puis éclairés via un champ laser évanescent. Le point laser à réflexion peut être utilisé pour obtenir un contrôle de rétroaction de la mise au point parfaite. Les signaux de fluorescence sont séparés par une tourelle filtrante motorisée et collectés par deux caméras CMOS numériques. Les intensités sont récupérées via le logiciel NIS-Elements.
Introduction
Le ribosome est un grand complexe ribonucléoprotéique de ø 20 nm d’une grande (50S) et d’une petite (30S) sous-unité. Il assemble de longs peptides le long du modèle d’ARNm de manière processive et coopérative. Le ribosome 30S se lie à l’ARNmfMet et à l’ARNm pour commencer la synthèse des protéines, et le 50S se joint ensuite pour former le complexe d’initiation 70S. Les ARNt apportent des acides aminés au ribosome au site A (site de liaison de l’aRNt aminoacyle), tandis que la chaîne peptidyle allongée est maintenue au site P (site de liaison de l’ARNt peptidyle). Dans le complexe de pré-translocation, la chaîne peptidyle est transférée à l’ARNt au site A avec un acide aminé ajouté. Pendant ce temps, l’ARNt du site P est désacylé. Ensuite, les ARNt A, P se déplacent vers les sites P, E pour former le complexe post-translocation, dans lequel le site E représente le site de sortie de l’ARNt. Dans cet état, le peptidyl-ARNt retourne au site P. Le cycle d’allongement se poursuit entre les pré- et post-conformations tandis que le ribosome se transloque sur l’ARNm, un codon à la fois1. Le ribosome est hautement coordinateur de différents sites fonctionnels pour rendre ce processus efficace et précis, tels que le cliquet inter-sous-unités2,les fluctuations d’hybridation de l’ARNt3,les activations de la GTPase4,l’ouverture-fermeture de la tige L15,etc. Par conséquent, les ribosomes se déphasent rapidement car chaque molécule se déplace à son propre rythme. Les méthodes conventionnelles ne peuvent déduire que des paramètres moyens apparents, mais les espèces peu peuplées ou de courte durée de vie seront masquées dans l’effet moyen6. La méthode à molécule unique peut briser cette limitation en détectant chaque ribosome individuellement, puis identifier différentes espèces via une reconstruction statistique7. Différents sites de profilage ont été mis en œuvre pour sonder la dynamique des ribosomes, tels que les interactions entre l’ARNt-ARNt8,l’EF-G-L119,l’ARNt10,etc. De plus, en étiquetant les grandes et les petites sous-unités, respectivement, on observe une cinétique de cliquet inter-sous-unités et une coordination avec les facteurs11,12. Pendant ce temps, la méthode smFRET a de vastes applications dans d’autres processus biologiques centraux, et les méthodes FRET multicolores émergent13.
Auparavant, une nouvelle paire fret de ribosomes a été développée14,15. La protéine ribosomique recombinante L27 a été exprimée, purifiée et étiquetée, et réincorporée dans le ribosome. Cette protéine a interagi avec les ARNt à une distance rapprochée et a aidé à stabiliser l’ARNt du site P dans le complexe post-translocation. Lorsque l’ARNt se déplace du site A vers le site P, la distance entre cette protéine et l’ARNt est raccourcie, ce qui peut être distingué par le signal smFRET. De multiples sous-populations de ribosomes ont été identifiées à l’aide de méthodes statistiques et de mutagénèse, et l’échange spontané de ces populations dans le complexe pré- mais pas post-translocation suggère que le ribosome est plus flexible avant de se déplacer sur l’ARNm, et plus rigide lors du décodage16,17,18. Ces variations sont essentielles à la fonction du ribosome. Ici, le protocole décrit les détails du labeling ribosome/ARNt, leur incorporation dans le ribosome, la préparation de l’échantillon smFRET et l’acquisition/analyse des données19.
Protocol
Representative Results
Discussion
SmFRET est sensible aux signaux d’arrière-plan. Tout d’abord, il est nécessaire de recouvrir la chambre d’échantillonnage d’une interpolation à 0,05%, puis d’être ajouté en même temps que la solution de ribosome pour bloquer la liaison non spécifique du ribosome à la surface. Pour voir la fluorescence de l’émission de cy5 de l’accepteur, le cocktail piégeur d’oxygène (solutions de désoxy, de glucose et de Trolox) est essentiel. Sans cette solution, le blanchiment est trop rapide dans le canal…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail est soutenu par les National Institutes of Health des États-Unis (R01GM111452) et la Welch Foundation (E-1721).
Materials
| Aminosilane | Laysanbio | MPEG-SIL-5000 | |
| Biotin-PEG | Laysanbio | Biotin-PEG-SVA-5000 | |
| BL21(DE3)pLysS cells | Novagen | 71403 | |
| Catalase | millipore sigma | C3515 | |
| CS150FNX Micro Ultracentrifuge | nuaire | ||
| Cy3/C5-maleimide | ApexBio | A8138/A8140 | |
| ECLIPSE Ti2 inverted microscope | Nikon | ||
| EdgeGARD Laminar Flow Hood | Baker | ||
| Glucose oxidase | millipore sigma | G2133 | |
| Histrap HP column (Prepacked sepharose column) | Cytiva | 17524701 | |
| Microscope cover slip | VWR | 48393-230 | |
| Microscope glass slides | VWR | 470235-792 | |
| ORCA-Flash4.0 V3 camera | Hamamatsu | ||
| PEG (5,000) | Laysanbio | MPEG-SVA-5000 | |
| pET-21b (+) plasmid | Novagen | 69741 | |
| Sonicator | VWR | CPX-952-518R | |
| TCEP | Apexbio | B6055 | |
| Trolox | millipore sigma | 238813 |
References
- Ramakrishnan, V. What we have learned from ribosome structures. Biochemical Society Transactions. 36, 567-574 (2008).
- Frank, J., Agrawal, R. K. A ratchet-like inter-subunit reorganization of the ribosome during translocation. Nature. 406 (6793), 318-322 (2000).
- Moazed, D., Noller, H. F. Intermediate states in the movement of transfer RNA in the ribosome. Nature. 342 (6246), 142-148 (1989).
- Schmeing, T., et al. The crystal structure of the ribosome bound to EF-Tu and aminoacyl-tRNA. Science. 326 (5953), 688-694 (2009).
- Valle, M., et al. Locking and unlocking of ribosomal motions. Cell. 114 (1), 123-134 (2003).
- Gromadski, K. B., Rodnina, M. V. Kinetic determinants of high-fidelity tRNA discrimination on the ribosome. Molecular Cell. 13 (2), 191-200 (2004).
- Blanchard, S., et al. tRNA dynamics on the ribosome during translation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (35), 12893-12898 (2004).
- Blanchard, S., et al. tRNA selection and kinetic proofreading in translation. Nature Structural and Molecular Biology. 11 (10), 1008-1014 (2004).
- Wang, Y., et al. Single-molecule structural dynamics of ef-g-ribosome interaction during translocation. Biochemistry. 46 (38), 10767-10775 (2007).
- Cornish, P., et al. Following the movement of the L1 stalk between three functional states in single ribosomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (8), 2571-2576 (2009).
- Cornish, P., et al. Spontaneous intersubunit rotation in single ribosomes. Molecular Cell. 30 (5), 578-588 (2008).
- Chen, J., et al. Coordinated conformational and compositional dynamics drive ribosome translocation. Nature Structural and Molecular Biology. 20 (6), 718-727 (2013).
- Feng, X. A., Poyton, M. F., Ha, T. Multicolor single-molecule FRET for DNA and RNA processes. Current Opinion in Structural Biology. 70, 26-33 (2021).
- Ly, C. T., Altuntop, M. E., Wang, Y. Single-molecule study of viomycin’s inhibition mechanism on ribosome translocation. Biochemistry. 49 (45), 9732-9738 (2010).
- Altuntop, M. E., Ly, C. T., Wang, Y. Single-molecule study of ribosome hierarchic dynamics at the peptidyl transferase center. Biophysical Journal. 99 (9), 3002-3009 (2010).
- Wang, Y., Xiao, M., Li, Y. Heterogeneity of single molecule FRET signals reveals multiple active ribosome subpopulations. Proteins. 82 (1), 1-9 (2014).
- Xiao, M., Wang, Y. L27-tRNA interaction revealed by mutagenesis and pH titration. Biophysical Chemistry. 167, 8-15 (2012).
- Wang, Y., Xiao, M. Role of the ribosomal protein L27 revealed by single-molecule FRET study. Protein Science. 21 (11), 1696-1704 (2012).
- Lin, R., Wang, Y. Automated smFRET microscope for the quantification of label-free DNA oligos. Biomedical Optics Express. 10 (2), 682-693 (2019).
- Moazed, D., et al. Interconversion of active and inactive 30 S ribosomal subunits is accompanied by a conformational change in the decoding region of 16 S rRNA. Journal of Molecular Biology. 191 (3), 483-493 (1986).
- Wower, I. K., Wower, J., Zimmermann, R. A. Ribosomal protein L27 participates in both 50 S subunit assembly and the peptidyl transferase reaction. Journal of Biological Chemistry. 273 (31), 19847-19852 (1998).
- Pan, D., Qin, H., Cooperman, B. S. Synthesis and functional activity of tRNAs labeled with fluorescent hydrazides in the D-loop. RNA. 15 (2), 346-354 (2009).
- Yang, H., Xiao, M., Wang, Y. A novel data-driven algorithm to reveal and track the ribosome heterogeneity in single molecule studies. Biophysical Chemistry. 199, 39-45 (2015).
- Metskas, L. A., Rhoades, E. Single-molecule FRET of intrinsically disordered proteins. Annual Review of Physical Chemistry. 71, 391-414 (2020).
- Hellenkamp, B., et al. Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements-a multi-laboratory benchmark study. Nature Methods. 15 (9), 669-676 (2018).
- Tsai, T., et al. High-Efficiency “-1” and “-2” Ribosomal Frameshiftings Revealed by Force Spectroscopy. ACS Chemical Biology. 12 (6), 1629-1635 (2017).
- Yin, H., Xu, S., Wang, Y. Dual DNA rulers to study the mechanism of ribosome translocation with single-nucleotide resolution. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (149), e59918 (2019).
- Desai, V., et al. Co-temporal force and fluorescence measurements reveal a ribosomal gear shift mechanism of translation regulation by structured mRNAs. Molecular Cell. 75 (5), 1007-1019 (2019).
