جزيء واحد فلورسينس دراسة نقل الطاقة من تخليق البروتين ريبوسوم
Summary
نقل الطاقة الفلوري جزيء واحد هو الأسلوب الذي يتتبع ديناميات الحمض النووي الريبي أثناء تخليق البروتين ريبوسومات. من خلال تتبع الريبوسومات الفردية ، يتم تحديد السكان غير المتجانسين ، مما يلقي الضوء على الآليات. ويمكن استخدام هذه الطريقة لتتبع التغيرات البيولوجية تشكيلية بشكل عام للكشف عن العلاقات الحيوية وظيفة في العديد من النظم الحيوية المعقدة الأخرى. يمكن لطرق جزيء واحد مراقبة الخطوات المقيدة غير المعدلة والمتوسطات الرئيسية منخفضة السكان ، والتي لا يمكن الوصول إليها عن طريق طرق الفرقة التقليدية بسبب متوسط التأثير.
Abstract
الريبوسوم هو مجمع ريبونوكليوبروتين كبير يجمع البروتينات بشكل عملي على طول قوالب الحمض النووي الريبي. قطر الريبوسوم هو ما يقرب من 20 نانومتر لاستيعاب ركائز الحمض النووي الريبي كبيرة في A-, P- و E-المواقع. وبالتالي، فإن ديناميات الريبوسوم هي بطبيعة الحال دي التدريجي بسرعة. يمكن لطريقة جزيء واحد الكشف عن كل ريبوسوم بشكل منفصل وتمييز المجموعات السكانية غير الذاتية ، وهو أمر ضروري للكشف عن الآليات المعقدة للأنظمة متعددة المكونات. نحن تقرير تفاصيل طريقة smFRET على أساس المجهر نيكون Ti2 مقلوب للتحقيق في ديناميات ريبوسوم بين البروتين الريبوسوم L27 وTRNAs. وصفت L27 في موقفها الفريد Cys 53 وإعادة تشكيلها في ريبوسوم التي تم تصميمها لعدم وجود L27. وتوصف TRNA في منطقة الكوع. كما ينتقل tRNA إلى مواقع مختلفة داخل ريبوسوم خلال دورة الاستطالة، مثل ما قبل وبعد النقل، والكفاءة FRET وديناميات تظهر الاختلافات، والتي اقترحت عدد السكان الفرعي متعددة. هذه الخلايا الفرعية غير قابلة للكشف عن طريق أساليب الفرقة. تم بناء مجهر SMFRET القائم على TIRF على مجهر مقلوب يدوي أو آلي ، مع إضاءة ليزر منزلية الصنع. يتم تنقية عينات الريبوسوم عن طريق الطرد المركزي الفائق ، وتحميلها في خلية عينة متعددة القنوات منزلية الصنع ثم تضيء عبر حقل ليزر مبشر. يمكن استخدام بقعة الليزر انعكاس لتحقيق التحكم في ردود الفعل من التركيز المثالي. يتم فصل إشارات الفلورسينس بواسطة برج فلتر مزود بمحرك ويتم جمعها بواسطة كاميرتين رقميتين من CMOS. يتم استرداد الكثافات عبر برنامج NIS-Elements.
Introduction
الريبوسوم هو ø 20 نانومتر مجمع ريبونوكليوبروتين كبير من وحدة فرعية كبيرة (50S) وصغيرة (30S). فإنه يجمع الببتيدات طويلة على طول قالب مرنا بشكل عملي وتعاوني. يرتبط ريبوسوم 30S إلى fMet-tRNAfMet و mRNA لبدء تخليق البروتين ، ثم ينضم 50S لتشكيل مجمع بدء 70S. الأحماض الأمينية جلب الحمض النووي الريبي إلى ريبوسوم في موقع A (أمينواسيل- TRNA موقع ملزم), في حين يتم عقد سلسلة بيبتيديل ممدود في موقع P (peptidyl- tRNA موقع ملزم). في مجمع ما قبل النقل ، يتم نقل سلسلة بيبتيديل إلى الحمض النووي الريبي في الموقع A مع إضافة حمض أميني واحد. وفي الوقت نفسه، فإن موقع P TRNA هو deacylated. ثم تنتقل ال A-، P-tRNAs إلى مواقع P-، E- لتشكيل مجمع ما بعد النقل، حيث يمثل الموقع الإلكتروني موقع خروج الحمض النووي الريبي. في هذه الحالة، ينتقل peptidyl-tRNA مرة أخرى إلى موقع P. تستمر دورة الاستطالة بين ما قبل وبعد الامتثال في حين أن الريبوسوم translocates على مرنا، codon واحد في وقتواحد 1. ريبوسوم هو تنسيقية للغاية من مواقع وظيفية مختلفة لجعل هذه العملية فعالة ودقيقة، مثل بين وحدة فرعية ratcheting2، tRNA تقلبات التهجين3،GTPase التنشيط4،L1 ساق فتح إغلاق5،الخ. وبالتالي، ريبوسومات بسرعة دي المرحلة لأن كل جزيء يتحرك في وتيرتها الخاصة. يمكن للأساليب التقليدية أن تستنتج فقط متوسط المعلمات الواضحة ، ولكن سيتم إخفاء الأنواع منخفضة السكان أو قصيرة الأجل في متوسط التأثير6. يمكن أن تؤدي طريقة جزيء واحد إلى كسر هذا القيد عن طريق الكشف عن كل ريبوسوم على حدة ، ثم تحديد أنواع مختلفة عن طريق إعادة الإعمارالإحصائية 7. وقد تم تنفيذ مواقع وضع العلامات المختلفة للتحقيق ديناميات ريبوسوم، مثل التفاعلات بين tRNA-tRNA8،EF-G-L119،L1-tRNA10،الخ. بالإضافة إلى ذلك ، من خلال وضع العلامات على الوحدات الفرعية الكبيرة والصغيرة ، على التوالي ، لوحظت الحركيات التسعيدية بين الوحدات والتنسيق مع العوامل11،12. وفي الوقت نفسه، فإن أسلوب smFRET له تطبيقات واسعة في العمليات البيولوجية المركزية الأخرى، وأساليب FRET متعددة الألوان آخذة في الظهور13.
سابقا تم تطوير زوج فريت ريبوسوم رواية14,15. وقد أعرب عن البروتين الريبوسومي المؤتلف L27، وتنقيته، ووصفت، وأدرجت مرة أخرى في الريبوسوم. تفاعل هذا البروتين مع الحمض النووي الريبي على مسافة قريبة وساعد على استقرار الحمض النووي الريبي P-الموقع في مجمع ما بعد النقل. عندما انتقل TRNA من A- إلى P-الموقع، يتم تقصير المسافة بين هذا البروتين والجيش الملكي النيبالي، والتي يمكن تمييزها من قبل إشارة smFRET. وقد تم تحديد التجمعات السكانية الفرعية الريبوسوم متعددة باستخدام الأساليب الإحصائية و mutagenesis، وتبادل عفوية من هذه المجموعات السكانية في مجمع ما قبل ولكن ليس بعد نقل يوحي ريبوسوم هو أكثر مرونة قبل التحرك على مرنا، وأكثر صلابة خلال فك16،17،18. هذه الاختلافات ضرورية لوظيفة ريبوسوم. هنا ، يصف البروتوكول تفاصيل الريبوسوم / tRNA – وضع العلامات ، ودمجها في إعداد عينة ريبوسوم ، smFRET ، والحصول على البيانات / تحليل19.
Protocol
Representative Results
Discussion
SmFRET حساسة للإشارات الخلفية. أولا، فمن الضروري لمعطف غرفة عينة مع توين 0.05٪ ومن ثم تضاف بالتزامن مع الحل ريبوسوم لمنع ملزمة غير محددة من ريبوسوم إلى السطح. لرؤية الفلورسينس من انبعاث مقبول Cy5 ، يعد كوكتيل زبال الأكسجين (محلول ديوكسي والجلوكوز وترولوكس) ضروريا. بدون هذا الحل، التبييض سريع جدا …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويدعم هذا العمل المعاهد الوطنية للصحة في الولايات المتحدة (R01GM111452) ومؤسسة ويلش (E-1721).
Materials
| Aminosilane | Laysanbio | MPEG-SIL-5000 | |
| Biotin-PEG | Laysanbio | Biotin-PEG-SVA-5000 | |
| BL21(DE3)pLysS cells | Novagen | 71403 | |
| Catalase | millipore sigma | C3515 | |
| CS150FNX Micro Ultracentrifuge | nuaire | ||
| Cy3/C5-maleimide | ApexBio | A8138/A8140 | |
| ECLIPSE Ti2 inverted microscope | Nikon | ||
| EdgeGARD Laminar Flow Hood | Baker | ||
| Glucose oxidase | millipore sigma | G2133 | |
| Histrap HP column (Prepacked sepharose column) | Cytiva | 17524701 | |
| Microscope cover slip | VWR | 48393-230 | |
| Microscope glass slides | VWR | 470235-792 | |
| ORCA-Flash4.0 V3 camera | Hamamatsu | ||
| PEG (5,000) | Laysanbio | MPEG-SVA-5000 | |
| pET-21b (+) plasmid | Novagen | 69741 | |
| Sonicator | VWR | CPX-952-518R | |
| TCEP | Apexbio | B6055 | |
| Trolox | millipore sigma | 238813 |
References
- Ramakrishnan, V. What we have learned from ribosome structures. Biochemical Society Transactions. 36, 567-574 (2008).
- Frank, J., Agrawal, R. K. A ratchet-like inter-subunit reorganization of the ribosome during translocation. Nature. 406 (6793), 318-322 (2000).
- Moazed, D., Noller, H. F. Intermediate states in the movement of transfer RNA in the ribosome. Nature. 342 (6246), 142-148 (1989).
- Schmeing, T., et al. The crystal structure of the ribosome bound to EF-Tu and aminoacyl-tRNA. Science. 326 (5953), 688-694 (2009).
- Valle, M., et al. Locking and unlocking of ribosomal motions. Cell. 114 (1), 123-134 (2003).
- Gromadski, K. B., Rodnina, M. V. Kinetic determinants of high-fidelity tRNA discrimination on the ribosome. Molecular Cell. 13 (2), 191-200 (2004).
- Blanchard, S., et al. tRNA dynamics on the ribosome during translation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (35), 12893-12898 (2004).
- Blanchard, S., et al. tRNA selection and kinetic proofreading in translation. Nature Structural and Molecular Biology. 11 (10), 1008-1014 (2004).
- Wang, Y., et al. Single-molecule structural dynamics of ef-g-ribosome interaction during translocation. Biochemistry. 46 (38), 10767-10775 (2007).
- Cornish, P., et al. Following the movement of the L1 stalk between three functional states in single ribosomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (8), 2571-2576 (2009).
- Cornish, P., et al. Spontaneous intersubunit rotation in single ribosomes. Molecular Cell. 30 (5), 578-588 (2008).
- Chen, J., et al. Coordinated conformational and compositional dynamics drive ribosome translocation. Nature Structural and Molecular Biology. 20 (6), 718-727 (2013).
- Feng, X. A., Poyton, M. F., Ha, T. Multicolor single-molecule FRET for DNA and RNA processes. Current Opinion in Structural Biology. 70, 26-33 (2021).
- Ly, C. T., Altuntop, M. E., Wang, Y. Single-molecule study of viomycin’s inhibition mechanism on ribosome translocation. Biochemistry. 49 (45), 9732-9738 (2010).
- Altuntop, M. E., Ly, C. T., Wang, Y. Single-molecule study of ribosome hierarchic dynamics at the peptidyl transferase center. Biophysical Journal. 99 (9), 3002-3009 (2010).
- Wang, Y., Xiao, M., Li, Y. Heterogeneity of single molecule FRET signals reveals multiple active ribosome subpopulations. Proteins. 82 (1), 1-9 (2014).
- Xiao, M., Wang, Y. L27-tRNA interaction revealed by mutagenesis and pH titration. Biophysical Chemistry. 167, 8-15 (2012).
- Wang, Y., Xiao, M. Role of the ribosomal protein L27 revealed by single-molecule FRET study. Protein Science. 21 (11), 1696-1704 (2012).
- Lin, R., Wang, Y. Automated smFRET microscope for the quantification of label-free DNA oligos. Biomedical Optics Express. 10 (2), 682-693 (2019).
- Moazed, D., et al. Interconversion of active and inactive 30 S ribosomal subunits is accompanied by a conformational change in the decoding region of 16 S rRNA. Journal of Molecular Biology. 191 (3), 483-493 (1986).
- Wower, I. K., Wower, J., Zimmermann, R. A. Ribosomal protein L27 participates in both 50 S subunit assembly and the peptidyl transferase reaction. Journal of Biological Chemistry. 273 (31), 19847-19852 (1998).
- Pan, D., Qin, H., Cooperman, B. S. Synthesis and functional activity of tRNAs labeled with fluorescent hydrazides in the D-loop. RNA. 15 (2), 346-354 (2009).
- Yang, H., Xiao, M., Wang, Y. A novel data-driven algorithm to reveal and track the ribosome heterogeneity in single molecule studies. Biophysical Chemistry. 199, 39-45 (2015).
- Metskas, L. A., Rhoades, E. Single-molecule FRET of intrinsically disordered proteins. Annual Review of Physical Chemistry. 71, 391-414 (2020).
- Hellenkamp, B., et al. Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements-a multi-laboratory benchmark study. Nature Methods. 15 (9), 669-676 (2018).
- Tsai, T., et al. High-Efficiency “-1” and “-2” Ribosomal Frameshiftings Revealed by Force Spectroscopy. ACS Chemical Biology. 12 (6), 1629-1635 (2017).
- Yin, H., Xu, S., Wang, Y. Dual DNA rulers to study the mechanism of ribosome translocation with single-nucleotide resolution. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (149), e59918 (2019).
- Desai, V., et al. Co-temporal force and fluorescence measurements reveal a ribosomal gear shift mechanism of translation regulation by structured mRNAs. Molecular Cell. 75 (5), 1007-1019 (2019).
